Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
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Gostaríamos de agradecer a Silvia Marchet e Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milão) pela preparação e fornecimento das células cybrid m.3243A>G usadas como exemplos ilustrativos para este protocolo. Gostaríamos também de agradecer aos membros do Grupo de Genética Mitocondrial (MRC-MBU, Universidade de Cambridge) pela discussão útil durante o curso desta pesquisa. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 e MC_UU_00028/3). P.A.N. e P.S.-P. são adicionalmente apoiados pela The Lily Foundation e The Champ Foundation, respectivamente.

Consentimento informado foi fornecido para o uso das células cybrid 3243A>G humanas e dos MEFs m.5024C>T imortalizados usados neste estudo. A aprovação ética não foi necessária neste caso, pois as células do paciente não foram coletadas na Universidade de Cambridge. O uso de fibroblastos humanos pode, no entanto, exigir aprovação ética. É altamente recomendável seguir as melhores práticas para a configuração do PCR ao preparar o DNA da amostra para pirosequenciamento. A amplificação frequente usando pri...

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. 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Um aspecto crítico para o sucesso do protocolo é evitar contaminações, especialmente quando se utilizam baixas quantidades de material de partida. Recomenda-se o uso de uma capa UV e pontas de pipeta filtradas ao preparar as amostras sempre que possível, bem como manter as áreas de pré-amplificação e pós-amplificação separadas. Medições em branco e amostras de heteroplasmia conhecida (como DNA selvagem) devem sempre ser incluídas para serem usadas como referência para verificar vieses técnicos ou biológ...

O genoma mitocondrial existe na forma de pequenas moléculas circulares (mtDNA de 16,5 kb) presentes no compartimento mais interno da mitocôndria, denominado matriz e codifica 13 subunidades da cadeia respiratória mitocondrial, bem como os RNAt e RNAr necessários para sua tradução in situ pelo ribossomo mitocondrial1. Este genoma representa aproximadamente 1% de todas as proteínas necessárias para a função mitocondrial, sendo o restante codificado pelo DNA nuclear (nDNA). É comumente assumido que as mitocôndrias são derivadas de um evento de fusão endossimbiótico entre um ancestral alfa-proteobacteriano e uma célula eucariótica ancestral. Uma vez ocorrida essa simbiose hipotética, a informação genética das mitocôndrias foi gradualmente transferida para o núcleo ao longo de eras, o que explica a já mencionada compacidade do mtDNA quando comparada aos genomas das cianobactériasmodernas2. Tal transferência de genes é mais fortemente evidenciada pela existência de longos trechos de nDNA que são altamente homólogos às sequências encontradas no mtDNA. Essas sequências mitocondriais nucleares (NUMTs) são uma fonte comum de interpretação errônea durante a genotipagem, e certos cuidados devem ser tomados para evitar vieses nucleares ao genotipar o mtDNA3 (Figura 1A).
Outra característica distintiva do mtDNA é que seu número de cópias varia dependendo do tipo celular, numerando de dezenas a milhares de cópias por célula4. Devido a essa natureza multicopiada, o mtDNA pode abrigar uma ampla gama de genótipos dentro de uma única célula, o que pode resultar em uma distribuição mais contínua de alelos em contraste com os alelos discretos associados a genes nucleares quando se considera a zigosidade dos cromossomos. Essa heterogeneidade dos alelos mitocondriais é referida como heteroplasmia mitocondrial, que é tipicamente expressa na prevalência percentual de uma dada mutação como uma proporção do mtDNA total em uma dada célula. A heteroplasmia pode ser contrastada com a homoplasmia, que se refere a uma espécie única de mtDNA estar presente em uma célula.
A mensuração da heteroplasmia mitocondrial é de particular interesse quando se quantifica a proporção de moléculas de mtDNA que abrigam variantes patogênicas. Tais variantes apresentam-se na forma de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), pequenos indéis ou deleções em grande escala5. A maioria dos seres humanos é heteroplasmática para variantes patogênicas; no entanto, não exibem fenótipos clínicos, que muitas vezes só se manifestam em níveis mais elevados de heteroplasmia do mtDNA patogênico, em um fenômeno denominado efeito limiar6. Embora os valores associados à patogenicidade sejam altamente dependentes da natureza da mutação patogênica e do tecido em que ela ocorre, eles tipicamente encontram-se acima de 60% de heteroplasmia7.
Existem várias áreas de pesquisa nas quais a genotipagem mitocondrial é comum. Na área médica, testar ou quantificar mutações no mtDNA pode servir como critério diagnóstico para doenças mitocondriais, muitas das quais têm como origem as aberrações do mtDNA5. Além do estudo de mutações patogênicas humanas, é provável que a prevalência de modelos animais que abrigam SNPs patogênicos no mtDNA aumente, dado o recente advento da edição de bases mitocondriais possibilitada por editores de base de citosina derivados de DddA (DdCBEs) direcionados mitocondrialmente8 e deaminases baseadas em TALEs (TALEDs) para edição de bases de adenina9. Esta abordagem será fundamental para o entendimento da interação entre genótipos mitocondriais aberrantes e as disfunções resultantes. Há também pesquisas científicas em andamento sobre a remodelação do genoma mitocondrial para uso final como estratégia terapêutica em doenças mitocondriais humanas por meio de uma abordagem conhecida como deslocamento de heteroplasmia. Este campo de pesquisa envolve principalmente o direcionamento de nucleases específicas de mutação para a matriz mitocondrial; isso resulta na degradação preferencial do mtDNA patogênico, levando a resgates no fenótipo10,11,12,13. Quaisquer experimentos envolvendo a remodelação do genótipo mitocondrial requerem um método quantitativo robusto para avaliar os desvios heteroplasmáticos.
Uma grande variedade de métodos é usada para genotipar o mtDNA, e estes variam de acordo com a natureza da mutação. Os métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) são mais precisos quando se trata de quantificar SNPs no mtDNA; no entanto, esses métodos permanecem proibitivamente caros para a quantificação rotineira da heteroplasmia mitocondrial, particularmente se o número de amostras for pequeno. O sequenciamento de Sanger também pode permitir a detecção de SNPs; no entanto, essa abordagem não é quantitativa e muitas vezes falha em detectar baixos níveis de heteroplasmia ou pode ser imprecisa ao estimar altas heteroplasmias. O pirosequenciamento, como um ensaio que envolve preparação mínima e permite a quantificação rápida de heteroplasmia para qualquer amostra de mtDNA, é proposto como um compromisso adequado entre esses dois extremos. Esse método tem sido utilizado rotineiramente para quantificar SNPs mitocondriais por inúmeros pesquisadores em vários contextos, incluindo análise forense14,15, diagnóstico clínico16 ou genotipagem do mtDNA a partir de célulasisoladas17.
Este ensaio envolve uma primeira etapa de pré-amplificação por PCR de uma região flanqueando o SNP no mtDNA, que é seguida por um ensaio de sequenciamento por síntese usando uma fita do amplicon previamente gerado. Um dos dois primers utilizados na etapa de pré-amplificação deve ser biotinilado na extremidade 5', o que permitirá ao aparelho pirosequenciador isolar a fita única de DNA a ser usada como molde para a reação de sequenciamento. Um terceiro primer de sequenciamento é então recozido na fita biotinilada retida, o que permite que a síntese de DNA nascente como desoxinucleotídeos seja dispensada em uma ordem predefinida na câmara de reação. O pirosequenciador registra a quantidade de cada base incorporada com base em uma leitura luminescente, permitindo a quantificação relativa de alelos mitocondriais mutantes e selvagens após a síntese de DNA (Figura 1B). A luminescência é gerada por uma enzima luciferase, que emite luz na presença de ATP que uma ATP sulfurilase sintetiza de novo a cada evento de incorporação a partir dos pirofosfatos liberados por cada nucleotídeo. Essas duas reações podem ser resumidas da seguinte forma:
1. PPi (da incorporação de nucleotídeos) + APS → ATP + sulfato (ATP sulfurilase)
2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PPi + oxiluciferina + CO2 + luz (luciferase)
A detecção de bases de adenina pelo pirosequenciador sem reação cruzada de ATP com a luciferase na segunda reação é um desafio. No entanto, isso é resolvido usando um análogo de adenina para a síntese de DNA, ou seja, dATPαS. Apesar de não ser um substrato perfeito para a luciferase, produz uma luminescência mais forte em comparação com os outros três nucleotídeos, que é ajustada digitalmente pelo pirosequenciador e ajustada para um fator de 0,9. Devido a essa variabilidade inerente, sugere-se evitar o sequenciamento de adenina na posição SNP (veja a discussão para mais detalhes).
O protocolo a seguir detalha o método de avaliação da heteroplasmia do mtDNA por pirosequenciamento e descreve as precauções necessárias no planejamento dos primers de amplificação para evitar viés biológico ou técnico ao genotipar SNPs no mtDNA. Este último envolve o levantamento e seleção digital dos conjuntos de primers, a otimização da PCR pré-amplificação e, finalmente, o sequenciamento e refinamento do ensaio. Dois ensaios de exemplo aplicados são demonstrados: primeiro, a otimização da variante patogênica humana mais comum m.3243A>G18 e, segundo, a genotipagem de células de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) que sofreram deslocamento heteroplasmático usando tecnologias desenvolvidas no laboratório Minczuk em Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutações no genoma mitocondrial (mtDNA) têm sido associadas a doenças genéticas maternas hereditárias. No entanto, o interesse em polimorfismos do mtDNA tem aumentado nos últimos anos devido à capacidade recentemente desenvolvida de produzir modelos por mutagênese do mtDNA e uma nova apreciação da associação entre aberrações genéticas mitocondriais e doenças comuns relacionadas à idade, como câncer, diabetes e demência. O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento por síntese amplamente empregada em todo o campo mitocondrial para experimentos de genotipagem de rotina. Sua relativa acessibilidade quando comparada a métodos massivos de sequenciamento paralelo e facilidade de implementação a tornam uma técnica inestimável no campo da genética mitocondrial, permitindo a rápida quantificação de heteroplasmia com maior flexibilidade. Apesar da praticidade desse método, sua implementação como meio de genotipagem do mtDNA requer a observação de certas diretrizes, especificamente para evitar certos vieses de origem biológica ou técnica. Este protocolo descreve as etapas e precauções necessárias no projeto e implementação de ensaios de pirosequenciamento para uso no contexto da medição de heteroplasmia.

Esta seção apresenta um exemplo de otimização de um ensaio de pirosequenciamento para uma mutação patogênica humana no mtDNA, bem como dados de sequenciamento da genotipagem de fibroblastos embrionários (MEFs) heteroplasmáticos (m.5024C>T) tratados com nucleases mitocondriais de dedo de zinco (mtZFNs). A otimização do ensaio para células humanas e a comparação de dois ensaios diferentes demonstram como selecionar o mais preciso, enquanto a genotipagem de células MEF geneticamente modificadas no segundo exe...

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Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento por síntese que pode ser usada para genotipar polimorfismos de nucleotídeo único no DNA mitocondrial. Este método é vantajoso pela facilidade de implementação e custo-efetividade quando comparado a outros métodos de sequenciamento. Pode ser facilmente usado como método diagnóstico para certas doenças mitocondriais, determinando valores heteroplasmáticos de variantes patogênicas no DNA mitocondrial.Para começar, obtenha um arquivo de sequência de DNA mitocondrial para a espécie a ser genotipada e identifique a posição do polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNP. Assegurar que a sequência de referência utilizada empregue a numeração de base apropriada para a mutação estudada, de modo a que a posição do SNP possa ser facilmente identificada. Copie 1.000 pares de bases a montante e a jusante do site SNP e cole a sequência truncada no software de design de primer pirosequenciante.Realce a base polimórfica, clique com o botão direito do mouse sobre ela e selecione Definir região de destino para definir a base SNP analisada como o destino do ensaio de pirosequenciamento. Pressione o ícone Play no canto superior direito da interface para iniciar a seleção do primer e aguarde até que o software gere automaticamente os trios de primer, dois primers para pré-amplificação do DNA do molde e o terceiro primer para sequenciamento pela síntese na máquina de pirosequenciamento. Clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar todos os conjuntos de primers para manter todos os conjuntos de primers.Abra o software de execução fornecido com o pirosequenciador, selecione Novo ensaio e, em seguida, selecione o modelo de ensaio de quantificação de alelos. Insira a sequência a ser analisada na caixa correspondente digitando os nucleotídeos diretamente a jusante do primer de sequenciamento. Para a posição variável, denote as duas bases possíveis, separadas por uma barra.Pressione Generate Dispensation Order e deixe que o software determine automaticamente uma ordem adequada para os nucleotídeos a serem dispensados no sequenciamento por reação de síntese. Salve e forneça um nome para o ensaio. Em seguida, execute a corrida diluindo o DNA a ser analisado para 5 nanogramas por microlitro.Na primeira execução, certifique-se de incluir amostras de heteroplasmia conhecida como referência e amostras de tipo selvagem. Em seguida, realizar um pré-sequenciamento PCR de 5 microlitros de DNA diluído e reações de 25 microlitros, utilizando os primers e parâmetros de amplificação. Para executar a configuração do arquivo, selecione Nova execução no software pirosequenciador.O pirosequenciador pode sequenciar simultaneamente 48 reações pré-amplificadas separadas com um quadrado vazio representando um único poço de sequenciamento em um disco pirosequenciador. Carregue os ensaios clicando com o botão direito do mouse em um quadrado e selecionando Carregar ensaio. Se necessário, sequencie até quatro ensaios separados com iniciadores de sequenciamento diferentes.Defina o modo de dispensação do primer como automático para atribuir automaticamente uma câmara de injeção para cada primer de sequenciamento usado para a execução. Defina o modo de execução como padrão, a menos que execute quatro tipos diferentes de ensaios em um disco de sequenciamento. Verifique se o número de ensaios no arquivo de modelo de execução corresponde ao número de reações de PCR que estão sendo amplificadas.Em seguida, salve os arquivos executados em uma unidade USB. Para acionar o pirosequenciador, pressione o botão de limpeza na tela principal sensível ao toque do dispositivo e limpe todos os injetores com água de alta pureza, seguindo as instruções na tela. Ao inserir a tira do absorvedor na máquina, certifique-se de que as extremidades se encontram na posição das 9 horas.Depois de conectar o pendrive, pressione o botão Sequence para carregar os arquivos de execução preparados anteriormente. Siga as instruções no dispositivo para carregar e colocar os reagentes, conforme necessário, nos injetores correspondentes na máquina. Coloque 3 microlitros de contas nos poços e, em seguida, carregue 10 microlitros de cada reação de PCR para ser sequenciado na amostra correspondente.Pipetar para cima e para baixo para misturar a amostra com as esferas magnéticas. Procure a indicação no pirosequenciador preparado de que o disco pode ser carregado na máquina. Desparafuse a porca de retenção da placa e alinhe a placa de amostra carregada com o pino de metal no compartimento do disco.Uma vez que a placa está firmemente parafusada no compartimento da placa, inicie a execução de sequenciamento pressionando o botão de início na interface da tela sensível ao toque. Quando a execução estiver concluída, remova a unidade USB da máquina e conecte-a novamente ao computador que executa o software pirosequenciador. Depois que o arquivo de execução recém-gerado aparecer na unidade USB, clique duas vezes no arquivo de resultado da execução.Isso analisa automaticamente a saída de luciferase de cada poço após a incorporação de nucleotídeos e quantifica o alelo mitocondrial de interesse. Procure as pontuações de cores mostradas pelo software com base na qualidade das leituras. Para salvar os resultados, selecione Relatórios na janela superior, seguido de Relatório Completo para gerar um arquivo PDF contendo os pirogramas e os resultados de cada poço da execução.Como alternativa, baixe os resultados em outros formatos na guia Relatórios. Eletroforese em gel de agarose de uma amplificação por PCR usando os primers de amplificação de ambos os conjuntos selecionados para a mutação m. 3243A>G como mostrado nesta figura.Aqui, Het denota a amostra quase homoplasmática m. 3243A>G a ser analisada. Uma comparação do desempenho de ambos os conjuntos de primers utilizando padrões molares para calibração é mostrada nesta figura.Os valores medidos são indicados pelas linhas pontilhadas verticais. Uma função linear X=Y é exibida para ilustrar o quão próximo cada um dos dois ensaios testados está de uma medição ideal. Os nomes das linhagens celulares no eixo X são os nomes dos vários clones de cybrid que foram genotipados usando este ensaio.Resultados de genotipagem em quatro clones de cybrid de heteroplasmia desconhecida m. 3243A>G usando ambos os ensaios são mostrados aqui. O sequenciamento foi realizado em triplicata técnica.Os resultados de genotipagem de células mitocondriais tratadas com nuclease de dedo de zinco, juntamente com controles não tratados e tratados simuladamente, e os pirogramas de duas réplicas de PCR de amostra de células MEF usadas para gerar os resultados, bem como o controle de genotipagem selvagem, são mostrados aqui. O pirosequenciamento pode ser usado como uma leitura para experimentos de terapia gênica para avaliar várias tecnologias de terapia gênica no DNA mitocondrial.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Medicina

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Coleta e Extração de DNA de saliva para Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Simples estágio dinâmico Reanimação do Sorriso em Irreversível Paralisia Facial pela Free Funcional transferência muscular

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...