Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
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Si ringraziano Silvia Marchet e Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) per aver preparato e fornito le cellule cibride m.3243A>G utilizzate come esempi illustrativi per questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare i membri del Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, Università di Cambridge) per l'utile discussione nel corso di questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di base del Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 e MC_UU_00028/3). P.A.N. e P.S.-P. sono inoltre supportati rispettivamente da The Lily Foundation e The Champ Foundation.

È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule cibridi umane 3243A>G e dei MEF m.5024C>T immortalizzati utilizzati in questo studio. L'approvazione etica non era richiesta in questo caso poiché le cellule del paziente non sono state raccolte presso l'Università di Cambridge. L'uso di fibroblasti umani può, tuttavia, richiedere l'approvazione etica. Si raccomanda vivamente di seguire le migliori pratiche per la configurazione della PCR durante la preparazione del DNA campione per il pirosequenziamento. ...

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Un aspetto critico per il successo del protocollo è evitare contaminazioni, in particolare quando si utilizzano basse quantità di materiale di partenza. Si consiglia di utilizzare una cappa UV e punte di pipette filtrate durante la preparazione dei campioni, ove possibile, nonché di mantenere separate le aree di preamplificazione e post-amplificazione. Le misurazioni in bianco e i campioni di eteroplasmia nota (come il DNA wild-type) dovrebbero sempre essere inclusi da utilizzare come parametri di riferimento per veri...

Il genoma mitocondriale esiste sotto forma di piccole (16,5 kb) molecole circolari (mtDNA) presenti nel compartimento più interno dei mitocondri chiamato matrice e codifica 13 subunità della catena respiratoria mitocondriale, nonché i tRNA e gli rRNA necessari per la loro traduzione in situ dal ribosoma mitocondriale1. Questo genoma rappresenta circa l'1% di tutte le proteine necessarie per la funzione mitocondriale, il resto delle quali sono codificate dal DNA nucleare (nDNA). Si presume comunemente che i mitocondri derivino da un evento di fusione endosimbiotica tra un antenato alfa-proteobatterico e una cellula eucariotica ancestrale. Una volta avvenuta questa ipotetica simbiosi, l'informazione genetica dei mitocondri è stata gradualmente trasferita al nucleo nel corso di eoni, il che spiega la suddetta compattezza del mtDNA rispetto ai genomi dei moderni cianobatteri2. Tale trasferimento di geni è fortemente evidenziato dall'esistenza di lunghi tratti di nDNA che sono altamente omologhi alle sequenze trovate nel mtDNA. Queste sequenze mitocondriali nucleari (NUMT) sono una fonte comune di interpretazione errata durante la genotipizzazione e devono essere prese alcune precauzioni per evitare distorsioni nucleari durante la genotipizzazione del mtDNA3 (Figura 1A).
Un'altra caratteristica distintiva del mtDNA è che il suo numero di copie varia a seconda del tipo di cellula, numerando ovunque da decine a migliaia di copie per cellula4. A causa di questa natura multi-copia, il mtDNA può ospitare una vasta gamma di genotipi all'interno di una singola cellula, il che può comportare una distribuzione più continua degli alleli in contrasto con gli alleli discreti associati ai geni nucleari quando si considera la zigosità dei cromosomi. Questa eterogeneità degli alleli mitocondriali è indicata come eteroplasmia mitocondriale, che è tipicamente espressa nella prevalenza percentuale di una data mutazione in proporzione al mtDNA totale in una data cellula. L'eteroplasmia può essere contrastata con l'omoplasia, che si riferisce a una specie unica di mtDNA presente in una cellula.
La misurazione dell'eteroplasmia mitocondriale è di particolare interesse quando si quantifica la proporzione di molecole di mtDNA che ospitano varianti patogene. Tali varianti si presentano sotto forma di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), piccoli indel, o delezioni su larga scala5. La maggior parte degli esseri umani sono eteroplasmatici per le varianti patogene; tuttavia, non presentano alcun fenotipo clinico, che spesso si manifesta solo a livelli più elevati di eteroplasmia di mtDNA patogeno in un fenomeno indicato come effetto soglia6. Mentre i valori associati alla patogenicità dipendono fortemente dalla natura della mutazione patogena e dal tessuto in cui si verifica, in genere si trovano al di sopra del 60% di eteroplasmia7.
Ci sono diverse aree di ricerca in cui la genotipizzazione mitocondriale è comune. In campo medico, il test o la quantificazione delle mutazioni del mtDNA può servire come criterio diagnostico per le malattie mitocondriali, molte delle quali hanno aberrazioni del mtDNA come origine5. Oltre allo studio delle mutazioni patogene umane, è probabile che aumenti la prevalenza di modelli animali che ospitano SNP patogeni nel mtDNA, dato il recente avvento dell'editing della base mitocondriale abilitato dagli editor di base citosina derivati da DddA mitocondriali (DdCBE)8 e dalle deaminasi a base di TALE (TALEDs) per l'editing della base adenina9. Questo approccio sarà strumentale per comprendere l'interazione tra genotipi mitocondriali aberranti e le disfunzioni risultanti. C'è anche una ricerca scientifica in corso sul rimodellamento del genoma mitocondriale per l'uso finale come strategia terapeutica nelle malattie mitocondriali umane attraverso un approccio noto come spostamento dell'eteroplasmia. Questo campo di ricerca riguarda principalmente l'indirizzamento di nucleasi specifiche per mutazione alla matrice mitocondriale; ciò si traduce nella degradazione preferenziale del mtDNA patogeno, portando a salvataggi nel fenotipo10,11,12,13. Qualsiasi esperimento che coinvolga il rimodellamento del genotipo mitocondriale richiede un robusto metodo quantitativo per valutare i cambiamenti dell'eteroplasmia.
Un'ampia varietà di metodi sono usati per genotipizzare il mtDNA, e questi variano a seconda della natura della mutazione. I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono più precisi quando si tratta di quantificare gli SNP nel mtDNA; Tuttavia, questi metodi rimangono proibitivamente costosi per la quantificazione di routine dell'eteroplasmia mitocondriale, in particolare se il numero di campioni è piccolo. Il sequenziamento con metodo Sanger può anche consentire il rilevamento di SNP; Tuttavia, questo approccio non è quantitativo e spesso non riesce a rilevare bassi livelli di eteroplasmia o può essere impreciso quando si stimano eteroplasmie elevate. Il pirosequenziamento, come saggio che comporta una preparazione minima e consente la rapida quantificazione dell'eteroplasmia per qualsiasi campione di mtDNA, si propone come un compromesso appropriato tra questi due estremi. Questo metodo è stato utilizzato di routine per quantificare SNP mitocondriali da numerosi ricercatori in vari contesti, tra cui l'analisi forense 14,15, la diagnosi clinica16 o la genotipizzazione del mtDNA da singole cellule17.
Questo test prevede una prima fase di preamplificazione della PCR di una regione che fiancheggia l'SNP nel mtDNA, seguita da un test di sequenziamento per sintesi utilizzando un filamento dell'amplicone precedentemente generato. Uno dei due primer utilizzati nella fase di preamplificazione deve essere biotinilato all'estremità 5', il che consentirà all'apparato di pirosequenziamento di isolare il singolo filamento di DNA da utilizzare come modello per la reazione di sequenziamento. Un terzo primer di sequenziamento viene quindi ricotto sul filamento biotinilato trattenuto, che consente di distribuire la sintesi del DNA nascente come desossinucleotidi in un ordine predefinito nella camera di reazione. Il pirosequenziatore registra la quantità di ciascuna base incorporata sulla base di una lettura luminescente, consentendo la quantificazione relativa degli alleli mitocondriali mutanti e wild-type sulla sintesi del DNA (Figura 1B). La luminescenza è generata da un enzima luciferasi, che emette luce in presenza di ATP che una ATP solforilasi sintetizza de novo ad ogni evento di incorporazione dai pirofosfati rilasciati da ciascun nucleotide. Queste due reazioni possono essere riassunte come segue:
1. PPi (dall'incorporazione nucleotidica) + APS → ATP + solfato (ATP sulfurilasi)
2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PPi + ossiluciferina + CO2 + luce (luciferasi)
Rilevare le basi di adenina dal pirosequenziatore senza che l'ATP reagisca in modo incrociato con la luciferasi nella seconda reazione è una sfida. Tuttavia, questo è risolto utilizzando un analogo dell'adenina per la sintesi del DNA, vale a dire dATPαS. Nonostante non sia un substrato perfetto per la luciferasi, produce una luminescenza più forte rispetto agli altri tre nucleotidi, che viene regolata digitalmente dal pirosequenziatore e impostata su un fattore di 0,9. A causa di questa variabilità intrinseca, si suggerisce di evitare il sequenziamento dell'adenina nella posizione SNP (vedere la discussione per ulteriori dettagli).
Il seguente protocollo descrive in dettaglio il metodo di valutazione dell'eteroplasmia del mtDNA mediante pirosequenziamento e delinea le precauzioni necessarie nella progettazione dei primer di amplificazione per evitare pregiudizi biologici o tecnici durante la genotipizzazione degli SNP nel mtDNA. Quest'ultimo comporta il rilevamento digitale e la selezione dei set di primer, l'ottimizzazione della PCR di preamplificazione e, infine, il sequenziamento e il perfezionamento del test. Vengono dimostrati due saggi di esempio applicati: in primo luogo, l'ottimizzazione della più comune variante patogena umana m.3243A>G18 e, in secondo luogo, la genotipizzazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che hanno subito lo spostamento dell'eteroplasmia utilizzando tecnologie sviluppate presso il laboratorio Minczuk di Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Le mutazioni nel genoma mitocondriale (mtDNA) sono state associate a malattie genetiche ereditarie materne. Tuttavia, l'interesse per i polimorfismi del mtDNA è aumentato negli ultimi anni a causa della capacità recentemente sviluppata di produrre modelli mediante mutagenesi del mtDNA e di un nuovo apprezzamento dell'associazione tra aberrazioni genetiche mitocondriali e malattie comuni legate all'età come cancro, diabete e demenza. Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento per sintesi ampiamente impiegata in tutto il campo mitocondriale per esperimenti di genotipizzazione di routine. La sua relativa convenienza rispetto ai metodi di sequenziamento parallelo massiccio e la facilità di implementazione ne fanno una tecnica inestimabile nel campo della genetica mitocondriale, consentendo la rapida quantificazione dell'eteroplasmia con maggiore flessibilità. Nonostante la praticità di questo metodo, la sua implementazione come mezzo di genotipizzazione del mtDNA richiede l'osservanza di alcune linee guida, in particolare per evitare determinati pregiudizi di origine biologica o tecnica. Questo protocollo delinea i passaggi e le precauzioni necessarie nella progettazione e nell'implementazione di saggi di pirosequenziamento da utilizzare nel contesto della misurazione dell'eteroplasmia.

Questa sezione presenta un esempio di ottimizzazione di un saggio di pirosequenziamento per una mutazione patogena del mtDNA umano, nonché i dati di sequenziamento dalla genotipizzazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF) eteroplasmatici (m.5024C>T) trattati con nucleasi mitocondriali a dita di zinco (mtZFN). L'ottimizzazione del test per le cellule umane e il confronto di due diversi saggi dimostra come selezionare quello più accurato, mentre la genotipizzazione delle cellule MEF geneticamente modificate nel seco...

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Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

I saggi di pirosequenziamento consentono la genotipizzazione robusta e rapida dei polimorfismi a singolo nucleotide del DNA mitocondriale in cellule o tessuti eteroplasmatici.

Polimorfismi genotidici a singolo nucleotide nel genoma mitocondriale mediante pirosequenziamento

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento per sintesi che può essere utilizzata per genotipizzare polimorfismi a singolo nucleotide nel DNA mitocondriale. Questo metodo è vantaggioso nella sua facilità di implementazione e convenienza rispetto ad altri metodi di sequenziamento. Può essere facilmente utilizzato come metodo diagnostico per alcune malattie mitocondriali determinando i valori di eteroplasmia delle varianti patogene nel DNA mitocondriale.Per iniziare, ottenere un file di sequenza del DNA mitocondriale per la specie da genotipizzare e identificare la posizione del polimorfismo a singolo nucleotide, o SNP. Assicurarsi che la sequenza di riferimento utilizzata utilizzi la numerazione di base appropriata per la mutazione studiata in modo che la posizione dell'SNP possa essere facilmente identificata. Copiare 1.000 coppie di basi a monte e a valle del sito SNP e incollare la sequenza troncata nel software di progettazione del primer di pirosequenziamento.Evidenziare la base polimorfica, fare clic con il pulsante destro del mouse su di essa, quindi selezionare Imposta regione di destinazione per impostare la base SNP analizzata come destinazione del saggio di pirosequenziamento. Premi l'icona Play nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia per avviare la selezione del primer e attendi che il software generi automaticamente i trii di primer, due primer per la preamplificazione del DNA del modello e il terzo primer per il sequenziamento mediante sintesi nella macchina di pirosequenziamento. Fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Copia tutti i set di primer per conservare tutti i set di primer.Aprire il software di esecuzione fornito con il pirosequenziatore, selezionare Nuovo test, quindi selezionare il modello di saggio di quantificazione allelico. Inserire la sequenza da analizzare nella casella corrispondente digitando i nucleotidi direttamente a valle del primer di sequenziamento. Per la posizione variabile, indicare le due possibili basi, separate da una barra.Premere Genera ordine di dispensazione e lasciare che il software determini automaticamente un ordine adatto per i nucleotidi da erogare nel sequenziamento per reazione di sintesi. Salvare e specificare un nome per il test. Successivamente, eseguire la corsa diluendo il DNA da analizzare a 5 nanogrammi per microlitro.Nella prima esecuzione, assicurarsi di includere campioni di eteroplasmia nota come riferimento e campioni wild-type. Quindi eseguire una PCR di presequenziamento di 5 microlitri di DNA diluito e reazioni da 25 microlitri, utilizzando i primer e i parametri di amplificazione. Per eseguire l'impostazione del file, selezionare Nuova esecuzione nel software pirosequenziale.Il pirosequenziatore può sequenziare simultaneamente 48 reazioni preamplificate separate con un quadrato vuoto che rappresenta un singolo pozzo di sequenziamento su un disco di pirosequenziamento. Caricare i saggi facendo clic con il pulsante destro del mouse su un quadrato e selezionando Carica test. Se necessario, sequenziare fino a quattro saggi separati con diversi primer di sequenziamento.Impostare la modalità di dispensazione del primer su automatica per assegnare automaticamente una camera di iniezione per ciascun primer di sequenziamento utilizzato per la corsa. Impostare la modalità di esecuzione su standard, a meno che non si eseguano quattro diversi tipi di test su un disco di sequenziamento. Assicurarsi che il numero di test sul file modello di esecuzione corrisponda al numero di reazioni PCR amplificate.Quindi salvare i file eseguiti su un'unità USB. Per innescare il pirosequenziatore, premere il pulsante di pulizia sul touchscreen principale del dispositivo e pulire tutti gli iniettori con acqua ad alta purezza, seguendo le istruzioni sullo schermo. Quando si inserisce la striscia assorbente nella macchina, assicurarsi che le estremità si incontrino nella posizione a ore 9.Dopo aver collegato la chiavetta USB, premere il pulsante Sequenza per caricare i file di esecuzione preparati in precedenza. Seguire le istruzioni sul dispositivo per caricare e innescare i reagenti, come richiesto, negli iniettori corrispondenti sulla macchina. Caricare 3 microlitri di perline nei pozzetti, quindi caricare 10 microlitri di ciascuna reazione PCR da sequenziare nel campione corrispondente.Pipettare su e giù per mescolare il campione con le sfere magnetiche. Cerca l'indicazione nel pirosequenziatore innescato che il disco può essere caricato nella macchina. Svitare il dado di fissaggio della piastra e allineare la piastra di campionamento caricata con il perno metallico nello scomparto del disco.Una volta che la piastra è saldamente avvitata nel vano della piastra, avviare la sequenza premendo il pulsante di avvio sull'interfaccia touchscreen. Una volta completata l'esecuzione, rimuovere l'unità USB dalla macchina e ricollegarla al computer su cui è in esecuzione il software pirosequenziale. Dopo che il file di esecuzione appena generato viene visualizzato sull'unità USB, fare doppio clic sul file dei risultati dell'esecuzione.Questo analizza automaticamente l'uscita della luciferasi di ciascun pozzetto al momento dell'incorporazione nucleotidica e quantifica l'allele mitocondriale di interesse. Cerca i punteggi dei colori mostrati dal software in base alla qualità delle letture. Per salvare i risultati, selezionare Report nella finestra superiore, seguito da Report completo per generare un file PDF contenente i pirogrammi e i risultati di ciascun pozzetto della corsa.In alternativa, scaricare i risultati in altri formati nella scheda Report. Elettroforesi su gel di agarosio di un'amplificazione PCR utilizzando i primer di amplificazione di entrambi i set selezionati per la mutazione m. 3243A>G come mostrato in questa figura.Qui, Het indica il campione quasi omoplasmatico m. 3243A>G da analizzare. In questa figura è riportato un confronto delle prestazioni di entrambi i set di primer utilizzando standard molari per la calibrazione.I valori misurati sono indicati dalle linee tratteggiate verticali. Viene visualizzata una funzione lineare X = Y per illustrare quanto ciascuno dei due saggi testati sia vicino a una misurazione ideale. I nomi delle linee cellulari sull'asse X sono i nomi dei vari cloni di cibridi che sono stati genotipizzati usando questo test.I risultati della genotipizzazione su quattro cloni di cibridi di eteroplasmia m. 3243A>G sconosciuta utilizzando entrambi i saggi sono mostrati qui. Il sequenziamento è stato eseguito in triplice copia tecnica.I risultati della genotipizzazione delle cellule trattate con nucleasi a dita di zinco mitocondriale, insieme ai controlli non trattati e trattati con simulazione, e i pirogrammi di due repliche di PCR di campioni di cellule MEF utilizzate per generare i risultati, nonché il controllo di genotipizzazione wild-type sono mostrati qui. Il pirosequenziamento può essere utilizzato come lettura per esperimenti di terapia genica per valutare varie tecnologie di terapia genica nel DNA mitocondriale.

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