Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

نود أن نعرب عن تقديرنا لسيلفيا مارشيه وكونستانزا لامبرتي (معهد علم الأعصاب "كارلو بيستا" ، مؤسسة IRCCS ، ميلانو) لإعداد وتوفير خلايا cybrid m.3243A>G المستخدمة كأمثلة توضيحية لهذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لأعضاء مجموعة علم الوراثة الميتوكوندريا (MRC-MBU ، جامعة كامبريدج) للمناقشة المفيدة خلال هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل أساسي من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC_UU_00015/4 و MC_UU_00028/3). P.A.N. و P.S.-P. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعمها من قبل مؤسسة Lily ومؤسسة Champ ، على التوالي.

تم تقديم الموافقة المستنيرة لاستخدام خلايا cybrid البشرية 3243A>G و m.5024C>T MEFs الخالدة المستخدمة في هذه الدراسة. لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة في هذه الحالة حيث لم يتم جمع خلايا المريض في جامعة كامبريدج. ومع ذلك ، قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. يوصى بشدة باتباع أفضل ال...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

ويتمثل أحد الجوانب الحاسمة لنجاح البروتوكول في تجنب التلوث، لا سيما عند استخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. يوصى باستخدام غطاء للأشعة فوق البنفسجية وأطراف ماصة مفلترة عند تحضير العينات حيثما أمكن ذلك ، وكذلك للحفاظ على مناطق التضخيم المسبق وما بعد التضخيم منفصلة. يجب دائما تضمين الق?...

يوجد جينوم الميتوكوندريا في شكل جزيئات دائرية صغيرة (16.5 كيلو بايت) (mtDNA) موجودة في الجزء الأعمق من الميتوكوندريا المسماة المصفوفة وتشفر 13 وحدة فرعية من السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، بالإضافة إلى tRNAs و rRNAs اللازمة لترجمتها في الموقع بواسطة ريبوسوم الميتوكوندريا1. يمثل هذا الجينوم حوالي 1٪ من جميع البروتينات اللازمة لوظيفة الميتوكوندريا ، والباقي مشفر بواسطة الحمض النووي النووي (nDNA). من المفترض عموما أن الميتوكوندريا مشتقة من حدث اندماج تكافلي داخلي بين سلف ألفا بروتيني وخلية حقيقية النواة سلف. بمجرد حدوث هذا التعايش الافتراضي ، تم نقل المعلومات الوراثية للميتوكوندريا تدريجيا إلى النواة على مدار الدهور ، وهو ما يفسر الاكتناز المذكور أعلاه ل mtDNA عند مقارنته بجينومات البكتيريا الزرقاءالحديثة 2. يتضح هذا النقل للجينات بقوة من خلال وجود امتدادات طويلة من الحمض النووي النووي (nDNA) متماثلة للغاية مع التسلسلات الموجودة في mtDNA. تعد تسلسلات الميتوكوندريا النووية (NUMTs) مصدرا شائعا لسوء التفسير أثناء التنميط الجيني ، ويجب اتخاذ بعض الاحتياطات لتجنب التحيزات النووية عند التنميط الجيني mtDNA3 (الشكل 1 أ).
ميزة أخرى مميزة ل mtDNA هي أن رقم نسخته يختلف باختلاف نوع الخلية ، حيث يتراوح من عشرات إلى آلاف النسخ لكل خلية4. نظرا لهذه الطبيعة متعددة النسخ ، يمكن أن يؤوي mtDNA مجموعة واسعة من الأنماط الجينية داخل خلية واحدة ، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر استمرارية للأليلات على عكس الأليلات المنفصلة المرتبطة بالجينات النووية عند النظر في زيجوت الكروموسومات. يشار إلى عدم تجانس أليلات الميتوكوندريا باسم رأب الميتوكوندريا ، والذي يتم التعبير عنه عادة في النسبة المئوية لانتشار طفرة معينة كنسبة من إجمالي mtDNA في خلية معينة. يمكن أن يتناقض التغاير مع التماثل ، والذي يشير إلى نوع فريد من mtDNA موجود عبر الخلية.
يعد قياس رأب الميتوكوندريا غير المتجانس ذا أهمية خاصة عند تحديد نسبة جزيئات mtDNA التي تؤوي المتغيرات المسببة للأمراض. تأتي هذه المتغيرات في شكل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، أو indels الصغيرة ، أو عمليات الحذف واسعة النطاق5. معظم البشر غير متجانسين للمتغيرات المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإنها لا تظهر أي أنماط ظاهرية سريرية ، والتي غالبا ما تظهر فقط عند مستويات أعلى من التغاير من mtDNA الممرض في ظاهرة يشار إليها باسم تأثير العتبة6. في حين أن القيم المرتبطة بالإمراضية تعتمد بشكل كبير على طبيعة الطفرة المسببة للأمراض والأنسجة التي تحدث فيها ، فإنها عادة ما تكون أعلى من 60٪ من البلازما غير المتجانسة7.
هناك العديد من مجالات البحث التي يكون فيها التنميط الجيني للميتوكوندريا شائعا. في المجال الطبي ، يمكن أن يكون اختبار طفرات mtDNA أو قياسها كميا بمثابة معيار تشخيصي لأمراض الميتوكوندريا ، والتي يحتوي الكثير منها على انحرافات mtDNA كأصللها 5. بالإضافة إلى دراسة الطفرات المسببة للأمراض البشرية ، من المرجح أن يزداد انتشار النماذج الحيوانية التي تؤوي SNPs المسببة للأمراض في mtDNA ، نظرا للظهور الأخير لتحرير قاعدة الميتوكوندريا الذي تم تمكينه بواسطة محرري قاعدة السيتوزين المشتقة من DddA (DdCBEs) المستهدفة بالميتوكوندريا 8 و deaminases المستندة إلى TALE (TALEDs) لتحرير قاعدة الأدينين9. سيكون هذا النهج مفيدا في فهم التفاعل بين الأنماط الجينية الشاذة للميتوكوندريا والاختلالات الناتجة عنها. هناك أيضا بحث علمي مستمر في إعادة تشكيل جينوم الميتوكوندريا للاستخدام النهائي كاستراتيجية علاجية في أمراض الميتوكوندريا البشرية من خلال نهج يعرف باسم تحول المغايرة. يتضمن هذا المجال من البحث في المقام الأول توجيه النيوكليازات الخاصة بالطفرة إلى مصفوفة الميتوكوندريا. ينتج عن هذا تدهور تفضيلي ل mtDNA الممرض ، مما يؤدي إلى عمليات إنقاذ في النمط الظاهري10،11،12،13. تتطلب أي تجارب تنطوي على إعادة تشكيل النمط الجيني للميتوكوندريا طريقة كمية قوية لتقييم تحولات التغاير الجنسي.
يتم استخدام مجموعة متنوعة من الطرق للنمط الجيني mtDNA ، وهذه تختلف وفقا لطبيعة الطفرة. تعد طرق تسلسل الجيل التالي (NGS) أكثر دقة عندما يتعلق الأمر بقياس SNPs في mtDNA ؛ ومع ذلك ، تظل هذه الطرق باهظة التكلفة بالنسبة للقياس الكمي الروتيني لرأب الميتوكوندريا ، خاصة إذا كان عدد العينات صغيرا. يمكن أن يسمح تسلسل سانجر أيضا باكتشاف SNPs ؛ ومع ذلك ، فإن هذا النهج ليس كميا وغالبا ما يفشل في اكتشاف مستويات منخفضة من التغاير أو يمكن أن يكون غير دقيق عند تقدير البلازما الغيرية العالية. يقترح Pyrosequencing ، كاختبار يتضمن الحد الأدنى من التحضير ويتيح القياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة لأي عينة mtDNA ، كحل وسط مناسب بين هذين النقيضين. تم استخدام هذه الطريقة بشكل روتيني لتحديد كمية SNPs الميتوكوندريا من قبل العديد من الباحثين في سياقات مختلفة ، بما في ذلك تحليل الطب الشرعي 14،15 ، والتشخيص السريري 16 ، أو التنميط الجيني ل mtDNA من الخلايا المفردة17.
يتضمن هذا الفحص أول خطوة تضخيم مسبق لتفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة تحيط ب SNP في mtDNA ، والتي يتبعها مقايسة التسلسل عن طريق التوليف باستخدام خيط واحد من amplicon الذي تم إنشاؤه مسبقا. يجب أن يكون أحد البادئين المستخدمين في خطوة التضخيم المسبق هو البيوتينيل في الطرف 5 '، مما سيمكن جهاز pyrosequencing من عزل الشريط المفرد من الحمض النووي لاستخدامه كقالب لتفاعل التسلسل. ثم يتم تلدين التمهيدي التسلسل الثالث على الشريط البيوتينيل المحتفظ به ، والذي يسمح بتخليق الحمض النووي الناشئ كنيوكليوتيدات منقوص الأكسجين ليتم صرفها بترتيب محدد مسبقا في غرفة التفاعل. يسجل جهاز التسلسل الحراري كمية كل قاعدة مدمجة بناء على قراءات مضيئة ، مما يسمح بالتحديد الكمي النسبي لأليلات الميتوكوندريا الطافرة والبرية عند تخليق الحمض النووي (الشكل 1 ب). يتم إنشاء التلألؤ بواسطة إنزيم لوسيفيراز ، الذي ينبعث منه الضوء في وجود ATP الذي يصنعه ATP sulfurylase de novo في كل حدث دمج من البيروفوسفات المنبعث من كل نيوكليوتيد. يمكن تلخيص هذين التفاعلين على النحو التالي:
1. PPi (من دمج النوكليوتيدات) + APS → ATP + كبريتات (ATP sulfurylase)
2. ATP + لوسيفيرين + O 2 → أمبير + PPi + أوكسي لوسيفيرين + CO2 + ضوء (لوسيفيراز)
يمثل اكتشاف قواعد الأدينين بواسطة التسلسل الحراري دون تفاعل ATP المتقاطع مع اللوسيفيراز في التفاعل الثاني تحديا. ومع ذلك ، يتم حل هذا باستخدام نظير الأدينين لتخليق الحمض النووي ، وهو dATPαS. على الرغم من عدم كونه ركيزة مثالية للوسيفيراز ، إلا أنه ينتج تلألؤا أقوى مقارنة بالنيوكليوتيدات الثلاثة الأخرى ، والتي يتم ضبطها رقميا بواسطة جهاز التسلسل الحراري وضبطها على عامل 0.9. بسبب هذا التباين المتأصل ، يقترح تجنب تسلسل الأدينين في موضع SNP (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
يفصل البروتوكول التالي طريقة تقييم mtDNA heteroplasmy عن طريق pyrosequencing ويحدد الاحتياطات اللازمة في تصميم بادئات التضخيم لتجنب التحيز البيولوجي أو التقني عند التنميط الجيني SNPs في mtDNA. يتضمن الأخير المسح الرقمي واختيار مجموعات التمهيدي ، وتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل المسبق ، وأخيرا تسلسل الفحص وتحسينه. تم عرض مثالين تطبيقيين على المقايسات: أولا ، تحسين المتغير الممرض البشري الأكثر شيوعا m.3243A >G 18 ، والثاني ، التنميط الجيني لخلايا الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) التي خضعت لتحويل التغاير باستخدام التقنيات المطورة في مختبر Minczuk في كامبريدج 10،11،12،19،20،21،22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

ارتبطت الطفرات في جينوم الميتوكوندريا (mtDNA) بالأمراض الوراثية الموروثة من الأم. ومع ذلك ، فقد زاد الاهتمام بتعدد أشكال mtDNA في السنوات الأخيرة بسبب القدرة التي تم تطويرها مؤخرا على إنتاج نماذج عن طريق طفرات mtDNA وتقدير جديد للارتباط بين الانحرافات الجينية للميتوكوندريا والأمراض الشائعة المرتبطة بالعمر مثل السرطان والسكري والخرف. Pyrosequencing هي تقنية التسلسل عن طريق التوليف التي تستخدم على نطاق واسع عبر مجال الميتوكوندريا لتجارب التنميط الجيني الروتينية. إن قدرتها على تحمل التكاليف النسبية عند مقارنتها بطرق التسلسل المتوازي الضخمة وسهولة التنفيذ تجعلها تقنية لا تقدر بثمن في مجال علم الوراثة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالقياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة مع زيادة المرونة. على الرغم من التطبيق العملي لهذه الطريقة ، فإن تنفيذها كوسيلة للتنميط الجيني mtDNA يتطلب ملاحظة بعض الإرشادات ، على وجه التحديد لتجنب بعض التحيزات ذات الأصل البيولوجي أو التقني. يحدد هذا البروتوكول الخطوات والاحتياطات اللازمة في تصميم وتنفيذ مقايسات البيروسكونيكز لاستخدامها في سياق قياس التغاير الجنسي.

يقدم هذا القسم مثالا على تحسين مقايسة pyrosequencing لطفرة mtDNA المسببة للأمراض البشرية ، بالإضافة إلى بيانات التسلسل من التنميط الجيني للخلايا الليفية الجنينية للفأر غير المتجانسة (m.5024C >T) (MEFs) المعالجة بنوكلياز إصبع الزنك الميتوكوندريا (mtZFNs). يوضح تحسين الفحص للخلايا البشرية ومقارنة مقايستين مخ...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

تمكن مقايسات Pyrosequencing من التنميط الجيني القوي والسريع لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة للحمض النووي للميتوكوندريا في الخلايا أو الأنسجة غير المتجانسة.

التنميط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في جينوم الميتوكوندريا عن طريق البيروسي

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing هو تسلسل بواسطة تقنية التوليف التي يمكن استخدامها للنمط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في الحمض النووي للميتوكوندريا. هذه الطريقة مفيدة في سهولة التنفيذ والفعالية من حيث التكلفة عند مقارنتها بطرق التسلسل الأخرى. يمكن استخدامه بسهولة كطريقة تشخيصية لبعض أمراض الميتوكوندريا عن طريق تحديد قيم المغايرة للمتغيرات المسببة للأمراض في الحمض النووي للميتوكوندريا.للبدء ، احصل على ملف تسلسل الحمض النووي للميتوكوندريا للأنواع التي يتم تصنيفها وراثيا وحدد موضع تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNP. تأكد من أن التسلسل المرجعي المستخدم يستخدم الترقيم الأساسي المناسب للطفرة المدروسة بحيث يمكن تحديد موضع SNP بسهولة. انسخ 1،000 زوج أساسي في المنبع والمصب لموقع SNP والصق التسلسل المقطوع في برنامج تصميم التمهيدي pyrosequencing.قم بتمييز القاعدة متعددة الأشكال ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوقها ، ثم حدد تعيين المنطقة المستهدفة لتعيين قاعدة SNP التي تم تحليلها كهدف لمقايسة pyrosequencing. اضغط على أيقونة التشغيل في الزاوية اليمنى العليا من الواجهة لبدء اختيار التمهيدي ، وانتظر حتى يقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء ثلاثيات التمهيدي ، واثنين من البادئات للتضخيم المسبق للقالب DNA ، والتمهيدي الثالث للتسلسل بواسطة التوليف في آلة pyrosequencing. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد نسخ كافة مجموعات التمهيدي للاحتفاظ بجميع مجموعات التمهيدي.افتح برنامج التشغيل المزود مع جهاز التسلسل الحراري، وحدد فحص جديد، ثم حدد قالب مقايسة القياس الكمي للأليت. أدخل التسلسل المراد تحليله في المربع المقابل عن طريق كتابة النيوكليوتيدات مباشرة في اتجاه مجرى التسلسل التمهيدي. بالنسبة للموضع المتغير ، أشر إلى القاعدتين المحتملتين ، مفصولتين بشرطة مائلة.اضغط على إنشاء أمر الاستغناء ، ودع البرنامج يحدد تلقائيا ترتيبا مناسبا للنيوكليوتيدات التي سيتم الاستغناء عنها في التسلسل عن طريق تفاعل التوليف. حفظ ، وتقديم اسم للفحص. بعد ذلك ، قم بتنفيذ الجري عن طريق تخفيف الحمض النووي المراد تحليله إلى 5 نانوجرام لكل ميكرولتر.في الجولة الأولى ، تأكد من تضمين عينات من التغاير المعروف كمرجع وعينات من النوع البري. ثم قم بإجراء تسلسل PCR من 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف وتفاعلات 25 ميكرولتر ، باستخدام بادئات التضخيم والمعلمات. لتشغيل إعداد الملف، حدد تشغيل جديد في برنامج التسلسل الحراري.يمكن لجهاز التسلسل الحراري تسلسل 48 تفاعلا مسبقا منفصلا في وقت واحد مع مربع فارغ يمثل بئر تسلسل واحد على قرص pyrosequencing. قم بتحميل المقايسات بالنقر بزر الماوس الأيمن على مربع وتحديد تحميل الفحص. إذا لزم الأمر ، قم بتسلسل ما يصل إلى أربعة مقايسات منفصلة مع بادئات تسلسل مختلفة.اضبط وضع توزيع التمهيدي على تلقائي لتعيين غرفة حقن تلقائيا لكل برايمر تسلسل يستخدم للتشغيل. اضبط وضع التشغيل على قياسي ، ما لم يتم تشغيل أربعة أنواع مختلفة من المقايسات على قرص تسلسل واحد. تأكد من أن عدد المقايسات في ملف قالب التشغيل يطابق عدد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يتم تضخيمها.ثم احفظ ملفات التشغيل على محرك أقراص USB. لتجهيز جهاز التسلسل الحراري ، اضغط على زر التنظيف على شاشة اللمس الرئيسية للجهاز وقم بتنظيف جميع الحاقنات بماء عالي النقاء ، باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. عند إدخال شريط الامتصاص في الماكينة ، تأكد من التقاء الأطراف في وضع الساعة 9.بعد توصيل محرك أقراص USB ، اضغط على الزر Sequence لتحميل ملفات التشغيل المعدة مسبقا. اتبع التعليمات الموجودة على الجهاز لتحميل الكواشف وتجهيزها ، كما هو مطلوب ، في الحاقنات المقابلة على الجهاز. قم بتحميل 3 ميكرولتر من الخرز في الآبار ، ثم قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR ليتم تسلسلها في العينة المقابلة.ماصة لأعلى ولأسفل لخلط العينة مع الخرز المغناطيسي. ابحث عن الإشارة في جهاز التسلسل الحراري المعد إلى أنه يمكن تحميل القرص في الجهاز. قم بفك صامولة تثبيت اللوحة ، وقم بمحاذاة لوحة العينة المحملة مع الدبوس المعدني في حجرة القرص.بمجرد تثبيت اللوحة بإحكام في حجرة اللوحة ، قم بتشغيل تشغيل التسلسل بالضغط على زر البدء في واجهة الشاشة التي تعمل باللمس. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة محرك أقراص USB من الجهاز ، وقم بتوصيله مرة أخرى بالكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج pyrosequencer. بعد ظهور ملف التشغيل الذي تم إنشاؤه حديثا على محرك أقراص USB ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف Run Result.يحلل هذا تلقائيا ناتج لوسيفيراز لكل بئر عند دمج النوكليوتيدات ، ويحدد أليل الميتوكوندريا محل الاهتمام. ابحث عن درجات الألوان التي يعرضها البرنامج بناء على جودة القراءات. لحفظ النتائج ، حدد التقارير في النافذة العلوية ، متبوعة بالتقرير الكامل لإنشاء ملف PDF يحتوي على البيروجرامات والنتائج من كل بئر من التشغيل.بدلا من ذلك، يمكنك تنزيل النتائج بتنسيقات أخرى ضمن علامة التبويب التقارير. الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات التضخيم من كلتا المجموعتين المختارتين لطفرة m. 3243A>G كما هو موضح في هذا الشكل.هنا ، يشير Het إلى عينة m. 3243A>G المتجانسة تقريبا المراد تحليلها. تظهر مقارنة بين أداء كلتا المجموعتين التمهيديتين باستخدام المعايير المولية للمعايرة في هذا الشكل.يتم الإشارة إلى القيم المقاسة بالخطوط الرأسية المنقطة. يتم عرض دالة خطية X = Y لتوضيح مدى قرب كل من المقايستين المختبرتين من القياس المثالي. أسماء خطوط الخلايا على المحور X هي أسماء الحيوانات المستنسخة السايبريدية المختلفة التي تم تصنيفها وراثيا باستخدام هذا الفحص.نتائج التنميط الجيني على أربعة مستنسخات سايبريد غير معروفة m. 3243A>G heteroplasmy باستخدام كلا المقايسات موضحة هنا. تم إجراء التسلسل في ثلاث نسخ تقنية.نتائج التنميط الجيني للخلايا المعالجة بنوكلياز إصبع الزنك الميتوكوندريا ، جنبا إلى جنب مع الضوابط غير المعالجة والمعالجة الوهمية ، والبيروجرامات من اثنين من عينات خلايا MEF PCR المستخدمة لتوليد النتائج بالإضافة إلى التحكم في التنميط الجيني من النوع البري موضحة هنا. يمكن استخدام Pyrosequencing كقراءة لتجارب العلاج الجيني لتقييم تقنيات العلاج الجيني المختلفة في الحمض النووي للميتوكوندريا.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

استخدام الخلايا الليفية الإنسان الأساسية لرصد نمط ظاهري الميتوكوندريا في مجال مرض باركنسون

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

تحديد<em&gt; الجمال النائم</em&gt; الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

جمع واستخراج الحمض النووي من اللعاب لتسلسل الجيل القادم

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

مرحلة واحدة الديناميكي الإنعاش للابتسامة في الوجه لا رجعة فيه الشلل التي كتبها مجاني نقل العضلات الوظيفي

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

روز البنغال Photothrombosis بواسطة التصوير الضوئي متحد البؤر<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج لسفينة واحدة السكتة الدماغية

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

الفوسفور 31 الرنين المغناطيسي الطيفي: أداة لقياس<em&gt; في فيفو</em&gt; القدرة الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية في العضلات الهيكلية البشرية

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

المعادن التصوير في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

نموذج ألم هشاشة العظام الناجم عن الحقن داخل المفصل من أحادي يودواسيتات في الفئران

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

إصابة الجهاز الإقصاب الإقفاري-Reperfusion عن طريق محاكاة التغيرات الديناميكية الدموية في نموذج زراعة كبد الفئران

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...