Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
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このプロトコルの実例として使用されるm.3243A>Gサイブリッド細胞を調製および提供してくれたSilvia MarchetとConstanza Lamperti(Istituto Neurologico "Carlo Besta"、Fondazione IRCCS、ミラノ)に感謝します。また、ミトコンドリア遺伝学グループ(MRC-MBU、ケンブリッジ大学)のメンバーに、この研究の過程で有益な議論をしていただき、感謝したいと思います。この研究は、英国医学研究評議会(MC_UU_00015/4およびMC_UU_00028/3)からのコア資金によってサポートされました。P.A.N. および P.S.-P.さらに、それぞれリリー財団とチャンプ財団によってサポートされています。

この研究で使用されたヒト3243A>Gサイブリッド細胞および不死化m.5024C>T MEFの使用について、インフォームドコンセントが提供されました。この場合、患者の細胞はケンブリッジ大学で収集されなかったため、倫理的承認は必要ありませんでした。しかしながら、ヒト線維芽細胞の使用は倫理的承認を必要とするかもしれない。パイロシーケンシング用のサンプルDNAを調製する際には、PCRセッ?...

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

プロトコルの成功のための重要な側面は、特に少量の出発物質を使用する場合に、汚染を回避することです。サンプルを調製する際には、可能な限りUVフードとフィルター付きピペットチップを使用し、プリアンプとポストアンプの領域を分離することをお勧めします。ブランク測定値および既知のヘテロプラスミー(野生型DNAなど)のサンプルは、技術的または生物学的バイアスをチェックす...

ミトコンドリアゲノムは、マトリックスと呼ばれるミトコンドリアの最も内側のコンパートメントに存在する小さな(16.5kb)環状分子(mtDNA)の形で存在し、ミトコンドリア呼吸鎖の13のサブユニット、およびミトコンドリアリボソーム1によるその場での翻訳に必要なtRNAおよびrRNAをコードします。このゲノムは、ミトコンドリアの機能に必要なすべてのタンパク質の約1%を占め、残りは核DNA(nDNA)によってコードされています。ミトコンドリアは、アルファプロテオバクテリアの祖先と祖先の真核細胞との間の内部共生融合イベントに由来すると一般に考えられています。この仮説的な共生が起こると、ミトコンドリアの遺伝情報は長い年月をかけて徐々に核に移され、現代のシアノバクテリアのゲノムと比較した場合のmtDNAの前述のコンパクトさを説明しています2。このような遺伝子の伝達は、mtDNAに見られる配列と非常に相同なnDNAの長いストレッチの存在によって最も強く証明されます。これらの核ミトコンドリア配列(NMT)は、ジェノタイピング中の誤解の一般的な原因であり、mtDNA3をジェノタイピングする際に核バイアスを回避するために特定の予防措置を講じる必要があります(図1A)。
mtDNAのもう一つの特徴は、そのコピー数が細胞の種類によって異なり、細胞あたり数万コピーから数千のコピー数であることです4。このマルチコピーの性質により、mtDNAは単一細胞内に幅広い遺伝子型を保持することができ、染色体の接合性を考慮すると、核遺伝子に関連する個別の対立遺伝子とは対照的に、対立遺伝子のより連続的な分布をもたらす可能性があります。ミトコンドリア対立遺伝子のこの不均一性はミトコンドリアヘテロプラスミーと呼ばれ、通常、特定の細胞内の全mtDNAの割合としての特定の突然変異の有病率で表されます。ヘテロプラスミーは、細胞全体に存在するmtDNAのユニークな種を指すホモプラスミーとは対照的です。
ミトコンドリアヘテロプラスミーの測定は、病原性多様体を有するmtDNA分子の割合を定量する際に特に興味深い。このような変異体は、一塩基多型(SNP)、小さなインデル、または大規模な欠失の形で提供されます5。ほとんどの人間は病原性多様体に対して異質です。しかし、それらは臨床表現型を示さず、閾値効果6と呼ばれる現象において病原性mtDNAのより高いヘテロプラスミーレベルでのみ現れることがよくあります。病原性に関連する値は、病原性突然変異の性質とそれが発生する組織に大きく依存しますが、通常、60%を超えるヘテロプラスミー7にあります。
ミトコンドリアのジェノタイピングが一般的であるいくつかの研究分野があります。医療分野では、mtDNA変異の検査や定量化は、mtDNA異常を起源とするミトコンドリア病の診断基準となります5。ヒト病原性変異の研究に加えて、ミトコンドリアを標的とするDddA由来シトシン塩基エディター(DdCBE)8およびアデニン塩基編集のためのTALEベースのデアミナーゼ(TARED)9によって可能になったミトコンドリア塩基編集の最近の出現を考えると、mtDNAに病原性SNPを保持する動物モデルの有病率は増加する可能性があります.このアプローチは、異常なミトコンドリア遺伝子型と結果として生じる機能障害との間の相互作用を理解するのに役立ちます。ヘテロプラスミーシフトとして知られるアプローチを介して、ヒトミトコンドリア疾患の治療戦略として最終的に使用するためにミトコンドリアゲノムをリモデリングすることに関する科学的研究も進行中です。この研究分野は、主に突然変異特異的ヌクレアーゼをミトコンドリアマトリックスに向けることを含みます。これは病原性mtDNAの優先的な分解をもたらし、表現型10、11、12、13における救済をもたらす。ミトコンドリア遺伝子型のリモデリングを含む実験には、ヘテロプラスミーシフトを評価するための堅牢な定量的方法が必要です。
mtDNAの遺伝子形成にはさまざまな方法が使用されており、これらは突然変異の性質によって異なります。次世代シーケンシング(NGS)法は、mtDNA中のSNPの定量に関してはより正確です。しかしながら、これらの方法は、特にサンプル数が少ない場合、ミトコンドリアヘテロプラスミーの日常的な定量には法外に高価である。サンガーシーケンシングは、SNPの検出も可能にします。ただし、このアプローチは定量的ではなく、低レベルのヘテロプラスミーを検出できないか、高ヘテロプラスミーを推定するときに不正確になる可能性があります。パイロシーケンシングは、最小限の調製で、あらゆるmtDNAサンプルのヘテロプラスミーの迅速な定量を可能にするアッセイとして、これら2つの両極端の間の適切な妥協点として提案されています。この方法は、法医学的分析14,15、臨床診断16、または単一細胞からのmtDNAのジェノタイピング17など、さまざまな状況で多くの研究者によってミトコンドリアSNPを定量するために日常的に使用されてきました。
このアッセイでは、mtDNA中のSNPに隣接する領域の最初のPCR前増幅ステップが含まれ、その後、以前に生成されたアンプリコンの1本鎖を使用した合成によるシーケンシングアッセイが続きます。前増幅ステップで使用される2つのプライマーのうちの1つは、5'末端でビオチン化されている必要があり、これにより、パイロシーケンシング装置は、シーケンシング反応のテンプレートとして使用するDNAの一本鎖を単離することができます。次に、3番目のシーケンシングプライマーが保持されたビオチン化鎖上にアニーリングされ、デオキシヌクレオチドとしての新生DNA合成を事前定義された順序で反応チャンバーに分注することができます。パイロシーケンサーは、発光読み出しに基づいて組み込まれた各塩基の量を記録し、DNA合成時に変異型および野生型のミトコンドリア対立遺伝子の相対定量を可能にします(図1B)。発光はルシフェラーゼ酵素によって生成され、ATPの存在下で発光し、ATPスルフリラーゼは各ヌクレオチドによって放出されたピロリン酸から各取り込みイベントで de novo を合成します。これら2つの反応は次のように要約できます。
1. PPi (ヌクレオチドの取り込みから)+ APS → ATP +硫酸塩(ATPスルフリラーゼ)
2. ATP +ルシフェリン+ O 2 →AMP + PPi +オキシルシフェリン+ CO2 +光(ルシフェラーゼ)
2番目の反応でATPがルシフェラーゼと交差反応することなく、パイロシーケンサーによってアデニン塩基を検出することは課題です。しかしながら、これはDNA合成のためのアデニン類似体、すなわちdATPαSを使用することによって解決される。ルシフェラーゼの完全な基質ではありませんが、パイロシーケンサーによってデジタル調整され、0.9の係数に設定される他の3つのヌクレオチドと比較して、より強い発光を生成します。この固有の変動性のために、SNP位置でのアデニンの配列決定を避けることが示唆されている(詳細については議論を参照)。
以下のプロトコルは、パイロシーケンシングによるmtDNAヘテロプラスミー評価の方法を詳述し、mtDNA中のSNPをジェノタイピングする際の生物学的または技術的バイアスを回避するために増幅プライマーを設計する際に必要な予防措置を概説します。後者では、プライマーセットのデジタル調査と選択、前増幅PCRの最適化、そして最後にアッセイのシーケンシングと精製が行われます。2つの応用例のアッセイが実証されています:第一に、最も一般的なヒト病原性多様体m.3243A>G18の最適化、第二に、ケンブリッジのMinczuk研究所で開発された技術を使用してヘテロプラスミーシフトを受けたマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞のジェノタイピング10,11,12,19,20,21,22。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の変異は、母性遺伝性の遺伝病と関連しています。しかし、近年、mtDNA変異誘発によるモデル作製能力が発達し、ミトコンドリアの遺伝子異常とがん、糖尿病、認知症などの一般的な加齢性疾患との関連が新たに認識されたため、mtDNA多型への関心が高まっています。パイロシーケンシングは、日常的なジェノタイピング実験のためにミトコンドリア分野全体で広く採用されている合成によるシーケンシング技術です。大規模な並列シーケンシング法と比較した場合の比較的手頃な価格と実装の容易さにより、ミトコンドリア遺伝学の分野で非常に貴重な技術となり、柔軟性を高めたヘテロプラスミーの迅速な定量が可能になります。この方法の実用性にもかかわらず、mtDNAジェノタイピングの手段としてのその実施は、特に生物学的または技術的起源の特定のバイアスを回避するために、特定のガイドラインの観察を必要とする。このプロトコルは、ヘテロプラスミー測定のコンテキストで使用するためのパイロシークエンシングアッセイを設計および実装する際に必要な手順と注意事項を概説します。

このセクションでは、ヒト病原性mtDNA変異に対するパイロシーケンシングアッセイの最適化例と、ミトコンドリアジンクフィンガーヌクレアーゼ(mtZFN)で処理したヘテロプラズマ(m.5024C>T)マウス胚性線維芽細胞(MEF)のジェノタイピングデータを紹介します。ヒト細胞のアッセイを最適化し、2つの異なるアッセイを比較すると、最も正確なアッセイを選択する方法が示されますが、2番目の例の遺?...

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Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

パイロシーケンシングは、ミトコンドリアDNAの一塩基多型の遺伝子型決定に使用できる合成技術によるシーケンシングです。この方法は、他のシーケンシング方法と比較して、実装が容易で費用対効果が高いという点で有利です。ミトコンドリアDNA中の病原性多様体のヘテロプラスミー値を決定することにより、特定のミトコンドリア病の診断方法として簡単に使用できます。まず、遺伝子型決定される種のミトコンドリアDNA配列ファイルを取得し、一塩基多型(SNP)の位置を特定します。使用する参照配列が、SNPの位置を容易に識別できるように、研究された変異に適切な塩基番号付けを採用していることを確認してください。SNPサイトの上流および下流に1, 000塩基対をコピーし、切捨てた配列をパイロシーケンシングプライマー設計ソフトウェアに貼り付けます。多型塩基を強調表示して右クリックし、[ターゲット領域の設定] を選択して、分析された SNP 塩基をパイロシーケンシングアッセイのターゲットとして設定します。インターフェースの右上隅にある再生アイコンを押してプライマー選択を開始し、ソフトウェアがプライマートリオ、テンプレートDNAの予備増幅用の2つのプライマー、およびパイロシークエンシングマシンでの合成によるシーケンシング用の3番目のプライマーを自動的に生成するのを待ちます。右クリックしてすべてのプライマーセットをコピーを選択し、すべてのプライマーセットを保持します。パイロシーケンサーに付属のランソフトウェアを開き、新規アッセイを選択してから、対立遺伝子定量アッセイテンプレートを選択します。シーケンシングプライマーの直下流にヌクレオチドを入力して、対応するボックスに分析する配列を入力します。可変位置については、スラッシュで区切られた2つの可能な基数を示します。[分注順序の生成]を押すと、合成反応によるシーケンシングで分注するヌクレオチドの適切な順序をソフトウェアが自動的に決定します。保存し、アッセイの名前を指定します。次に、分析対象のDNAをマイクロリットル当たり5ナノグラムに希釈してランを実行する。最初の実行では、既知のヘテロプラスミーのサンプルを基準として、野生型サンプルを含めるようにしてください。次に、増幅プライマーとパラメーターを使用して、5マイクロリットルの希釈DNAと25マイクロリットルの反応のプレシーケンシングPCRを実行します。ファイルのセットアップを実行するには、パイロシーケンサー ソフトウェアで [新しい実行] を選択します。パイロシーケンサーは、パイロシーケンシングディスク上の単一のシーケンシングウェルを表す空の正方形で、48の別々のプリアンプ反応を同時にシーケンスできます。四角形を右クリックしてLoad Assayを選択することにより、アッセイをロードします。必要に応じて、異なるシーケンシングプライマーで最大4つのアッセイをシーケンシングできます。プライマーディスペンセーションモードを自動に設定すると、ランに使用されるシーケンシングプライマーごとに注入チャンバーが自動的に割り当てられます。1つのシーケンシングディスクで4種類のアッセイを実行する場合を除き、ランモードを標準に設定します。ランテンプレートファイルのアッセイ数が、増幅されるPCR反応の数と一致していることを確認します。次に、実行ファイルをUSBドライブに保存します。パイロシーケンサーをプライミングするには、デバイスのメインタッチスクリーンにあるクリーニングボタンを押し、画面の指示に従って、すべてのインジェクターを高純度の水でクリーニングします。吸収ストリップを機械に挿入するときは、端が9時の位置で接触していることを確認してください。USBスティックを接続した後、シーケンスボタンを押して、前に準備した実行ファイルをロードします。デバイスの指示に従って、必要に応じて試薬をマシンの対応するインジェクターにロードしてプライミングします。3マイクロリットルのビーズをウェルにロードし、次に10マイクロリットルの各PCR反応をロードして、対応するサンプルにシーケンスします。上下にピペットで移動し、サンプルを磁気ビーズと混合します。プライミングされたパイロシーケンサーで、ディスクをマシンにロードできるという表示を探します。プレート保持ナットを緩め、ロードされたサンプルプレートをディスクコンパートメントの金属ピンに合わせます。プレートがプレートコンパートメントにしっかりとねじ込まれたら、タッチスクリーンインターフェイスのスタートボタンを押してシーケンスランを開始します。実行が完了したら、マシンからUSBドライブを取り外し、パイロシーケンサーソフトウェアを実行しているコンピューターに接続し直します。新しく生成された実行ファイルがUSBドライブに表示されたら、実行結果ファイルをダブルクリックします。これにより、ヌクレオチド組み込み時の各ウェルのルシフェラーゼ出力を自動的に分析し、目的のミトコンドリア対立遺伝子を定量化します。読み取りの品質に基づいてソフトウェアによって表示されるカラースコアを探します。結果を保存するには、上部のウィンドウで[レポート]を選択し、続いて[完全なレポート]を選択して、実行の各ウェルからのパイログラムと結果を含むPDFファイルを生成します。または、[レポート] タブで他の形式で結果をダウンロードします。この図に示すようにm.3243A>G変異に対して選択された両方のセットからの増幅プライマーを用いたPCR増幅のアガロースゲル電気泳動。ここで、Hetは、分析されるほぼホモプラズムm.3243A>Gサンプルを示す。キャリブレーションにモル標準を使用した両方のプライマーセットの性能の比較をこの図に示します。測定値は縦の点線で示しています。X=Y線形関数が表示され、テストされた2つのアッセイのそれぞれが理想的な測定値にどれだけ近いかが示されます。X軸上の細胞株の名前は、このアッセイを用いて遺伝子型決定された様々なサイブリッドクローンの名前である。両方のアッセイを用いた未知のm.3243A>Gヘテロプラスミーの4つのサイブリッドクローンのジェノタイピング結果をここに示す。配列決定は、技術的なトリプリケートで行った。ミトコンドリアジンクフィンガーヌクレアーゼ処理細胞、未処理および模擬処理コントロールのジェノタイピング結果、および結果の生成に使用された2つのMEF細胞サンプルPCR複製および野生型ジェノタイピングコントロールからのパイログラムをここに示します。パイロシークエンシングは、ミトコンドリアDNAのさまざまな遺伝子治療技術を評価するための遺伝子治療実験の読み出しとして使用できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

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Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

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Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

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