Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

ברצוננו להודות לסילביה מרקט וקונסטנזה למפרטי (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milan) על ההכנה והאספקה של תאי הציבריד m.3243A>G המשמשים כדוגמאות להמחשה עבור פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לחברי הקבוצה לגנטיקה מיטוכונדריאלית (MRC-MBU, אוניברסיטת קיימברידג') על דיון שימושי במהלך מחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה למחקר רפואי בבריטניה (MC_UU_00015/4 ו- MC_UU_00028/3). פ.א.נ. ופ.ס.-פ. נתמכים בנוסף על ידי קרן לילי וקרן צ'אמפ, בהתאמה.

הסכמה מדעת ניתנה לשימוש בתאי הציבריד האנושיים 3243A>G ובתאי M.5024C>T MEFs האימורטליים ששימשו במחקר זה. אישור אתי לא נדרש במקרה זה מכיוון שתאי החולה לא נאספו באוניברסיטת קיימברידג '. עם זאת, השימוש בפיברובלסטים אנושיים עשוי לדרוש אישור אתי. מומלץ מאוד לעקוב אחר שיטות עבודה מומלצות להגדרת PCR בעת הכנת...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

היבט קריטי להצלחת הפרוטוקול הוא הימנעות מזיהום, במיוחד בעת שימוש בכמויות נמוכות של חומר מוצא. מומלץ להשתמש בקולט אדים UV וקצוות פיפטה מסוננים בעת הכנת הדגימות במידת האפשר, כמו גם לשמור על הפרדה בין אזורי טרום הגברה ופוסט-הגברה. מדידות ריקות ודגימות של הטרופלזמה ידועה (כגון דנ"א מסוג פרא) צרי...

הגנום המיטוכונדריאלי קיים בצורה של מולקולות מעגליות קטנות (16.5 קילובייט) (mtDNA) הנמצאות בתא הפנימי ביותר של המיטוכונדריה הנקראות מטריצה ומקודדות 13 תת-יחידות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, כמו גם את ה-tRNA וה-rRNA הדרושים לתרגומם באתרם על ידי הריבוזום המיטוכונדריאלי1. גנום זה מייצג כ-1% מכלל החלבונים הדרושים לתפקוד המיטוכונדריה, והשאר מקודדים על ידי הדנ"א הגרעיני (nDNA). מקובל להניח כי מיטוכונדריה נגזרים מאירוע איחוי אנדוסימביוטי בין אב קדמון אלפא-פרוטאובקטריאלי לבין תא איקריוטי קדמון. ברגע שסימביוזה היפותטית זו התרחשה, המידע הגנטי של המיטוכונדריה הועבר בהדרגה לגרעין במשך עידנים, מה שמסביר את הקומפקטיות הנ"ל של mtDNA בהשוואה לגנום של ציאנובקטריה מודרנית2. העברה כזו של גנים מתבטאת בצורה החזקה ביותר בקיומם של חלקים ארוכים של nDNA שהם הומולוגיים מאוד לרצפים הנמצאים ב- mtDNA. הרצפים המיטוכונדריאליים הגרעיניים האלה (NUMTs) הם מקור נפוץ לפרשנות שגויה במהלך גנוטיפ, ויש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי להימנע מהטיות גרעיניות בעת גנוטיפ mtDNA3 (איור 1A).
תכונה ייחודית נוספת של mtDNA היא שמספר העותקים שלו משתנה בהתאם לסוג התא, ומספור בין עשרות לאלפי עותקים לכל תא4. בשל אופי מרובה עותקים זה, mtDNA יכול להכיל מגוון רחב של גנוטיפים בתוך תא יחיד, מה שיכול לגרום לפיזור רציף יותר של אללים בניגוד לאללים בדידים הקשורים לגנים גרעיניים כאשר לוקחים בחשבון את הזיגוסיות של כרומוזומים. הטרוגניות זו של אללים מיטוכונדריאליים מכונה הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, המתבטאת בדרך כלל באחוז השכיחות של מוטציה נתונה כשיעור מסך mtDNA בתא נתון. הטרופלזמה יכולה להיות מנוגדת להומופלזמה, המתייחסת למין ייחודי של mtDNA שנמצא על פני תא.
מדידת הטרופלזמה של המיטוכונדריה מעניינת במיוחד כאשר מכמתים את חלקן של מולקולות mtDNA המכילות וריאנטים פתוגניים. גרסאות כאלה מגיעות בצורה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), אינדל קטן, או מחיקות בקנה מידה גדול5. רוב בני האדם הם הטרופלזמיים עבור וריאנטים פתוגניים; עם זאת, הם אינם מציגים פנוטיפים קליניים, אשר לעתים קרובות מתבטאים רק ברמות הטרופלזמה גבוהות יותר של mtDNA פתוגני בתופעה המכונה אפקט סף6. בעוד הערכים הקשורים פתוגניות תלויים מאוד באופי של מוטציה פתוגנית ואת הרקמה שבה היא מתרחשת, הם בדרך כלל נמצאים מעל 60% הטרופלזמה7.
ישנם מספר תחומי מחקר בהם גנוטיפ מיטוכונדריאלי נפוץ. בתחום הרפואי, בדיקה או כימות של מוטציות mtDNA יכולות לשמש כקריטריון אבחוני למחלות מיטוכונדריאליות, שרבות מהן כוללות סטיות mtDNA כמקורשלהן 5. בנוסף לחקר מוטציות פתוגניות בבני אדם, השכיחות של מודלים של בעלי חיים המכילים SNPs פתוגניים ב- mtDNA צפויה לעלות, בהתחשב בהופעה האחרונה של עריכת בסיס מיטוכונדריאלי המתאפשרת על ידי עורכי בסיס ציטוזין ממוקדים במיטוכונדריה (DdCBEs)8 ו- DEAMINASES מבוססי TALE(TALEDs) לעריכת בסיס אדנין9. גישה זו תסייע בהבנת יחסי הגומלין בין גנוטיפים מיטוכונדריאליים חריגים לבין התפקוד הלקוי הנובע מכך. יש גם מחקר מדעי מתמשך על עיצוב מחדש של הגנום המיטוכונדריאלי לשימוש אולטימטיבי כאסטרטגיה טיפולית במחלות מיטוכונדריאליות אנושיות באמצעות גישה המכונה שינוי הטרופלזמה. תחום מחקר זה כולל בעיקר הכוונת נוקלאזות ספציפיות למוטציות למטריצה המיטוכונדריאלית; התוצאה היא השפלה מועדפת של mtDNA פתוגני, מה שמוביל להצלות בפנוטיפ 10,11,12,13. כל ניסוי הכרוך בעיצוב מחדש של הגנוטיפ המיטוכונדריאלי דורש שיטה כמותית חזקה כדי להעריך שינויים הטרופלזמה.
מגוון רחב של שיטות משמשות לגנוטיפ mtDNA, ואלה משתנות בהתאם לאופי המוטציה. שיטות ריצוף הדור הבא (NGS) מדויקות יותר כשמדובר בכימות SNPs ב- mtDNA; עם זאת, שיטות אלה נשארות יקרות מאוד לכימות שגרתי של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, במיוחד אם מספר הדגימות קטן. ריצוף Sanger יכול גם לאפשר זיהוי של SNPs; עם זאת, גישה זו אינה כמותית ולעתים קרובות אינה מצליחה לזהות רמות נמוכות של הטרופלזמה או יכולה להיות לא מדויקת בעת הערכת הטרופלסמיה גבוהה. Pyrosequencing, כבדיקה הכרוכה בהכנה מינימלית ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עבור כל דגימת mtDNA, מוצעת כפשרה הולמת בין שני הקצוות הללו. שיטה זו שימשה באופן שגרתי לכימות SNPs מיטוכונדריאלי על ידי חוקרים רבים בהקשרים שונים, כולל ניתוח פורנזי 14,15, אבחנה קלינית16, או גנוטיפ של mtDNA מתאים בודדים17.
בדיקה זו כוללת שלב טרום הגברה ראשון של PCR של אזור הצמוד ל- SNP ב- mtDNA, ואחריו בדיקת רצף על ידי סינתזה באמצעות גדיל אחד של האמפליקון שנוצר בעבר. אחד משני הפריימרים המשמשים בשלב טרום ההגברה חייב להיות ביוטינילציה בקצה 5', מה שיאפשר למנגנון הפירוזקוונס לבודד את גדיל הדנ"א היחיד שישמש כתבנית לתגובת הריצוף. לאחר מכן משליכים פריימר ריצוף שלישי על גדיל הביוטינילציה השמור, מה שמאפשר סינתזת דנ"א מתהווה כדאוקסינוקלאוטידים להיות מופצים בסדר מוגדר מראש לתוך תא התגובה. הפירורצ'ר רושם את הכמות של כל בסיס משולב בהתבסס על קריאה זוהרת, מה שמאפשר כימות יחסי של אללים מיטוכונדריאליים מוטנטיים ופראיים על סינתזת דנ"א (איור 1B). הלומינסנציה נוצרת על ידי אנזים לוציפראז, אשר פולט אור בנוכחות ATP כי ATP sulfurylase מסנתז דה נובו בכל אירוע התאגדות מן pyrophosphates שוחרר על ידי כל נוקלאוטיד. ניתן לסכם את שתי התגובות הללו כך:
1. PPi (משילוב נוקלאוטידים) + APS → ATP + סולפט (ATP סולפורילאז)
2. ATP + luciferin + O 2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + אור (luciferase)
איתור בסיסי אדנין על ידי הפירורצ'ר ללא ATP צולב עם לוציפראז בתגובה השנייה הוא אתגר. עם זאת, זה נפתר באמצעות אנלוגי אדנין עבור סינתזת DNA, כלומר dATPαS. למרות שאינו מצע מושלם עבור לוציפראז, הוא מייצר בהירות חזקה יותר בהשוואה לשלושת הנוקלאוטידים האחרים, אשר מכוונן דיגיטלית על ידי הפירורצ'ר ומוגדר לפקטור של 0.9. בשל שונות אינהרנטית זו, מוצע להימנע מריצוף אדנין בעמדת SNP (ראה דיון לפרטים נוספים).
הפרוטוקול הבא מפרט את השיטה של הערכת הטרופלזמה mtDNA על ידי pyrosequencing ומתאר את אמצעי הזהירות הדרושים בתכנון פריימרים הגברה כדי למנוע הטיה ביולוגית או טכנית בעת גנוטיפ SNPs ב mtDNA. האחרון כולל סקירה דיגיטלית ובחירת ערכות פריימר, אופטימיזציה של PCR טרום הגברה, ולבסוף, ריצוף וליטוש הבדיקה. שתי דוגמאות יישומיות מודגמות: ראשית, אופטימיזציה של הגרסה הפתוגנית האנושית הנפוצה ביותר m.3243A>G18, ושנית, גנוטיפ של תאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEF) שעברו הסטת הטרופלזמה באמצעות טכנולוגיות שפותחו במעבדת מינצ'וק בקיימברידג' 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי (mtDNA) נקשרו למחלות גנטיות תורשתיות אימהיות. עם זאת, העניין בפולימורפיזמים של mtDNA גדל בשנים האחרונות בשל היכולת שפותחה לאחרונה לייצר מודלים על ידי מוטגנזה mtDNA והערכה חדשה של הקשר בין סטיות גנטיות מיטוכונדריאליות ומחלות נפוצות הקשורות לגיל כגון סרטן, סוכרת ודמנציה. Pyrosequencing היא טכניקת ריצוף על ידי סינתזה הנמצאת בשימוש נרחב ברחבי שדה המיטוכונדריה עבור ניסויים גנוטיפיים שגרתיים. מחירה היחסי בהשוואה לשיטות ריצוף מקבילי מאסיביות וקלות היישום הופכים אותה לטכניקה רבת ערך בתחום הגנטיקה של המיטוכונדריה, ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עם גמישות מוגברת. למרות המעשיות של שיטה זו, יישומה כאמצעי לגנוטיפ mtDNA דורש תצפית על הנחיות מסוימות, במיוחד כדי למנוע הטיות מסוימות ממוצא ביולוגי או טכני. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים ואמצעי הזהירות הדרושים בתכנון ויישום מבחני pyrosequencing לשימוש בהקשר של מדידת הטרופלזמה.

חלק זה מציג דוגמה לאופטימיזציה של בדיקת pyrosequencing עבור מוטציה פתוגנית mtDNA אנושית, כמו גם נתוני ריצוף מהגנוטיפ של פיברובלסטים עובריים הטרופלזמיים (m.5024C>T) של עכברים (MEFs) המטופלים בנוקלאזות אצבע אבץ מיטוכונדריאליות (mtZFN). אופטימיזציה של הבדיקה עבור תאים אנושיים והשוואת שתי בדיקות שונות מדגימה כ...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing הוא ריצוף על ידי סינתזה טכניקה אשר ניתן להשתמש בו כדי גנוטיפ יחיד נוקלאוטיד פולימורפיזמים ב DNA מיטוכונדריאלי. שיטה זו מועילה בקלות היישום שלה וחסכונית בהשוואה לשיטות ריצוף אחרות. זה יכול בקלות לשמש כשיטת אבחון עבור מחלות מיטוכונדריאליות מסוימות על ידי קביעת ערכים הטרופלזמה של וריאנטים פתוגניים ב- DNA מיטוכונדריאלי.כדי להתחיל, קבל קובץ רצף DNA מיטוכונדריאלי עבור המינים העוברים גנוטיפ וזהה את המיקום של פולימורפיזם הנוקלאוטיד היחיד, או SNP. ודא שרצף הייחוס המשמש משתמש במספור הבסיס המתאים למוטציה שנחקרה, כך שניתן יהיה לזהות בקלות את מיקום ה- SNP. העתק 1, 000 זוגות בסיס במעלה ובמורד הזרם של אתר SNP והדבק את הרצף החתוך לתוך תוכנת עיצוב פריימר pyrosequencing.סמן את הבסיס הפולימורפי, לחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן בחר הגדר אזור יעד כדי להגדיר את בסיס SNP מנותח כיעד של בדיקת pyrosequencing. לחץ על סמל Play בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להפעיל את בחירת הפריימר, והמתן עד שהתוכנה תיצור באופן אוטומטי את שלישיות הפריימר, שני פריימרים להגברה מראש של DNA התבנית, והפריימר השלישי לריצוף על ידי הסינתזה במכונת pyrosequencing. לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'העתק את כל ערכות הפריימר' כדי לשמור על כל ערכות הפריימר.פתח את תוכנת ההפעלה שסופקה עם pyrosequencer, בחר New Assay ולאחר מכן בחר את תבנית בדיקת כימות האלל. הזן את הרצף שיש לנתח בתיבה המתאימה על ידי הקלדת הנוקלאוטידים ישירות במורד הזרם של פריימר הרצף. עבור מיקום המשתנה, ציין את שני הבסיסים האפשריים, מופרדים באמצעות קו נטוי.לחץ על Generate Dispensation Order ותן לתוכנה לקבוע באופן אוטומטי סדר מתאים עבור הנוקלאוטידים שיופקו ברצף על ידי תגובת סינתזה. שמור וספק שם עבור הבדיקה. לאחר מכן, בצע את הריצה על ידי דילול ה- DNA כדי להיות מנותח ל 5 ננוגרם למיקרוליטר.בסיבוב הראשון, הקפד לכלול דגימות של הטרופלזמה ידועה כהתייחסות ודגימות מסוג פראי. לאחר מכן לבצע PCR preprequencing של 5 מיקרוליטר של DNA מדולל ו 25 מיקרוליטר תגובות, באמצעות פריימרים הגברה ופרמטרים. כדי להפעיל את הגדרת הקובץ, בחר הפעלה חדשה בתוכנת pyrosequencer.הפירורצף יכול לרצף בו זמנית 48 תגובות מוגברות נפרדות עם ריבוע ריק המייצג היטב רצף יחיד על דיסק pyrosequencing. טען את הבדיקות על-ידי לחיצה ימנית על ריבוע ובחירה באפשרות טען מבחן. במידת הצורך, רצף עד ארבע בדיקות נפרדות עם פריימרים שונים לריצוף.הגדר את מצב חלוקת הפריימר לאוטומטי כדי להקצות אוטומטית תא הזרקה לכל פריימר רצף המשמש לריצה. הגדר את מצב הפעלה לרגיל, אלא אם כן פועל ארבעה סוגים שונים של בדיקות בדיסק רצף אחד. ודא שמספר הבדיקות בקובץ תבנית ההפעלה תואם למספר תגובות ה- PCR המוגברות.לאחר מכן שמור את קבצי ההפעלה בכונן USB. כדי להפעיל את הפירורצף, לחץ על כפתור הניקוי במסך המגע הראשי של המכשיר ונקה את כל המזרקים במים בעלי טוהר גבוה, בהתאם להוראות שעל המסך. בעת הכנסת פס הבולם למכונה, יש לוודא שהקצוות נפגשים במצב השעה 9.לאחר חיבור מקל ה- USB, לחץ על רצף כפתור כדי לטעון את קבצי ההפעלה שהוכנו קודם לכן. בצע את ההוראות שעל המכשיר כדי לטעון ולהעביר את הריאגנטים, לפי הצורך, למזרקים המתאימים במכשיר. טען 3 מיקרוליטר של חרוזים לתוך הבארות, ולאחר מכן לטעון 10 מיקרוליטר של כל תגובת PCR כדי להיות רצף לתוך המדגם המתאים.פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הדגימה עם החרוזים המגנטיים. חפש את האינדיקציה בפירורצף הראשוני שניתן לטעון את הדיסק למכונה. פתחו את הברגת הצלחת המחזיקה את האגוז, ויישרו את צלחת הדגימה הטעונה עם פין המתכת בתא הדיסק.לאחר הברגת הצלחת בחוזקה לתא הצלחת, הפעל את ריצת הרצף על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בממשק מסך המגע. לאחר השלמת ההפעלה, הסר את כונן ה- USB מהמכשיר וחבר אותו בחזרה למחשב שבו פועלת תוכנת הפירורצף. לאחר שקובץ ההפעלה החדש שנוצר מופיע בכונן ה- USB, לחץ פעמיים על קובץ הפעל תוצאות.זה מנתח באופן אוטומטי את תפוקת הלוציפראז של כל באר עם שילוב הנוקלאוטידים, ומכמת את האלל המיטוכונדריאלי המעניין. חפש את ציוני הצבעים המוצגים על ידי התוכנה בהתבסס על איכות הקריאות. כדי לשמור את התוצאות, בחר דוחות בחלון העליון, ולאחר מכן דוח מלא כדי ליצור קובץ PDF המכיל פירוגרמות ותוצאות מכל באר של הרצה.לחלופין, הורד את התוצאות בפורמטים אחרים תחת הכרטיסיה דוחות. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של הגברה PCR באמצעות פריימרים להגברה משתי הקבוצות שנבחרו עבור מוטציית m. 3243A>G כפי שמוצג באיור זה.כאן, Het מציין את מדגם m. 3243A>G כמעט הומופלסמי שיש לנתח. השוואה של הביצועים של שתי ערכות הפריימר באמצעות תקנים מולאריים לכיול מוצגת באיור זה.הערכים הנמדדים מסומנים בקווים האנכיים המקווקוים. פונקציה ליניארית X=Y מוצגת כדי להמחיש עד כמה כל אחד משני המבחנים שנבדקו קרוב למדידה אידיאלית. שמות קווי התאים על ציר ה-X הם שמותיהם של שיבוטים שונים של ציברידים שעברו גנוטיפ באמצעות בדיקה זו.תוצאות גנוטיפ על ארבעה שיבוטים של ציבריד של הטרופלזמה לא ידועה m. 3243A>G באמצעות שתי הבדיקות מוצגות כאן. הרצף בוצע בשלשה טכנית.תוצאות גנוטיפ של תאים שטופלו בנוקלאז אצבע אבץ מיטוכונדריאלי, יחד עם בקרות לא מטופלות ומטופלות דמה, והפירוגרמות משני שכפול PCR של דגימת תאי MEF המשמשים ליצירת התוצאות, כמו גם בקרת הגנוטיפ מסוג פרא מוצגות כאן. Pyrosequencing יכול לשמש כקריאה לניסויים בתרפיה גנטית להערכת טכנולוגיות ריפוי גנטי שונות ב- DNA מיטוכונדריאלי.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

שלב אחד-דינמי Reanimation של סמייל בשיתוק פנים בלתי הפיך על ידי העברת שריר פונקציונלית חינם

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

מתכות הדמיה ברקמת המוח על ידי אבלציה לייזר - פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

מודל כאב אוסטאוארתריטיס המושרה על ידי הזרקה תוך-מפרקית של מונו-יודואצטט בחולדות

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

פגיעה באיבר איסכמיה-רפרופוזיה על ידי הדמיית שינויים המודינמיים במודל השתלת כבד עכברוש

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...