Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Vi takker Silvia Marchet og Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) for å forberede og levere m.3243A>G cybridceller som brukes som illustrerende eksempler for denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne medlemmene av Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) for nyttig diskusjon i løpet av denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av kjernefinansiering fra Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 og MC_UU_00028/3). P.A.N. og P.S.-P. støttes i tillegg av henholdsvis The Lily Foundation og The Champ Foundation.

Informert samtykke ble gitt for bruk av humane 3243A>G cybridceller og de udødeliggjorte m.5024C>T MEFene som ble brukt i denne studien. Etisk godkjenning var ikke nødvendig i dette tilfellet, da pasientcellene ikke ble samlet inn ved University of Cambridge. Bruk av humane fibroblaster kan imidlertid kreve etisk godkjenning. Det anbefales sterkt å følge beste praksis for PCR-oppsett når du klargjør prøve-DNA for pyrosekvensering. Hyppig amplifikasjon med identiske primere kan føre til amplikontaminering og intro...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Et kritisk aspekt for protokollens suksess er å unngå forurensninger, spesielt ved bruk av lave mengder utgangsmateriale. Det anbefales å bruke en UV-hette og filtrerte pipettespisser når prøvene tilberedes der det er mulig, samt å holde forforsterker- og etterforsterkningsområdene atskilt. Blanke målinger og prøver av kjent heteroplasmi (som villtype-DNA) bør alltid inkluderes for å brukes som målestokk for å kontrollere for teknisk eller biologisk skjevhet. 
En bemerkelsesverdig...

Mitokondriegenomet eksisterer i form av små (16, 5 kb) sirkulære molekyler (mtDNA) tilstede i det innerste rommet i mitokondriene kalt matrisen og koder for 13 underenheter av mitokondriell respiratorisk kjede, samt tRNA og rRNA som er nødvendige for deres oversettelse in situ av mitokondriell ribosom1. Dette genomet representerer ca. 1% av alle proteiner som er nødvendige for mitokondriell funksjon, hvorav resten er kodet av nukleært DNA (nDNA). Det antas vanligvis at mitokondrier er avledet fra en endosymbiotisk fusjonshendelse mellom en alfa-proteobakteriell forfader og en forfedre eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiosen fant sted, ble den genetiske informasjonen til mitokondriene gradvis overført til kjernen over eoner, noe som forklarer den nevnte kompaktiteten til mtDNA sammenlignet med genomene til moderne cyanobakterier2. En slik overføring av gener er sterkest bevist av eksistensen av lange strekninger av nDNA som er svært homologe med sekvensene som finnes i mtDNA. Disse nukleære mitokondriesekvensene (NUMT) er en vanlig kilde til feiltolkning under genotyping, og visse forholdsregler må tas for å unngå nukleære skjevheter ved genotyping av mtDNA3 (figur 1A).
Et annet karakteristisk trekk ved mtDNA er at kopinummeret varierer avhengig av celletype, og nummererer alt fra titusenvis til tusenvis av kopier per celle4. På grunn av denne multikopieringsnaturen kan mtDNA ha et bredt spekter av genotyper i en enkelt celle, noe som kan resultere i en mer kontinuerlig fordeling av alleler i motsetning til de diskrete allelene assosiert med nukleære gener når man vurderer zygositeten til kromosomer. Denne heterogeniteten av mitokondrielle alleler blir referert til som mitokondriell heteroplasmi, som vanligvis uttrykkes i prosentvis prevalens av en gitt mutasjon som en andel av det totale mtDNA i en gitt celle. Heteroplasmy kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til at en unik art av mtDNA er tilstede over en celle.
Måling av mitokondriell heteroplasmy er av spesiell interesse når man kvantifiserer andelen mtDNA-molekyler som har patogene varianter. Slike varianter kommer i form av single nucleotide polymorphisms (SNPs), små indels eller store delesjoner5. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; Imidlertid viser de ingen kliniske fenotyper, som ofte bare manifesterer seg ved høyere heteroplasminivåer av patogent mtDNA i et fenomen referert til som terskeleffekten6. Mens verdiene assosiert med patogenisitet er svært avhengige av arten av den patogene mutasjonen og vevet der den forekommer, ligger de vanligvis over 60% heteroplasmy7.
Det er flere forskningsområder der mitokondriell genotyping er vanlig. På det medisinske området kan testing for eller kvantifisering av mtDNA-mutasjoner tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesykdommer, hvorav mange har mtDNA-avvik som opprinnelse5. I tillegg til studiet av humanpatogene mutasjoner, vil forekomsten av dyremodeller som inneholder patogene SNPer i mtDNA sannsynligvis øke, gitt den nylige fremkomsten av mitokondriell baseredigering aktivert av mitokondrielt målrettede DddA-avledede cytosinbaseredaktører (DdCBEs)8 og TALE-baserte deaminaser (TALEDs) for adeninbaseredigering9. Denne tilnærmingen vil være medvirkende til å forstå samspillet mellom avvikende mitokondrielle genotyper og de resulterende dysfunksjonene. Det er også pågående vitenskapelig forskning for å omforme mitokondriegenomet til ultimat bruk som en terapeutisk strategi i menneskelige mitokondrielle sykdommer via en tilnærming kjent som heteroplasmi-skifting. Dette forskningsfeltet innebærer primært å lede mutasjonsspesifikke nukleaser til mitokondriematrisen; Dette resulterer i fortrinnsvis nedbrytning av patogent mtDNA, noe som fører til redning i fenotype10,11,12,13. Eventuelle eksperimenter som involverer remodellering av mitokondriell genotype krever en robust kvantitativ metode for å vurdere heteroplasmiskift.
Et bredt spekter av metoder brukes til å genotype mtDNA, og disse varierer i henhold til mutasjonens natur. Neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) er mer presise når det gjelder kvantifisering av SNP-er i mtDNA; Imidlertid forblir disse metodene uoverkommelig dyre for rutinemessig kvantifisering av mitokondriell heteroplasmi, spesielt hvis antall prøver er små. Sanger-sekvensering kan også tillate deteksjon av SNP-er; Denne tilnærmingen er imidlertid ikke kvantitativ og klarer ofte ikke å oppdage lave nivåer av heteroplasmi eller kan være unøyaktig når man estimerer høye heteroplasmier. Pyrosekvensering, som en analyse som involverer minimal forberedelse og muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromiss mellom disse to ytterpunktene. Denne metoden har blitt brukt rutinemessig for å kvantifisere mitokondrielle SNPs av mange forskere i ulike sammenhenger, inkludert rettsmedisinsk analyse 14,15, klinisk diagnose16, eller genotyping av mtDNA fra enkeltceller17.
Denne analysen innebærer et første PCR-forsterkningstrinn i en region som flankerer SNP i mtDNA, som etterfølges av en sekvenserings-for-syntese-analyse ved bruk av en streng av den tidligere genererte amplikonen. En av de to primerne som brukes i foramplifiseringstrinnet må biotinyleres på 5'-enden, noe som vil gjøre det mulig for pyrosekvenseringsapparatet å isolere den ene DNA-strengen som skal brukes som mal for sekvenseringsreaksjonen. En tredje sekvenseringsprimer blir deretter glødet på den beholdte biotinylerte strengen, noe som gjør det mulig for begynnende DNA-syntese som deoksynukleotider som skal dispenseres i en forhåndsdefinert rekkefølge i reaksjonskammeret. Pyrosequenceren registrerer mengden av hver base innlemmet basert på en luminescerende avlesning, noe som tillater den relative kvantifiseringen av mutante og villtype mitokondrielle alleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres av et luciferase-enzym, som avgir lys i nærvær av ATP som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringshendelse fra pyrofosfatene frigjort av hvert nukleotid. Disse to reaksjonene kan oppsummeres som følger:
1. PPi (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylase)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oksyluciferin + CO2 + lys (luciferase)
Å oppdage adeninbaser av pyrosequenceren uten at ATP kryssreagerer med luciferase i den andre reaksjonen er en utfordring. Dette løses imidlertid ved å bruke en adeninanalog for DNA-syntese, nemlig dATPαS. Til tross for at det ikke er et perfekt substrat for luciferase, produserer det en sterkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotidene, som er digitalt justert av pyrosequenceren og satt til en faktor på 0,9. På grunn av denne iboende variasjonen foreslås det å unngå sekvensering av adenin ved SNP-posisjonen (se diskusjonen for ytterligere detaljer).
Følgende protokoll beskriver metoden for mtDNA-heteroplasmivurdering ved pyrosekvensering og skisserer de nødvendige forholdsregler ved utforming av amplifikasjonsprimere for å unngå biologisk eller teknisk skjevhet ved genotyping av SNPer i mtDNA. Sistnevnte innebærer digital kartlegging og valg av primersettene, optimalisering av forforsterker-PCR, og til slutt sekvensering og raffinering av analysen. To anvendte eksempelanalyser er demonstrert: For det første optimalisering av den vanligste humanpatogene varianten m.3243A>G18, og for det andre genotyping av musembryonale fibroblastceller (MEF) som har gjennomgått heteroplasmiskifting ved hjelp av teknologier utviklet ved Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutasjoner i mitokondriegenomet (mtDNA) har vært assosiert med maternelt arvelige genetiske sykdommer. Imidlertid har interessen for mtDNA-polymorfismer økt de siste årene på grunn av den nylig utviklede evnen til å produsere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse av sammenhengen mellom mitokondrielle genetiske avvik og vanlige aldersrelaterte sykdommer som kreft, diabetes og demens. Pyrosekvensering er en sekvenserings-for-syntese-teknikk som er mye brukt over mitokondriefeltet for rutinemessige genotypingseksperimenter. Dens relative overkommelighet sammenlignet med massive parallelle sekvenseringsmetoder og enkel implementering gjør det til en uvurderlig teknikk innen mitokondriell genetikk, noe som muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy med økt fleksibilitet. Til tross for den praktiske egenskapen til denne metoden, krever implementeringen som et middel til mtDNA-genotyping observasjon av visse retningslinjer, spesielt for å unngå visse forstyrrelser av biologisk eller teknisk opprinnelse. Denne protokollen skisserer de nødvendige trinnene og forholdsreglene ved utforming og implementering av pyrosekvenseringsanalyser for bruk i forbindelse med heteroplasmimåling.

Denne delen presenterer et eksempel på optimalisering av en pyrosekvenseringsanalyse for en human patogen mtDNA-mutasjon, samt sekvenseringsdata fra genotyping av heteroplasmatiske (m.5024C>T) embryonale fibroblaster (m.5024CT) fra mus (MEF) behandlet med mitokondrielle sinkfingernukleaser (mtZFNs). Optimalisering av analysen for humane celler og sammenligning av to forskjellige analyser demonstrerer hvordan man velger den mest nøyaktige, mens genotyping av genetisk modifiserte MEF-celler i det andre eksemplet tjener s...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pyrosekvenseringsanalyser muliggjør robust og rask genotyping av mitokondrielle DNA-enkeltnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiske celler eller vev.

Genotyping av enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondriegenomet ved pyrosekvensering

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosekvensering er en sekvensering ved synteseteknikk som kan brukes til å genotype enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondrielt DNA. Denne metoden er fordelaktig i sin enkle implementering og kostnadseffektivitet sammenlignet med andre sekvenseringsmetoder. Det kan lett brukes som en diagnostisk metode for visse mitokondrielle sykdommer ved å bestemme heteroplasmiverdier av patogene varianter i mitokondrielt DNA.For å begynne, få en mitokondriell DNA-sekvensfil for arten som genotypes og identifiser posisjonen til enkeltnukleotidpolymorfismen, eller SNP. Sørg for at referansesekvensen som brukes bruker riktig basenummerering for mutasjonen som studeres, slik at posisjonen til SNP lett kan identifiseres. Kopier 1.000 basepar oppstrøms og nedstrøms for SNP-området og lim inn den avkortede sekvensen i pyrosekvenseringsprogramvaren for primerdesign.Merk den polymorfe basen, høyreklikk på den, og velg deretter Angi målområde for å angi den analyserte SNP-basen som mål for pyrosekvenseringsanalysen. Trykk på Play-ikonet øverst til høyre i grensesnittet for å starte primervalget, og vent til programvaren automatisk genererer primertrioene, to primere for forsterkning av mal-DNA og den tredje primeren for sekvensering av syntesen i pyrosekvenseringsmaskinen. Høyreklikk og velg Kopier alle primersett for å beholde alle primersettene.Åpne kjøreprogramvaren som følger med pyrosequenceren, velg Ny analyse, og velg deretter malen for allelkvantifiseringsanalyse. Skriv inn sekvensen som skal analyseres i den tilsvarende boksen ved å skrive inn nukleotidene direkte nedstrøms for sekvenseringsprimeren. For den variable posisjonen, angi de to mulige basene, atskilt med en skråstrek.Trykk på Generer dispensasjonsrekkefølge, og la programvaren automatisk bestemme en passende rekkefølge for nukleotidene som skal dispenseres i sekvenseringen ved syntesereaksjon. Lagre, og angi et navn for analysen. Deretter utfører du kjøringen ved å fortynne DNA som skal analyseres til 5 nanogram per mikroliter.I første omgang må du sørge for å inkludere prøver av kjent heteroplasmi som referanse og villtypeprøver. Utfør deretter en presekvenserings-PCR på 5 mikroliter fortynnet DNA og 25 mikroliterreaksjoner, ved bruk av amplifikasjonsprimere og parametere. Hvis du vil kjøre filoppsettet, velger du Ny kjøring i pyrosequencerprogramvaren.Pyrosequenceren kan samtidig sekvensere 48 separate forforsterkede reaksjoner med en tom firkant som representerer en enkelt sekvenseringsbrønn på en pyrosekvenseringsplate. Last inn analysene ved å høyreklikke på en firkant og velge Last inn analyse. Om nødvendig, sekvenser opptil fire separate analyser med forskjellige sekvenseringsprimere.Sett primerdispensasjonsmodus til automatisk for automatisk å tilordne et injeksjonskammer for hver sekvenseringsprimer som brukes til kjøringen. Sett kjøremodus til standard, med mindre du kjører fire forskjellige typer analyser på én sekvenseringsplate. Kontroller at antall analyser på kjøremalfilen samsvarer med antall PCR-reaksjoner som forsterkes.Lagre deretter kjørefilene på en USB-stasjon. For å klargjøre pyrosequenceren, trykk på rengjøringsknappen på enhetens hovedberøringsskjerm og rengjør alle injektorer med vann med høy renhet, i henhold til instruksjonene på skjermen. Når du setter absorberstrimmelen inn i maskinen, må du sørge for at endene møtes i klokka 9.Etter at du har koblet til USB-pinnen, trykker du på sekvensknappen for å laste inn kjørefilene som er utarbeidet tidligere. Følg instruksjonene på enheten for å laste og klargjøre reagensene etter behov i de tilsvarende injektorene på maskinen. Legg 3 mikroliter perler i brønnene, og last deretter 10 mikroliter av hver PCR-reaksjon som skal sekvenseres i den tilsvarende prøven.Pipett opp og ned for å blande prøven med magnetkulene. Se etter indikasjonen i den primede pyrosequenceren om at platen kan lastes inn i maskinen. Skru av platens holdemutter, og juster den lastede prøveplaten med metallpinnen i platerommet.Når platen er godt skrudd inn i platerommet, starter du sekvenseringskjøringen ved å trykke på startknappen på berøringsskjermgrensesnittet. Når kjøringen er fullført, fjerner du USB-stasjonen fra maskinen og kobler den tilbake til datamaskinen som kjører pyrosequencer-programvaren. Etter at den nylig genererte kjørefilen vises på USB-stasjonen, dobbeltklikker du på Run Result-filen.Dette analyserer automatisk luciferaseutgangen av hver brønn ved nukleotidinkorporering, og kvantifiserer mitokondriallelen av interesse. Se etter fargepoengene som vises av programvaren basert på kvaliteten på lesingene. Hvis du vil lagre resultatene, velger du Rapporter i det øverste vinduet, etterfulgt av Full rapport for å generere en PDF-fil som inneholder pyrogrammer og resultater fra hver brønn i kjøringen.Du kan også laste ned resultatene i andre formater under Rapporter-fanen. Agarosegelelektroforese av en PCR-amplifikasjon ved bruk av amplifikasjonsprimere fra begge settene valgt for m. 3243A>G-mutasjonen som vist i denne figuren.Her betegner Het den nesten homoplasmatiske m. 3243A>G-prøven som skal analyseres. En sammenligning av ytelsen til begge primersettene ved bruk av molare standarder for kalibrering er vist i denne figuren.De målte verdiene er betegnet med de vertikale stiplede linjene. En X=Y lineær funksjon vises for å illustrere hvor nær hver av de to testede analysene er en ideell måling. Navnene på cellelinjene på X-aksen er navnene på de forskjellige cybridklonene som ble genotypet ved hjelp av denne analysen.Genotypingsresultater på fire cybridkloner av ukjent m. 3243A>G heteroplasmy ved bruk av begge analysene er vist her. Sekvensering ble utført i teknisk triplikat.Genotypingsresultater av mitokondrielle sinkfingernukleasebehandlede celler, sammen med ubehandlede og mockbehandlede kontroller, og pyrogrammene fra to MEF-celleprøve-PCR-replikater som brukes til å generere resultatene, samt genotypingskontrollen av villtype, er vist her. Pyrosekvensering kan brukes som en avlesning for genterapieksperimenter for å vurdere ulike genterapiteknologier i mitokondrielt DNA.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifisering av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon Innsettinger i solide svulster ved hjelp Linker-mediert PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Innsamling og Utvinning av spytt DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Ett-trinns dynamisk gjenoppliving av smil i Irreversible Facial Lammelse av Free Funksjonell Muscle Transfer

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal Optical Imaging<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av enkelt Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Imaging Metaller i hjernevev med laser ablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

En Ex Vivo vev kultur modell for Fibrovascular komplikasjoner i proliferativ diabetisk retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Artrose smertemodell indusert ved intraartikulær injeksjon av monojodacetat hos rotter

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Organ iskemi-reperfusjon skade ved å simulere hemoodynamiske endringer i rotte levertransplantasjon modell

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...