Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Vi vil gerne takke Silvia Marchet og Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) for at forberede og levere m.3243A>G cybridceller, der anvendes som illustrative eksempler for denne protokol. Vi vil også gerne takke medlemmerne af Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) for nyttig diskussion i løbet af denne forskning. Dette arbejde blev støttet af kernefinansiering fra Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 og MC_UU_00028/3). P.A.N. og PS-P. er desuden støttet af henholdsvis The Lily Foundation og The Champ Foundation.

Der blev givet informeret samtykke til brug af de humane 3243A>G cybridceller og de udødeliggjorte m.5024C>T MEF'er, der blev anvendt i dette studie. Etisk godkendelse var ikke påkrævet i dette tilfælde, da patientcellerne ikke blev indsamlet på University of Cambridge. Anvendelsen af humane fibroblaster kan dog kræve etisk godkendelse. Det anbefales stærkt at følge bedste praksis for PCR-opsætning, når prøve-DNA forberedes til pyrosekventering af prøven. Hyppig forstærkning ved hjælp af identiske primere k...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Et kritisk aspekt for protokollens succes er at undgå kontamineringer, især når der anvendes små mængder udgangsmateriale. Det anbefales at bruge en UV-hætte og filtrerede pipettespidser, når prøverne forberedes, hvor det er muligt, samt at holde områderne med forforstærkning og efterforstærkning adskilt. Blindprøver og prøver af kendt heteroplasmi (såsom vildtype-DNA) bør altid medtages for at blive brugt som benchmarks til kontrol af teknisk eller biologisk bias. 
En bemærkel...

Mitokondriegenomet findes i form af små (16,5 kb) cirkulære molekyler (mtDNA), der er til stede i mitokondriernes inderste rum ved navn matrixen og koder for 13 underenheder af mitokondrie-respirationskæden samt de tRNA'er og rRNA'er, der er nødvendige for deres oversættelse in situ af mitokondrieribosomet1. Dette genom repræsenterer ca. 1% af alle de proteiner, der er nødvendige for mitokondriefunktionen, hvoraf resten er kodet af det nukleare DNA (nDNA). Det antages almindeligvis, at mitokondrier stammer fra en endosymbiotisk fusionsbegivenhed mellem en alfa-proteobakteriel forfader og en forfædres eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiose fandt sted, blev mitokondriernes genetiske information gradvist overført til kernen over æoner, hvilket forklarer den førnævnte kompakthed af mtDNA sammenlignet med genomerne af moderne cyanobakterier2. En sådan overførsel af gener er stærkest bevist ved eksistensen af lange strækninger af nDNA, der er meget homologe med sekvenserne fundet i mtDNA. Disse nukleare mitokondriesekvenser (NUMT'er) er en almindelig kilde til fejlfortolkning under genotypning, og der skal træffes visse forholdsregler for at undgå nukleare forstyrrelser ved genotypning af mtDNA3 (figur 1A).
Et andet særpræg ved mtDNA er, at dets kopinummer varierer afhængigt af celletypen, der nummererer alt fra titusinder til tusinder af kopier pr.Celle 4. På grund af denne multikopi-natur kan mtDNA rumme en bred vifte af genotyper inden for en enkelt celle, hvilket kan resultere i en mere kontinuerlig fordeling af alleler i modsætning til de diskrete alleler forbundet med nukleare gener, når man overvejer kromosomernes zygositet. Denne heterogenitet af mitokondriealleler kaldes mitokondriel heteroplasmi, som typisk udtrykkes i procentprævalensen af en given mutation som en andel af det samlede mtDNA i en given celle. Heteroplasmi kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til en unik art af mtDNA, der er til stede på tværs af en celle.
Måling af mitokondriel heteroplasmi er af særlig interesse ved kvantificering af andelen af mtDNA-molekyler, der huser patogene varianter. Sådanne varianter kommer i form af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), små indels eller store deletioner5. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; De udviser imidlertid ingen kliniske fænotyper, som ofte kun manifesterer sig ved højere heteroplasmatiske niveauer af patogent mtDNA i et fænomen, der kaldes tærskeleffekten6. Mens værdierne forbundet med patogenicitet er stærkt afhængige af arten af den patogene mutation og vævet, hvori den forekommer, ligger de typisk over 60% heteroplasmi7.
Der er flere forskningsområder, hvor mitokondriel genotypebestemmelse er almindelig. På det medicinske område kan testning for eller kvantificering af mtDNA-mutationer tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesygdomme, hvoraf mange har mtDNA-aberrationer som deres oprindelse5. Ud over undersøgelsen af humane patogene mutationer vil forekomsten af dyremodeller, der huser patogene SNP'er i mtDNA'et, sandsynligvis stige i betragtning af den nylige fremkomst af mitokondriebaseredigering muliggjort af mitokondrielt målrettede DddA-afledte cytosinbaseeditorer (DdCBE'er)8 og TALE-baserede deaminaser (TALED'er) til adeninbaseredigering9. Denne tilgang vil være medvirkende til at forstå samspillet mellem afvigende mitokondriegenotyper og de deraf følgende dysfunktioner. Der er også igangværende videnskabelig forskning i ombygning af mitokondriegenomet til ultimativ anvendelse som en terapeutisk strategi i humane mitokondriesygdomme via en tilgang kendt som heteroplasmi shifting. Dette forskningsfelt involverer primært at dirigere mutationsspecifikke nukleaser til mitokondriematrixen; dette resulterer i den præferentielle nedbrydning af patogent mtDNA, hvilket fører til redning i fænotype10,11,12,13. Ethvert eksperiment, der involverer ombygning af mitokondriegenotypen, kræver en robust kvantitativ metode til vurdering af heteroplasmiskift.
En lang række metoder bruges til at genotype mtDNA, og disse varierer alt efter mutationens art. Næste generations sekventeringsmetoder (NGS) er mere præcise, når det kommer til kvantificering af SNP'er i mtDNA; Disse metoder forbliver imidlertid uoverkommeligt dyre til rutinemæssig kvantificering af mitokondriel heteroplasmi, især hvis antallet af prøver er lille. Sanger-sekventering kan også give mulighed for detektion af SNP'er; Denne tilgang er imidlertid ikke kvantitativ og undlader ofte at detektere lave niveauer af heteroplasmi eller kan være unøjagtig, når man estimerer høje heteroplasmier. Pyrosekventering som et assay, der involverer minimal forberedelse og muliggør hurtig kvantificering af heteroplasmi for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromis mellem disse to ekstremer. Denne metode er blevet brugt rutinemæssigt til at kvantificere mitokondrie SNP'er af adskillige forskere i forskellige sammenhænge, herunder retsmedicinsk analyse 14,15, klinisk diagnose16 eller genotypning af mtDNA fra enkeltceller17.
Dette assay involverer et første PCR-præamplifikationstrin i en region, der flankerer SNP i mtDNA'et, som efterfølges af et sekventerings-for-syntese-assay ved anvendelse af en streng af den tidligere genererede amplicon. En af de to primere, der anvendes i præamplifikationstrinnet, skal biotinyleres på 5'-enden, hvilket gør det muligt for pyrosekventering at isolere den enkelte DNA-streng, der skal bruges som skabelon for sekventeringsreaktionen. En tredje sekventeringsprimer udglødes derefter på den tilbageholdte biotinylerede streng, hvilket gør det muligt at dispensere spirende DNA-syntese som deoxynukleotider i en foruddefineret rækkefølge i reaktionskammeret. Pyrosequenceren registrerer mængden af hver base, der er inkorporeret, baseret på en selvlysende aflæsning, hvilket muliggør den relative kvantificering af mutante og vildtype-mitokondriealleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres af et luciferaseenzym, som udsender lys i nærvær af ATP, som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringsbegivenhed fra pyrophosphaterne frigivet af hvert nukleotid. Disse to reaktioner kan opsummeres som følger:
1. PPi (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP sulfurylase)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + lys (luciferase)
Det er en udfordring at detektere adeninbaser af pyrosequenceren uden ATP-krydsreaktion med luciferase i den anden reaktion. Dette løses imidlertid ved at anvende en adeninanalog til DNA-syntese, nemlig dATPαS. På trods af at det ikke er et perfekt substrat til luciferase, producerer det en stærkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotider, som justeres digitalt af pyrosequenceren og indstilles til en faktor på 0,9. På grund af denne iboende variabilitet foreslås det at undgå sekventering af adenin ved SNP-positionen (se diskussionen for yderligere detaljer).
Følgende protokol beskriver metoden til mtDNA-heteroplasmatisk vurdering ved pyrosekventering og skitserer de nødvendige forholdsregler ved design af amplifikationsprimere for at undgå biologisk eller teknisk bias ved genotypebestemmelse af SNP'er i mtDNA. Sidstnævnte involverer digital opmåling og udvælgelse af primersæt, optimering af forforstærknings-PCR og endelig sekventering og raffinering af analysen. To anvendte eksempelanalyser demonstreres: for det første optimering af den mest almindelige humane patogene variant m.3243A>G18 og for det andet genotypning af museembryonale fibroblastceller (MEF), der har gennemgået heteroplasmiskift ved hjælp af teknologier udviklet på Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutationer i mitokondriegenomet (mtDNA) har været forbundet med moderens arvelige genetiske sygdomme. Imidlertid er interessen for mtDNA-polymorfier steget i de senere år på grund af den nyligt udviklede evne til at producere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse af sammenhængen mellem mitokondrie genetiske aberrationer og almindelige aldersrelaterede sygdomme som kræft, diabetes og demens. Pyrosequencing er en sekventerings-for-syntese teknik, der er bredt anvendt på tværs af mitokondriefeltet til rutinemæssige genotypeforsøg. Dens relative overkommelighed sammenlignet med massive parallelle sekventeringsmetoder og nem implementering gør det til en uvurderlig teknik inden for mitokondriegenetik, hvilket giver mulighed for hurtig kvantificering af heteroplasmi med øget fleksibilitet. På trods af den praktiske anvendelse af denne metode kræver dens implementering som et middel til mtDNA-genotypning overholdelse af visse retningslinjer, specifikt for at undgå visse forstyrrelser af biologisk eller teknisk oprindelse. Denne protokol skitserer de nødvendige trin og forholdsregler ved design og implementering af pyrosekventering assays til brug i forbindelse med heteroplasmi måling.

Dette afsnit præsenterer et eksempel på optimering af et pyrosekventering assay for en human patogen mtDNA-mutation samt sekventeringsdata fra genotypning af heteroplasmatiske (m.5024C>T) museembryonale fibroblaster (MEF'er) behandlet med mitokondrie zinkfingernukleaser (mtZFN'er). Optimering af analysen for humane celler og sammenligning af to forskellige assays viser, hvordan man vælger den mest nøjagtige, mens genotypning af genetisk modificerede MEF-celler i det andet eksempel tjener som et anvendt eksempel på p...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pyrosekventering assays muliggør robust og hurtig genotypning af mitokondrie-DNA enkeltnukleotidpolymorfier i heteroplasmatiske celler eller væv.

Genotypning af enkeltnukleotidpolymorfier i mitokondriegenomet ved pyrosekventering

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing er en sekventering ved synteseteknik, som kan bruges til at genotype enkeltnukleotidpolymorfier i mitokondrie-DNA. Denne metode er fordelagtig i sin lette implementering og omkostningseffektivitet sammenlignet med andre sekventeringsmetoder. Det kan let bruges som en diagnostisk metode til visse mitokondriesygdomme ved at bestemme heteroplasmiværdier af patogene varianter i mitokondrie-DNA.Til at begynde med skal du få en mitokondriel DNA-sekvensfil for den art, der genotypes, og identificere positionen af den enkelte nukleotidpolymorfisme eller SNP. Sørg for, at den anvendte referencesekvens anvender den korrekte basisnummerering for den undersøgte mutation, således at SNP's position let kan identificeres. Kopier 1.000 basepar opstrøms og nedstrøms for SNP-stedet og indsæt den afkortede sekvens i pyrosequencing primer design software.Fremhæv den polymorfe base, højreklik på den, og vælg derefter Indstil målregion for at indstille den analyserede SNP-base som mål for pyrosekventering assay. Tryk på ikonet Afspil i øverste højre hjørne af grænsefladen for at starte primervalget, og vent på, at softwaren automatisk genererer primertrioerne, to primere til forforstærkning af skabelon-DNA'et og den tredje primer til sekventering ved syntesen i pyrosekventering maskine. Højreklik og vælg Kopier alle grundsæt for at bevare alle grundsæt.Åbn kørselssoftwaren, der følger med pyrosequenceren, vælg Nyt assay, og vælg derefter allelkvantificeringsanalyseskabelonen. Indtast sekvensen, der skal analyseres, i den tilsvarende boks ved at indtaste nukleotiderne direkte nedstrøms for sekventeringsprimeren. For den variable position skal du angive de to mulige baser, adskilt af en skråstreg.Tryk på Generer dispensationsordre, og lad softwaren automatisk bestemme en passende rækkefølge for nukleotiderne, der skal dispenseres i sekventeringen ved syntesereaktion. Gem, og angiv et navn til analysen. Udfør derefter kørslen ved at fortynde DNA'et, der skal analyseres til 5 nanogram pr. Mikroliter.I første omgang skal du sørge for at inkludere prøver af kendt heteroplasmi som reference- og vildtypeprøver. Udfør derefter en forudsekvenserende PCR på 5 mikroliter fortyndet DNA og 25 mikroliter reaktioner ved hjælp af amplifikationsprimere og parametre. For at køre filopsætningen skal du vælge Ny kørsel i pyrosequencer-softwaren.Pyrosequenceren kan samtidig sekvensere 48 separate forforstærkede reaktioner med en tom firkant, der repræsenterer en enkelt sekventeringsbrønd på en pyrosekventering disk. Indlæs analyserne ved at højreklikke på en firkant og vælge Indlæs analyse. Hvis det er nødvendigt, sekvenseres op til fire separate assays med forskellige sekventeringsprimere.Indstil primerens dispensationstilstand til automatisk for automatisk at tildele et injektionskammer for hver sekventeringsprimer, der bruges til kørslen. Indstil kørselstilstand til standard, medmindre du kører fire forskellige typer assays på en sekventeringsdisk. Sørg for, at antallet af assays på kørselsskabelonfilen svarer til antallet af PCR-reaktioner, der forstærkes.Gem derefter de kørende filer på et USB-drev. For at prime pyrosequenceren skal du trykke på rengøringsknappen på enhedens hovedberøringsskærm og rengøre alle injektorer med vand med høj renhed ved at følge instruktionerne på skærmen. Når du sætter absorberstrimlen i maskinen, skal du sikre dig, at enderne mødes i klokken 9-position.Når du har tilsluttet USB-nøglen, skal du trykke på knappen Sekvens for at indlæse de tidligere forberedte kørselsfiler. Følg instruktionerne på enheden for at indlæse og prime reagenserne efter behov i de tilsvarende injektorer på maskinen. Læg 3 mikroliter perler i brøndene, og læg derefter 10 mikroliter af hver PCR-reaktion, der skal sekventeres i den tilsvarende prøve.Pipette op og ned for at blande prøven med de magnetiske perler. Se efter indikationen i den grundede pyrosequencer om, at disken kan lægges i maskinen. Skru pladen, der holder møtrikken, af, og juster den ilagte prøveplade med metalstiften i skiverummet.Når pladen er skruet ordentligt ind i pladerummet, skal du starte sekventeringskørslen ved at trykke på startknappen på berøringsskærmens grænseflade. Når kørslen er fuldført, skal du fjerne USB-drevet fra maskinen og sætte det tilbage i computeren, der kører pyrosequencer-softwaren. Når den nyligt genererede kørselsfil vises på USB-drevet, skal du dobbeltklikke på filen Kør resultat.Dette analyserer automatisk luciferase-outputtet af hver brønd ved nukleotidinkorporering og kvantificerer mitokondrieallel af interesse. Se efter de farvescorer, der vises af softwaren baseret på kvaliteten af læsningerne. Hvis du vil gemme resultaterne, skal du vælge Rapporter i det øverste vindue efterfulgt af Fuld rapport for at generere en PDF-fil, der indeholder pyrogrammerne og resultaterne fra hvert hul i kørslen.Alternativt kan du downloade resultaterne i andre formater under fanen Rapporter. Agarosegelelektroforese af en PCR-amplifikation ved anvendelse af amplifikationsprimere fra begge sæt valgt til m. 3243A>G-mutationen som vist i denne figur.Her betegner Het den næsten homoplasmatiske m. 3243A>G-prøve, der skal analyseres. En sammenligning af ydeevnen for begge primersæt ved hjælp af molære standarder til kalibrering er vist i denne figur.De målte værdier betegnes med de lodrette stiplede linjer. En X = Y lineær funktion vises for at illustrere, hvor tæt hver af de to testede assays er på en ideel måling. Navnene på cellelinjerne på X-aksen er navnene på de forskellige cybridkloner, der blev genotypet ved hjælp af dette assay.Genotyperesultater på fire cybridkloner af ukendt m. 3243A>G heteroplasmi ved hjælp af begge assays er vist her. Sekventering blev udført i teknisk tredobbelt.Genotyperesultater af mitokondrie zinkfingernukleasebehandlede celler sammen med ubehandlede og mock-behandlede kontroller og pyrogrammer fra to MEF-celleprøve-PCR-replikater, der bruges til at generere resultaterne, samt vildtypegenotypekontrollen er vist her. Pyrosequencing kan bruges som udlæsning til genterapiforsøg til vurdering af forskellige genterapiteknologier i mitokondrie-DNA.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Anvendelsen af ​​primære humane fibroblaster til overvågning Mitochondriale fænotyper i Field af Parkinsons sygdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifikation af<em&gt; Tornerose</em&gt; Transposon Insertioner i solide tumorer med Linker-medieret PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Indsamling og brydning af spyt DNA til Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Et-trins Dynamic Reanimation af Smile i Irreversible Facial Lammelse af Free Funktionel Muscle Transfer

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis ved Konfokal Optical Imaging<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Imaging Metaller i hjernevæv fra Laser Ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Slidgigt smerte model induceret ved intraartikulær injektion af mono-iodoacetat hos rotter

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Organ Iskæmi-Reperfusion Skade ved at simulere hæmodynamiske ændringer i rottelevertransplantation Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...