Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

We willen Silvia Marchet en Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milaan) bedanken voor het voorbereiden en leveren van de m.3243A>G cybride cellen die als illustratieve voorbeelden voor dit protocol worden gebruikt. We willen ook de leden van de Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) bedanken voor nuttige discussie in de loop van dit onderzoek. Dit werk werd ondersteund door kernfinanciering van de Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 en MC_UU_00028/3). P.A.N. en P.S.-P. worden bovendien ondersteund door respectievelijk The Lily Foundation en The Champ Foundation.

Geïnformeerde toestemming werd gegeven voor het gebruik van de menselijke 3243A>G cybride cellen en de onsterfelijke m.5024C>T MEF's die in deze studie werden gebruikt. Ethische goedkeuring was in dit geval niet vereist, omdat de cellen van de patiënt niet werden verzameld aan de Universiteit van Cambridge. Het gebruik van menselijke fibroblasten kan echter ethische goedkeuring vereisen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de beste praktijken voor PCR-instellingen te volgen bij het voorbereiden van het monster-DNA voor...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Een cruciaal aspect voor het succes van het protocol is het vermijden van verontreinigingen, vooral bij het gebruik van lage hoeveelheden uitgangsmateriaal. Het wordt aanbevolen om waar mogelijk een UV-kap en gefilterde pipetpunten te gebruiken bij het voorbereiden van de monsters, en om de voorversterkings- en naversterkingsgebieden gescheiden te houden. Blancometingen en monsters van bekende heteroplasmie (zoals wild-type DNA) moeten altijd worden opgenomen om te worden gebruikt als benchmarks om te controleren op tech...

Het mitochondriale genoom bestaat in de vorm van kleine (16,5 kb) circulaire moleculen (mtDNA) aanwezig in het binnenste compartiment van de mitochondriën genaamd de matrix en codeert voor 13 subeenheden van de mitochondriale ademhalingsketen, evenals de tRNA's en rRNA's die nodig zijn voor hun vertaling in situ door het mitochondriale ribosoom1. Dit genoom vertegenwoordigt ongeveer 1% van alle eiwitten die nodig zijn voor de mitochondriale functie, waarvan de rest wordt gecodeerd door het nucleaire DNA (nDNA). Algemeen wordt aangenomen dat mitochondriën zijn afgeleid van een endosymbiotische fusiegebeurtenis tussen een alfa-proteobacteriële voorouder en een voorouderlijke eukaryote cel. Zodra deze hypothetische symbiose plaatsvond, werd de genetische informatie van de mitochondriën geleidelijk overgebracht naar de kern gedurende eonen, wat de bovengenoemde compactheid van het mtDNA verklaart in vergelijking met de genomen van moderne cyanobacteriën2. Een dergelijke overdracht van genen wordt het sterkst aangetoond door het bestaan van lange stukken nDNA die zeer homoloog zijn voor de sequenties in mtDNA. Deze nucleaire mitochondriale sequenties (NUT's) zijn een veel voorkomende bron van verkeerde interpretatie tijdens genotypering en bepaalde voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om nucleaire vooroordelen te voorkomen bij het genotyperen van mtDNA3 (figuur 1A).
Een ander onderscheidend kenmerk van mtDNA is dat het aantal kopieën varieert afhankelijk van het celtype, met een aantal van tienduizenden tot duizenden kopieën per cel4. Vanwege deze multi-copy aard kan mtDNA een breed scala aan genotypen binnen een enkele cel herbergen, wat kan resulteren in een meer continue verdeling van allelen in tegenstelling tot de discrete allelen geassocieerd met nucleaire genen bij het overwegen van de zygositeit van chromosomen. Deze heterogeniteit van mitochondriale allelen wordt mitochondriale heteroplasmie genoemd, die meestal wordt uitgedrukt in de procentuele prevalentie van een bepaalde mutatie als een percentage van het totale mtDNA in een bepaalde cel. Heteroplasmie kan worden vergeleken met homoplasmie, wat verwijst naar een unieke soort mtDNA die in een cel aanwezig is.
Het meten van mitochondriale heteroplasmie is van bijzonder belang bij het kwantificeren van het aandeel mtDNA-moleculen dat pathogene varianten herbergt. Dergelijke varianten komen voor in de vorm van single nucleotide polymorphisms (SNP's), kleine indebellen of grootschalige deleties5. De meeste mensen zijn heteroplasmatisch voor pathogene varianten; ze vertonen echter geen klinische fenotypen, die zich vaak alleen manifesteren bij hogere heteroplasmieniveaus van pathogeen mtDNA in een fenomeen dat het drempeleffect6 wordt genoemd. Hoewel de waarden geassocieerd met pathogeniciteit sterk afhankelijk zijn van de aard van de pathogene mutatie en het weefsel waarin deze optreedt, liggen ze meestal boven 60% heteroplasmie7.
Er zijn verschillende onderzoeksgebieden waarin mitochondriale genotypering veel voorkomt. Op medisch gebied kan het testen op of kwantificeren van mtDNA-mutaties dienen als een diagnostisch criterium voor mitochondriale ziekten, waarvan vele mtDNA-afwijkingen als oorsprong hebben5. Naast de studie van menselijke pathogene mutaties, zal de prevalentie van diermodellen met pathogene SNP's in het mtDNA waarschijnlijk toenemen, gezien de recente komst van mitochondriale basenbewerking mogelijk gemaakt door mitochondriaal gerichte DddA-afgeleide cytosine-base editors (DdCBEs)8 en TALE-gebaseerde deaminasen (TALEDs) voor adenine base editing9. Deze benadering zal een belangrijke rol spelen bij het begrijpen van de wisselwerking tussen afwijkende mitochondriale genotypen en de resulterende disfuncties. Er is ook lopend wetenschappelijk onderzoek naar het hermodelleren van het mitochondriale genoom voor ultiem gebruik als een therapeutische strategie bij menselijke mitochondriale ziekten via een benadering die bekend staat als heteroplasmieverschuiving. Dit onderzoeksgebied omvat voornamelijk het richten van mutatiespecifieke nucleasen op de mitochondriale matrix; dit resulteert in de preferentiële afbraak van pathogeen mtDNA, wat leidt tot reddingen in fenotype10,11,12,13. Alle experimenten met betrekking tot de remodellering van het mitochondriale genotype vereisen een robuuste kwantitatieve methode om heteroplasmieverschuivingen te beoordelen.
Een breed scala aan methoden wordt gebruikt om mtDNA te genotyperen, en deze variëren afhankelijk van de aard van de mutatie. Next-generation sequencing (NGS) methoden zijn nauwkeuriger als het gaat om het kwantificeren van SNP's in mtDNA; Deze methoden blijven echter onbetaalbaar voor de routinematige kwantificering van mitochondriale heteroplasmie, vooral als het aantal monsters klein is. Sanger-sequencing kan ook de detectie van SNP's mogelijk maken; Deze benadering is echter niet kwantitatief en slaagt er vaak niet in om lage niveaus van heteroplasmie te detecteren of kan onnauwkeurig zijn bij het schatten van hoge heteroplasmieën. Pyrosequencing, als een test die minimale voorbereiding vereist en de snelle kwantificering van heteroplasmie voor elk mtDNA-monster mogelijk maakt, wordt voorgesteld als een geschikt compromis tussen deze twee uitersten. Deze methode is routinematig gebruikt om mitochondriale SNP's te kwantificeren door tal van onderzoekers in verschillende contexten, waaronder forensische analyse 14,15, klinische diagnose16 of de genotypering van mtDNA uit afzonderlijke cellen17.
Deze test omvat een eerste PCR-preamplificatiestap van een gebied dat de SNP in het mtDNA flankeert, gevolgd door een sequencing-by-synthesis assay met behulp van één streng van het eerder gegenereerde amplicon. Een van de twee primers die in de voorversterkerstap worden gebruikt, moet aan het 5'-uiteinde worden gebiotinyleerd, waardoor het pyrosequencing-apparaat de enkele DNA-streng kan isoleren om als sjabloon voor de sequencingreactie te worden gebruikt. Een derde sequencing primer wordt vervolgens uitgegloeid op de vastgehouden gebiotinyleerde streng, waardoor ontluikende DNA-synthese als deoxynucleotiden in een vooraf gedefinieerde volgorde in de reactiekamer kan worden gedoseerd. De pyrosequencer registreert de hoeveelheid van elke opgenomen base op basis van een luminescerende uitlezing, waardoor de relatieve kwantificering van mutante en wild-type mitochondriale allelen bij DNA-synthese mogelijk is (figuur 1B). De luminescentie wordt gegenereerd door een luciferase-enzym, dat licht uitzendt in aanwezigheid van ATP dat een ATP-zwavelylase de novo synthetiseert bij elke incorporatiegebeurtenis van de pyrofosfaten die door elk nucleotide worden vrijgegeven. Deze twee reacties kunnen als volgt worden samengevat:
1. PPi (van nucleotide-incorporatie) + APS → ATP + sulfaat (ATP-zwavelylase)
2. ATP + luciferine + O 2 → AMP + PPi + oxyluciferine + CO2 + licht (luciferase)
Het detecteren van adeninebasen door de pyrosequencer zonder ATP-kruisreactie met de luciferase in de tweede reactie is een uitdaging. Dit wordt echter opgelost door een adenine-analoog te gebruiken voor DNA-synthese, namelijk dATPαS. Ondanks dat het geen perfect substraat is voor luciferase, produceert het een sterkere luminescentie in vergelijking met de drie andere nucleotiden, die digitaal wordt aangepast door de pyrosequencer en ingesteld op een factor 0,9. Vanwege deze inherente variabiliteit wordt voorgesteld om sequencing adenine op de SNP-positie te vermijden (zie de discussie voor meer informatie).
Het volgende protocol beschrijft de methode van mtDNA-heteroplasmiebeoordeling door pyrosequencing en schetst de nodige voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen van de amplificatieprimers om biologische of technische vertekening te voorkomen bij het genotyperen van SNP's in mtDNA. Dit laatste omvat het digitaal inmeten en selecteren van de primersets, het optimaliseren van de pcr voor voorversterking en ten slotte het sequencen en verfijnen van de test. Twee toegepaste voorbeeldtests worden gedemonstreerd: ten eerste, de optimalisatie van de meest voorkomende menselijke pathogene variant m.3243A>G18, en ten tweede, de genotypering van muis embryonale fibroblast (MEF) cellen die heteroplasmieverschuiving hebben ondergaan met behulp van technologieën ontwikkeld in het Minczuk-laboratorium in Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutaties in het mitochondriale genoom (mtDNA) zijn in verband gebracht met maternaal overgeërfde genetische ziekten. De belangstelling voor mtDNA-polymorfismen is de afgelopen jaren echter toegenomen vanwege het recent ontwikkelde vermogen om modellen te produceren door mtDNA-mutagenese en een nieuwe waardering van de associatie tussen mitochondriale genetische afwijkingen en veel voorkomende leeftijdsgerelateerde ziekten zoals kanker, diabetes en dementie. Pyrosequencing is een sequencing-by-synthesis-techniek die op grote schaal wordt gebruikt in het mitochondriale veld voor routinematige genotyperingsexperimenten. De relatieve betaalbaarheid in vergelijking met massale parallelle sequencingmethoden en het gemak van implementatie maken het een onschatbare techniek op het gebied van mitochondriale genetica, waardoor de snelle kwantificering van heteroplasmie met verhoogde flexibiliteit mogelijk is. Ondanks de praktische bruikbaarheid van deze methode, vereist de implementatie ervan als een middel voor mtDNA-genotypering de observatie van bepaalde richtlijnen, met name om bepaalde vooroordelen van biologische of technische oorsprong te voorkomen. Dit protocol schetst de noodzakelijke stappen en voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen en implementeren van pyrosequencing assays voor gebruik in de context van heteroplasmiemeting.

Deze sectie presenteert een voorbeeld van optimalisatie van een pyrosequencing assay voor een humane pathogene mtDNA mutatie, evenals sequencing data van de genotypering van heteroplasmatische (m.5024C>T) muis embryonale fibroblasten (MEF's) behandeld met mitochondriale zinkvinger nucleasen (mtZFN's). Het optimaliseren van de test voor menselijke cellen en het vergelijken van twee verschillende assays laat zien hoe de meest nauwkeurige kan worden geselecteerd, terwijl genotypering van genetisch gemodificeerde MEF-cellen ...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.

Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing is een sequencing door synthesetechniek die kan worden gebruikt om single nucleotide polymorfismen in mitochondriaal DNA te genotyperen. Deze methode is voordelig in zijn gemak van implementatie en kosteneffectiviteit in vergelijking met andere sequencingmethoden. Het kan gemakkelijk worden gebruikt als een diagnostische methode voor bepaalde mitochondriale ziekten door het bepalen van heteroplasmiewaarden van pathogene varianten in mitochondriaal DNA.Verkrijg om te beginnen een mitochondriaal DNA-sequentiebestand voor de soort die wordt gegenotypeerd en identificeer de positie van het single nucleotide polymorfisme of SNP. Zorg ervoor dat de gebruikte referentiesequentie de juiste basisnummering voor de bestudeerde mutatie gebruikt, zodat de positie van de SNP gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Kopieer 1.000 basenparen stroomopwaarts en stroomafwaarts van de SNP-site en plak de afgekapte reeks in de pyrosequencing primer-ontwerpsoftware.Markeer de polymorfe basis, klik er met de rechtermuisknop op en selecteer vervolgens Doelgebied instellen om de geanalyseerde SNP-basis in te stellen als het doel van de pyrosequencing-test. Druk op het pictogram Afspelen in de rechterbovenhoek van de interface om de primerselectie te starten en wacht tot de software automatisch de primertrio's genereert, twee primers voor voorversterking van het sjabloon-DNA en de derde primer voor sequencing door de synthese in de pyrosequencingmachine. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Alle primersets kopiëren om alle primersets te behouden.Open de run-software die bij de pyrosequencer is geleverd, selecteer Nieuwe test en selecteer vervolgens de sjabloon voor de kwantificeringstest van het allel. Voer de te analyseren sequentie in het overeenkomstige vak in door de nucleotiden direct na de sequencingprimer in te typen. Geef voor de variabele positie de twee mogelijke bases aan, gescheiden door een schuine streep.Druk op Dispensatievolgorde genereren en laat de software automatisch een geschikte volgorde bepalen voor de nucleotiden die in de sequencing door synthesereactie moeten worden afgegeven. Sla op en geef een naam op voor de test. Voer vervolgens de run uit door het te analyseren DNA te verdunnen tot 5 nanogram per microliter.Zorg er in de eerste run voor dat u monsters van bekende heteroplasmie als referentie en wild-type monsters opneemt. Voer vervolgens een presequencing PCR uit van 5 microliter verdund DNA en 25 microliterreacties, met behulp van de amplificatieprimers en parameters. Als u de bestandsinstellingen wilt uitvoeren, selecteert u Nieuwe uitvoering in de pyrosequencer-software.De pyrosequencer kan tegelijkertijd 48 afzonderlijke voorversterkte reacties sequencen met een leeg vierkant dat een enkele sequencingput op een pyrosequencing-schijf vertegenwoordigt. Laad de assays door met de rechtermuisknop op een vierkantje te klikken en Load Assay te selecteren. Indien nodig, sequentieer maximaal vier afzonderlijke assays met verschillende sequencing primers.Stel de primerdispensatiemodus in op automatisch om automatisch een injectiekamer toe te wijzen voor elke sequencingprimer die voor de run wordt gebruikt. Stel de uitvoeringsmodus in op standaard, tenzij er vier verschillende soorten testen op één sequencingschijf worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het aantal testen in het run-sjabloonbestand overeenkomt met het aantal PCR-reacties dat wordt versterkt.Sla vervolgens de uitgevoerde bestanden op een USB-station op. Om de pyrosequencer voor te bereiden, drukt u op de reinigingsknop op het hoofdtouchscreen van het apparaat en reinigt u alle injectoren met zeer zuiver water, volgens de instructies op het scherm. Wanneer u de absorberstrip in de machine steekt, moet u ervoor zorgen dat de uiteinden elkaar ontmoeten in de 9 uur-positie.Nadat u de USB-stick hebt aangesloten, drukt u op de knop Volgorde om de eerder voorbereide uitvoerbestanden te laden. Volg de instructies op het apparaat om de reagentia, indien nodig, in de overeenkomstige injectoren op de machine te laden en te primen. Laad 3 microliter kralen in de putjes en laad vervolgens 10 microliter van elke PCR-reactie die in het overeenkomstige monster moet worden gesequenced.Pipetteer op en neer om het monster te mengen met de magnetische kralen. Zoek naar de indicatie in de geprimeerde pyrosequencer dat de schijf in de machine kan worden geladen. Schroef de plaatbevestigingsmoer los en lijn de geladen monsterplaat uit met de metalen pen in het schijfcompartiment.Zodra de plaat stevig in het plaatcompartiment is geschroefd, start u de sequencing-run door op de startknop op de touchscreen-interface te drukken. Zodra de uitvoering is voltooid, verwijdert u het USB-station uit het apparaat en sluit u het weer aan op de computer waarop de pyrosequencer-software wordt uitgevoerd. Nadat het nieuw gegenereerde run-bestand op het USB-station is verschenen, dubbelklikt u op het Run Result-bestand.Dit analyseert automatisch de luciferase-output van elke put bij nucleotide-opname en kwantificeert het mitochondriale allel van belang. Zoek naar de kleurscores die door de software worden weergegeven op basis van de kwaliteit van de lezingen. Als u de resultaten wilt opslaan, selecteert u Rapporten in het bovenste venster, gevolgd door Volledig rapport om een PDF-bestand te genereren met de pyrogrammen en resultaten van elke put van de run.U kunt de resultaten ook in andere indelingen downloaden op het tabblad Rapporten. Agarose-gel-elektroforese van een PCR-amplificatie met behulp van de amplificatieprimers uit beide sets geselecteerd voor de m. 3243A>G-mutatie zoals weergegeven in deze figuur.Hier duidt Het op het bijna homoplasmatische m. 3243A>G monster dat moet worden geanalyseerd. Een vergelijking van de prestaties van beide primersets met behulp van molaire standaarden voor kalibratie wordt weergegeven in deze figuur.De gemeten waarden worden aangegeven door de verticale stippellijnen. Een lineaire functie X=Y wordt weergegeven om te illustreren hoe dicht elk van de twee geteste assays bij een ideale meting ligt. De namen van de cellijnen op de X-as zijn de namen van de verschillende cybride klonen die met behulp van deze test werden gegenotypeerd.Genotyperingsresultaten op vier cybride klonen van onbekende m. 3243A>G heteroplasmie met behulp van beide assays worden hier getoond. Sequencing werd uitgevoerd in technische drievoud.Genotyperingsresultaten van mitochondriale zinkvingernuclease-behandelde cellen, samen met onbehandelde en nep-behandelde controles, en de pyrogrammen van twee MEF-celmonster PCR-replicaties die worden gebruikt om de resultaten te genereren, evenals de wild-type genotyperingscontrole worden hier weergegeven. Pyrosequencing kan worden gebruikt als een uitlezing voor gentherapie-experimenten voor het beoordelen van verschillende gentherapietechnologieën in mitochondriaal DNA.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Single-fase Dynamische reanimatie van de Glimlach in Onomkeerbare gezichtsverlamming door Free Functional Muscle Transfer

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Imaging Metals in hersenweefsel door Laser Ablation - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Een Ex Vivo weefselkweek Model voor Fibrovascular complicaties in proliferatieve diabetische retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Artrose pijnmodel geïnduceerd door intra-articulaire injectie van mono-jodoacetaat bij ratten

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orgaan Ischemia-Reperfusie Letsel door het simuleren van hemodynamische veranderingen in rat levertransplantatie model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...