Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
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Wir danken Silvia Marchet und Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Mailand) für die Vorbereitung und Bereitstellung der m.3243A>G Cybrid-Zellen, die als anschauliche Beispiele für dieses Protokoll verwendet werden. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern der Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) für nützliche Diskussionen im Laufe dieser Forschung bedanken. Diese Arbeit wurde durch eine Grundfinanzierung des Medical Research Council UK (MC_UU_00015.4. und MC_UU_00028.3.) unterstützt. P.A.N. und P.S.-P. werden zusätzlich von der Lily Foundation bzw. der Champ Foundation unterstützt.

Für die Verwendung der humanen 3243A>G-Cybridzellen und der in dieser Studie verwendeten immortalisierten m.5024C>T-MEFs wurde eine Einwilligungserklärung erteilt. Eine ethische Genehmigung war in diesem Fall nicht erforderlich, da die Patientenzellen nicht an der Universität Cambridge entnommen wurden. Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann jedoch eine ethische Genehmigung erfordern. Es wird dringend empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben-DNA für die Pyrosequenzierung die Best Practices für die PCR-Einri...

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	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Ein kritischer Aspekt für den Erfolg des Protokolls ist die Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere bei der Verwendung geringer Mengen an Ausgangsmaterial. Es wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben nach Möglichkeit eine UV-Haube und gefilterte Pipettenspitzen zu verwenden sowie die Bereiche vor und nach der Verstärkung getrennt zu halten. Blindproben und Proben bekannter Heteroplasmie (z. B. Wildtyp-DNA) sollten immer als Benchmarks verwendet werden, um technische oder biologische Verzerrungen zu überpr...

Das mitochondriale Genom liegt in Form von kleinen (16,5 kb) kreisförmigen Molekülen (mtDNA) vor, die im innersten Kompartiment der Mitochondrien vorhanden sind, die als Matrix bezeichnet werden und für 13 Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette sowie die tRNAs und rRNAs kodieren, die für ihre Translation in situ durch das mitochondriale Ribosom1 erforderlich sind. Dieses Genom repräsentiert etwa 1% aller Proteine, die für die Funktion der Mitochondrien notwendig sind, der Rest wird von der Kern-DNA (nDNA) kodiert. Es wird allgemein angenommen, dass Mitochondrien aus einem endosymbiotischen Fusionsereignis zwischen einem alpha-proteobakteriellen Vorfahren und einer eukaryotischen Urzelle stammen. Sobald diese hypothetische Symbiose stattgefunden hatte, wurde die genetische Information der Mitochondrien über Äonen hinweg allmählich in den Zellkern übertragen, was die bereits erwähnte Kompaktheit der mtDNA im Vergleich zu den Genomen moderner Cyanobakterienerklärt 2. Ein solcher Transfer von Genen wird am stärksten durch die Existenz langer nDNA-Abschnitte belegt, die in hohem Maße homolog zu den in der mtDNA gefundenen Sequenzen sind. Diese nukleären mitochondrialen Sequenzen (NUMTs) sind eine häufige Quelle für Fehlinterpretationen während der Genotypisierung, und es müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um nukleäre Verzerrungen bei der Genotypisierung von mtDNA3 zu vermeiden (Abbildung 1A).
Eine weitere Besonderheit der mtDNA besteht darin, dass ihre Kopienzahl je nach Zelltyp variiert und zwischen Zehntausenden und Tausenden von Kopien pro Zelle liegt4. Aufgrund dieser mehrfachen Kopiennatur kann mtDNA eine Vielzahl von Genotypen innerhalb einer einzigen Zelle beherbergen, was zu einer kontinuierlicheren Verteilung der Allele führen kann, im Gegensatz zu den diskreten Allelen, die mit Kerngenen assoziiert sind, wenn man die Zygotie der Chromosomen betrachtet. Diese Heterogenität der mitochondrialen Allele wird als mitochondriale Heteroplasmie bezeichnet, die sich typischerweise in der prozentualen Prävalenz einer bestimmten Mutation im Verhältnis zur gesamten mtDNA in einer bestimmten Zelle ausdrückt. Heteroplasmie kann der Homoplasmie gegenübergestellt werden, die sich auf eine einzigartige Art von mtDNA bezieht, die in einer Zelle vorhanden ist.
Die Messung der mitochondrialen Heteroplasmie ist von besonderem Interesse bei der Quantifizierung des Anteils von mtDNA-Molekülen, die pathogene Varianten beherbergen. Solche Varianten gibt es in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), kleinen Indels oder großflächigen Deletionen5. Die meisten Menschen sind heteroplasmatisch für pathogene Varianten; Sie weisen jedoch keine klinischen Phänotypen auf, die sich oft nur bei höheren Heteroplasmie-Konzentrationen pathogener mtDNA manifestieren, was als Schwelleneffektbezeichnet wird 6. Während die mit der Pathogenität assoziierten Werte stark von der Art der pathogenen Mutation und dem Gewebe, in dem sie auftritt, abhängen, liegen sie typischerweise über 60% Heteroplasmie7.
Es gibt mehrere Forschungsbereiche, in denen die mitochondriale Genotypisierung üblich ist. Im medizinischen Bereich kann die Untersuchung oder Quantifizierung von mtDNA-Mutationen als diagnostisches Kriterium für mitochondriale Erkrankungen dienen, von denen viele auf mtDNA-Aberrationen zurückzuführen sind5. Neben der Untersuchung humanpathogener Mutationen wird die Prävalenz von Tiermodellen, die pathogene SNPs in der mtDNA enthalten, wahrscheinlich zunehmen, da in jüngster Zeit die mitochondriale Baseneditierung durch mitochondriale DddA-abgeleitete Cytosin-Baseneditoren (DdCBEs)8 und TALE-basierte Deaminasen (TALEDs) für die Adenin-Basen-Editierung ermöglicht wird9. Dieser Ansatz wird entscheidend dazu beitragen, das Zusammenspiel zwischen abweichenden mitochondrialen Genotypen und den daraus resultierenden Funktionsstörungen zu verstehen. Es gibt auch laufende wissenschaftliche Forschungen zum Umbau des mitochondrialen Genoms für den endgültigen Einsatz als therapeutische Strategie bei menschlichen mitochondrialen Erkrankungen durch einen Ansatz, der als Heteroplasmieverschiebung bekannt ist. In diesem Forschungsgebiet geht es vor allem darum, mutationsspezifische Nukleasen auf die mitochondriale Matrix zu lenken; Dies führt zu einem bevorzugten Abbau pathogener mtDNA, was zu Rettungen beim Phänotyp10,11,12,13 führt. Alle Experimente, die den Umbau des mitochondrialen Genotyps beinhalten, erfordern eine robuste quantitative Methode zur Beurteilung von Heteroplasmieverschiebungen.
Für die Genotypisierung der mtDNA wird eine Vielzahl von Methoden verwendet, die je nach Art der Mutation variieren. Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) sind präziser, wenn es um die Quantifizierung von SNPs in der mtDNA geht. Diese Methoden sind jedoch für die routinemäßige Quantifizierung der mitochondrialen Heteroplasmie nach wie vor unerschwinglich teuer, insbesondere wenn die Anzahl der Proben gering ist. Die Sanger-Sequenzierung kann auch die Erkennung von SNPs ermöglichen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht quantitativ und kann bei der Schätzung hoher Heteroplasmien oft nicht erkannt werden oder ungenau sein. Die Pyrosequenzierung als Assay, der nur minimale Vorbereitung erfordert und die schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie für jede mtDNA-Probe ermöglicht, wird als geeigneter Kompromiss zwischen diesen beiden Extremen vorgeschlagen. Diese Methode wurde von zahlreichen Forschern routinemäßig zur Quantifizierung mitochondrialer SNPs in verschiedenen Kontexten eingesetzt, darunter forensische Analysen 14,15, klinische Diagnosen16 oder die Genotypisierung von mtDNA aus Einzelzellen17.
Dieser Assay beinhaltet einen ersten PCR-Präamplifikationsschritt einer Region, die den SNP in der mtDNA flankiert, gefolgt von einem Sequenzierungs-by-Synthesis-Assay mit einem Strang des zuvor erzeugten Amplikons. Einer der beiden Primer, die im Voramplifikationsschritt verwendet werden, muss am 5'-Ende biotinyliert werden, wodurch die Pyrosequenziervorrichtung in die Lage versetzt wird, den einzelnen DNA-Strang zu isolieren, der als Vorlage für die Sequenzierungsreaktion verwendet werden soll. Ein dritter Sequenzierprimer wird dann auf den zurückgehaltenen biotinylierten Strang getempert, wodurch die entstehende DNA-Synthese in Form von Desoxynukleotide in einer vordefinierten Reihenfolge in die Reaktionskammer abgegeben werden kann. Der Pyrosequenzer zeichnet die Menge jeder eingebauten Base auf der Grundlage einer Lumineszenzanzeige auf und ermöglicht so die relative Quantifizierung von mutierten und mitochondrialen Allelen des Wildtyps bei der DNA-Synthese (Abbildung 1B). Die Lumineszenz wird durch ein Luciferase-Enzym erzeugt, das in Gegenwart von ATP Licht emittiert, das eine ATP-Sulfurylase bei jedem Einbauereignis de novo aus den von jedem Nukleotid freigesetzten Pyrophosphaten synthetisiert. Diese beiden Reaktionen lassen sich wie folgt zusammenfassen:
1. PPi (aus Nukleotideinbau) + APS → ATP + Sulfat (ATP-Sulfurylase)
2. ATP + Luciferin +O2 → AMP + PPi + Oxyluciferin + CO2 + Licht (Luciferase)
Der Nachweis von Adeninbasen durch den Pyrosequenzer, ohne dass ATP in der zweiten Reaktion mit der Luciferase kreuzreagiert, ist eine Herausforderung. Dies wird jedoch durch die Verwendung eines Adenin-Analogons für die DNA-Synthese, nämlich dATPαS, gelöst. Obwohl es kein perfektes Substrat für Luciferase ist, erzeugt es im Vergleich zu den drei anderen Nukleotiden eine stärkere Lumineszenz, die vom Pyrosequenzer digital eingestellt und auf den Faktor 0,9 eingestellt wird. Aufgrund dieser inhärenten Variabilität wird empfohlen, die Sequenzierung von Adenin an der SNP-Position zu vermeiden (siehe die Diskussion für weitere Details).
Das folgende Protokoll beschreibt die Methode der Bewertung der mtDNA-Heteroplasmie durch Pyrosequenzierung und beschreibt die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung der Amplifikationsprimer, um biologische oder technische Verzerrungen bei der Genotypisierung von SNPs in mtDNA zu vermeiden. Letzteres umfasst die digitale Vermessung und Auswahl der Primer-Sets, die Optimierung der Präamplifikations-PCR und schließlich die Sequenzierung und Verfeinerung des Assays. Es werden zwei angewandte Beispielassays demonstriert: erstens die Optimierung der häufigsten humanpathogenen Variante m.3243A>G18 und zweitens die Genotypisierung von embryonalen Fibroblastenzellen (MEF) von Mäusen, die eine Heteroplasmieverschiebung durchlaufen haben, unter Verwendung von Technologien, die im Minczuk-Labor in Cambridge entwickelt wurden 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) werden mit mütterlich vererbten genetischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Interesse an mtDNA-Polymorphismen hat jedoch in den letzten Jahren zugenommen, da in jüngster Zeit die Fähigkeit entwickelt wurde, Modelle durch mtDNA-Mutagenese zu erstellen, und eine neue Erkenntnis des Zusammenhangs zwischen mitochondrialen genetischen Aberrationen und häufigen altersbedingten Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Demenz entwickelt wurde. Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die im gesamten mitochondrialen Bereich für routinemäßige Genotypisierungsexperimente weit verbreitet ist. Ihre relative Erschwinglichkeit im Vergleich zu massiven parallelen Sequenzierungsmethoden und die einfache Implementierung machen sie zu einer unschätzbaren Technik auf dem Gebiet der mitochondrialen Genetik, die eine schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie mit erhöhter Flexibilität ermöglicht. Trotz der Praktikabilität dieser Methode erfordert ihre Implementierung als Mittel zur mtDNA-Genotypisierung die Einhaltung bestimmter Richtlinien, insbesondere um bestimmte Verzerrungen biologischen oder technischen Ursprungs zu vermeiden. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte und Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung und Implementierung von Pyrosequenzierungsassays für die Verwendung im Zusammenhang mit der Heteroplasmiemessung.

In diesem Abschnitt werden ein Beispiel für die Optimierung eines Pyrosequenzierungsassays für eine humanpathogene mtDNA-Mutation sowie Sequenzierungsdaten aus der Genotypisierung von heteroplasmatischen (m.5024C>T) embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vorgestellt, die mit mitochondrialen Zinkfingernukleasen (mtZFNs) behandelt wurden. Die Optimierung des Assays für menschliche Zellen und der Vergleich zweier verschiedener Assays zeigt, wie der genaueste ausgewählt werden kann, während die Genotypisierung genetis...

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Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die zur Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen in der mitochondrialen DNA verwendet werden kann. Diese Methode zeichnet sich durch ihre einfache Implementierung und Kosteneffizienz im Vergleich zu anderen Sequenzierungsmethoden aus. Es kann leicht als diagnostische Methode für bestimmte mitochondriale Erkrankungen verwendet werden, indem Heteroplasmiewerte pathogener Varianten in der mitochondrialen DNA bestimmt werden.Besorgen Sie sich zunächst eine mitochondriale DNA-Sequenzdatei für die zu genotypisierende Spezies und bestimmen Sie die Position des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP). Stellen Sie sicher, dass die verwendete Referenzsequenz die entsprechende Basisnummerierung für die untersuchte Mutation verwendet, damit die Position des SNP leicht identifiziert werden kann. Kopieren Sie 1.000 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts der SNP-Stelle und fügen Sie die abgeschnittene Sequenz in die Primer-Design-Software für die Pyrosequenzierung ein.Markieren Sie die polymorphe Basis, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie dann Zielregion festlegen, um die analysierte SNP-Basis als Ziel für den Pyrosequenzierungsassay festzulegen. Klicken Sie auf das Play-Symbol in der oberen rechten Ecke der Benutzeroberfläche, um die Primerauswahl zu starten, und warten Sie, bis die Software automatisch die Primer-Trios, zwei Primer für die Voramplifikation der Template-DNA und den dritten Primer für die Sequenzierung durch die Synthese in der Pyrosequenziermaschine generiert. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Alle Primer-Sets kopieren aus, um alle Primer-Sets beizubehalten.Öffnen Sie die mit dem Pyrosequenzierer gelieferte Laufsoftware, wählen Sie Neuer Assay und dann die Assay-Vorlage für die Allelquantifizierung aus. Geben Sie die zu analysierende Sequenz in das entsprechende Feld ein, indem Sie die Nukleotide direkt hinter dem Sequenzierungsprimer eingeben. Bezeichnen Sie für die variable Position die beiden möglichen Basen, die durch einen Schrägstrich getrennt sind.Klicken Sie auf Generate Dispensation Order, und lassen Sie die Software automatisch eine geeignete Reihenfolge für die Nukleotide bestimmen, die in der Sequenzierung durch Synthesereaktion abgegeben werden sollen. Speichern Sie und geben Sie einen Namen für den Assay an. Führen Sie anschließend den Lauf durch, indem Sie die zu analysierende DNA auf 5 Nanogramm pro Mikroliter verdünnen.Stellen Sie im ersten Durchlauf sicher, dass Sie Proben bekannter Heteroplasmie als Referenz und Wildtypproben einbeziehen. Führen Sie dann eine präsequenzierende PCR von 5 Mikrolitern verdünnter DNA und 25 Mikroliter-Reaktionen unter Verwendung der Amplifikationsprimer und -parameter durch. Um das Datei-Setup auszuführen, wählen Sie New Run in der Pyrosequencer-Software.Der Pyrosequenzer kann gleichzeitig 48 separate vorverstärkte Reaktionen sequenzieren, wobei ein leeres Quadrat eine einzelne Sequenzierungsvertiefung auf einer Pyrosequenzierungsscheibe darstellt. Laden Sie die Assays, indem Sie mit der rechten Maustaste auf ein Quadrat klicken und Assay laden auswählen. Sequenzieren Sie bei Bedarf bis zu vier separate Assays mit unterschiedlichen Sequenzierungsprimern.Stellen Sie den Primer-Dosiermodus auf "Automatisch" ein, um jedem für den Lauf verwendeten Sequenzier-Primer automatisch eine Injektionskammer zuzuweisen. Setzen Sie den Laufmodus auf Standard, es sei denn, Sie führen vier verschiedene Arten von Assays auf einer Sequenzierungsscheibe aus. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Assays in der Laufvorlagendatei mit der Anzahl der zu amplifizierenden PCR-Reaktionen übereinstimmt.Speichern Sie dann die Ausführungsdateien auf einem USB-Laufwerk. Um den Pyrosequenzer zu entlüften, drücken Sie die Reinigungstaste auf dem Haupt-Touchscreen des Geräts und reinigen Sie alle Injektoren mit hochreinem Wasser, indem Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm befolgen. Achten Sie beim Einsetzen des Absorberstreifens in die Maschine darauf, dass sich die Enden in der 9-Uhr-Position treffen.Drücken Sie nach dem Einstecken des USB-Sticks die Sequenztaste, um die zuvor vorbereiteten Ausführungsdateien zu laden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Gerät, um die Reagenzien bei Bedarf in die entsprechenden Injektoren des Geräts zu laden und zu entlüften. Laden Sie 3 Mikroliter Beads in die Vertiefungen und laden Sie dann 10 Mikroliter jeder zu sequenzierenden PCR-Reaktion in die entsprechende Probe.Pipettieren Sie auf und ab, um die Probe mit den magnetischen Kügelchen zu vermischen. Achten Sie auf die Anzeige im vorbereiteten Pyrosequenzer, dass die Disc in die Maschine eingelegt werden kann. Schrauben Sie die Plattenhaltemutter ab und richten Sie die eingelegte Probenplatte mit dem Metallstift im Disc-Fach aus.Sobald die Platte fest in das Plattenfach eingeschraubt ist, starten Sie den Sequenzierlauf, indem Sie die Starttaste auf der Touchscreen-Oberfläche drücken. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, entfernen Sie das USB-Laufwerk aus dem Gerät und schließen Sie es wieder an den Computer an, auf dem die Pyrosequenzer-Software ausgeführt wird. Nachdem die neu generierte Ausführungsdatei auf dem USB-Laufwerk angezeigt wurde, doppelklicken Sie auf die Ausführungsergebnisdatei.Dabei wird automatisch der Luciferase-Output jedes Wells beim Einbau von Nukleotiden analysiert und das interessierende mitochondriale Allel quantifiziert. Suchen Sie nach den Farbwerten, die von der Software basierend auf der Qualität der Lesevorgänge angezeigt werden. Um die Ergebnisse zu speichern, wählen Sie im oberen Fenster Berichte und anschließend Vollständiger Bericht aus, um eine PDF-Datei mit den Pyrogrammen und Ergebnissen aus jedem Bohrloch des Laufs zu erstellen.Alternativ können Sie die Ergebnisse auch in anderen Formaten auf der Registerkarte Berichte herunterladen. Agarose-Gelelektrophorese einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Amplifikationsprimer aus beiden Sets, die für die m. 3243A>G-Mutation ausgewählt wurden, wie in dieser Abbildung gezeigt.Het bezeichnet hier die nahezu homoplasmatische m. 3243A>G-Probe, die analysiert werden soll. Ein Vergleich der Leistung beider Primersätze unter Verwendung von Molarennormalen für die Kalibrierung ist in dieser Abbildung dargestellt.Die Messwerte sind durch die senkrechten gestrichelten Linien gekennzeichnet. Eine lineare X=Y-Funktion wird angezeigt, um zu veranschaulichen, wie nahe jeder der beiden getesteten Assays an einer idealen Messung liegt. Die Namen der Zelllinien auf der X-Achse sind die Namen der verschiedenen Cybrid-Klone, die mit diesem Assay genotypisiert wurden.Die Ergebnisse der Genotypisierung von vier Cybrid-Klonen unbekannter m. 3243A>G-Heteroplasmie unter Verwendung beider Assays sind hier dargestellt. Die Sequenzierung erfolgte in technischer Ausfertigung.Hier werden die Genotypisierungsergebnisse von mitochondrialen Zinkfingernuklease-behandelten Zellen zusammen mit unbehandelten und simulierten Kontrollen und die Pyrogramme von zwei MEF-Zellproben-PCR-Replikaten, die zur Generierung der Ergebnisse verwendet wurden, sowie die Wildtyp-Genotypisierungskontrolle gezeigt. Die Pyrosequenzierung kann als Auslese für Gentherapie-Experimente zur Bewertung verschiedener Gentherapie-Technologien in mitochondrialer DNA verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Forschung

Medizin

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifizierung von<em&gt; Dornröschen</em&gt; Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Einstufige Dynamische Reanimation des Lächelns in Irreversible Fazialisparese von Free Funktionsmuskelüber

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

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Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

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Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Osteoarthritis-Schmerzmodell, induziert durch intraartikuläre Injektion von Mono-Jodacetat bei Ratten

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...