Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Выражаем благодарность Сильвии Марше (Silvia Marchet) и Констанце Ламперти (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Милан) за подготовку и предоставление цибридных клеток m.3243A>G, используемых в качестве иллюстративных примеров для этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить членов Группы митохондриальной генетики (MRC-MBU, Кембриджский университет) за полезное обсуждение в ходе этого исследования. Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании (MC_UU_00015/4 и MC_UU_00028/3). .А.Н. и.С.-. дополнительно поддерживаются The Lily Foundation и The Champ Foundation соответственно.

Было предоставлено информированное согласие на использование клеток кибридов человека 3243A>G и иммортализированных MEF m.5024C>T, используемых в этом исследовании. В этом случае не требовалось этического одобрения, поскольку клетки пациентов не были собраны в Кембриджском университете. Одн?...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Важнейшим аспектом успеха протокола является предотвращение загрязнений, особенно при использовании небольшого количества исходного материала. Рекомендуется использовать УФ-колпак и фильтрованные наконечники пипеток при подготовке образцов, где это возможно, а также разделять обл?...

Митохондриальный геном существует в виде небольших (16,5 кб) кольцевых молекул (мтДНК), присутствующих во внутреннем компартменте митохондрий, называемом матрицей, и кодирует 13 субъединиц митохондриальной дыхательной цепи, а также тРНК и рРНК, необходимых для их трансляции in situ митохондриальной рибосомой1. Этот геном составляет примерно 1% всех белков, необходимых для функции митохондрий, остальная часть которых кодируется ядерной ДНК (нДНК). Обычно предполагается, что митохондрии происходят в результате эндосимбиотического слияния между альфа-протеобактериальным предком и предковой эукариотической клеткой. Как только этот гипотетический симбиоз произошел, генетическая информация митохондрий постепенно переносилась в ядро в течение эонов, что объясняет вышеупомянутую компактность мтДНК по сравнению с геномами современных цианобактерий2. Такой перенос генов наиболее убедительно подтверждается существованием длинных участков нДНК, которые высоко гомологичны последовательностям, обнаруженным в мтДНК. Эти ядерные митохондриальные последовательности (NUMT) являются распространенным источником неправильной интерпретации во время генотипирования, и необходимо принять определенные меры предосторожности, чтобы избежать ядерных предубеждений при генотипировании мтДНК3 (рис. 1A).
Еще одной отличительной особенностью мтДНК является то, что количество ее копий варьируется в зависимости от типа клетки, насчитывая от десятков до тысяч копий на клетку4. Из-за этой природы множественных копий мтДНК может содержать широкий спектр генотипов в одной клетке, что может привести к более непрерывному распределению аллелей в отличие от дискретных аллелей, связанных с ядерными генами, при рассмотрении зиготности хромосом. Эта гетерогенность митохондриальных аллелей называется митохондриальной гетероплазмией, которая обычно выражается в процентной распространенности данной мутации в процентах от общего количества мтДНК в данной клетке. Гетероплазмию можно противопоставить гомоплазмии, которая относится к уникальному виду мтДНК, присутствующему в клетке.
Измерение митохондриальной гетероплазмии представляет особый интерес при количественном определении доли молекул мтДНК, содержащих патогенные варианты. Такие варианты бывают в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), небольших инделов или крупномасштабных делеций5. Большинство людей гетероплазматичны в отношении патогенных вариантов; однако они не проявляют каких-либо клинических фенотипов, которые часто проявляются только при более высоких уровнях гетероплазмии патогенной мтДНК в явлении, называемом пороговым эффектом6. Хотя значения, связанные с патогенностью, сильно зависят от природы патогенной мутации и ткани, в которой она происходит, они обычно лежат выше 60% гетероплазмии7.
Существует несколько областей исследований, в которых распространено митохондриальное генотипирование. В области медицины тестирование или количественная оценка мутаций мтДНК может служить диагностическим критерием митохондриальных заболеваний, многие из которых имеют аберрации мтДНК в качестве источника5. В дополнение к изучению патогенных мутаций человека, распространенность животных моделей, содержащих патогенные SNP в мтДНК, вероятно, увеличится, учитывая недавнее появление редактирования митохондриальных оснований, обеспечиваемого митохондриально целевыми редакторами цитозиновых оснований, полученных из DddA (DdCBE)8, и деаминазами на основе TALE (TALED) для редактирования адениновых оснований9. Этот подход будет играть важную роль в понимании взаимодействия между аберрантными митохондриальными генотипами и возникающими в результате дисфункциями. Также продолжаются научные исследования по ремоделированию митохондриального генома для конечного использования в качестве терапевтической стратегии при митохондриальных заболеваниях человека с помощью подхода, известного как сдвиг гетероплазмии. Эта область исследований в первую очередь включает направление мутационно-специфических нуклеаз в митохондриальный матрикс; это приводит к преимущественной деградации патогенной мтДНК, что приводит к спасению фенотипа10,11,12,13. Любые эксперименты, связанные с ремоделированием митохондриального генотипа, требуют надежного количественного метода для оценки сдвигов гетероплазмии.
Для генотипирования мтДНК используется широкий спектр методов, которые варьируются в зависимости от характера мутации. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) более точны, когда речь идет о количественном определении SNP в мтДНК; Однако эти методы остаются непомерно дорогими для рутинной количественной оценки митохондриальной гетероплазмии, особенно если количество образцов невелико. Секвенирование по Сэнгеру также может позволить обнаруживать SNP; Однако этот подход не является количественным и часто не позволяет обнаружить низкие уровни гетероплазмии или может быть неточным при оценке высоких гетероплазмий. Пиросеквенирование, как анализ, который включает минимальную подготовку и позволяет быстро количественно определить гетероплазмию для любого образца мтДНК, предлагается в качестве подходящего компромисса между этими двумя крайностями. Этот метод регулярно использовался для количественной оценки митохондриальных SNP многочисленными исследователями в различных контекстах, включая судебно-медицинский анализ 14,15, клинический диагноз16 или генотипирование мтДНК из отдельных клеток17.
Этот анализ включает в себя первый этап преамплификации ПЦР области, фланкирующей SNP в мтДНК, за которым следует анализ секвенирования путем синтеза с использованием одной цепи ранее сгенерированного ампликона. Один из двух праймеров, используемых на стадии преамплификации, должен быть биотинилирован на 5'-конце, что позволит пиросеквенирующему аппарату изолировать одну цепь ДНК, которая будет использоваться в качестве матрицы для реакции секвенирования. Затем третий праймер для секвенирования отжигают на сохраненную биотинилированную цепь, что позволяет зарождающемуся синтезу ДНК в виде дезоксинуклеотидов распределяться в заранее определенном порядке в реакционную камеру. Пиросеквенсор записывает количество каждого включенного основания на основе люминесцентного считывания, что позволяет проводить относительную количественную оценку мутантных и митохондриальных аллелей дикого типа при синтезе ДНК (рис. 1B). Люминесценция генерируется ферментом люциферазы, который излучает свет в присутствии АТФ, который АТФ-сульфурилаза синтезирует de novo при каждом событии включения из пирофосфатов, высвобождаемых каждым нуклеотидом. Эти две реакции можно резюмировать следующим образом:
1. PPi (от включения нуклеотидов) + APS → АТФ + сульфат (АТФ-сульфурилаза)
2. АТФ + люциферин + О2 → АМФ + РРi + оксилюциферин +СО2 + свет (люцифераза)
Обнаружение адениновых оснований пиросеквенсором без перекрестной реакции АТФ с люциферазой во второй реакции является сложной задачей. Однако это решается с помощью аналога аденина для синтеза ДНК, а именно dATPαS. Несмотря на то, что он не является идеальным субстратом для люциферазы, он производит более сильную люминесценцию по сравнению с тремя другими нуклеотидами, которая регулируется пиросеквенсором в цифровом виде и устанавливается на коэффициент 0,9. Из-за этой присущей изменчивости рекомендуется избегать секвенирования аденина в положении SNP (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
В следующем протоколе подробно описывается метод оценки гетероплазмии мтДНК путем пиросеквенирования и излагаются необходимые меры предосторожности при разработке амплификационных праймеров, чтобы избежать биологической или технической предвзятости при генотипировании SNP в мтДНК. Последнее включает в себя цифровую съемку и выбор наборов праймеров, оптимизацию ПЦР с предварительной амплификацией и, наконец, секвенирование и уточнение анализа. Продемонстрированы два прикладных примера: во-первых, оптимизация наиболее распространенного патогенного варианта человека m.3243A>G18 и, во-вторых, генотипирование клеток эмбриональных фибробластов мыши (MEF), подвергшихся гетероплазменному сдвигу, с использованием технологий, разработанных в лаборатории Минчука в Кембридже 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Мутации в митохондриальном геноме (мтДНК) были связаны с генетическими заболеваниями, унаследованными по материнской линии. Тем не менее, интерес к полиморфизмам мтДНК возрос в последние годы из-за недавно разработанной способности создавать модели с помощью мутагенеза мтДНК и нового понимания связи между митохондриальными генетическими аберрациями и распространенными возрастными заболеваниями, такими как рак, диабет и деменция. Пиросеквенирование — это метод секвенирования путем синтеза, который широко используется в митохондриальном поле для рутинных экспериментов по генотипированию. Его относительная доступность по сравнению с методами массового параллельного секвенирования и простота реализации делают его бесценным методом в области митохондриальной генетики, позволяя быстро количественно определять гетероплазмию с повышенной гибкостью. Несмотря на практичность этого метода, его реализация в качестве средства генотипирования мтДНК требует соблюдения определенных руководящих принципов, в частности, чтобы избежать определенных предубеждений биологического или технического происхождения. В этом протоколе изложены необходимые шаги и меры предосторожности при разработке и внедрении пиросеквенирующих анализов для использования в контексте измерения гетероплазмии.

В этом разделе представлен пример оптимизации пиросеквенирующего анализа патогенной мутации мтДНК человека, а также данные секвенирования генотипирования гетероплазматических (m.5024C>T) эмбриональных фибробластов (MEF) мышей, обработанных митохондриальными нуклеазами цинкового пальца ...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Пиросеквенирующие анализы обеспечивают надежное и быстрое генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов митохондриальной ДНК в гетероплазматических клетках или тканях.

Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальном геноме методом пиросеквенирования

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Пиросеквенирование - это метод секвенирования путем синтеза, который может быть использован для генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальной ДНК. Этот метод отличается простотой внедрения и экономичностью по сравнению с другими методами секвенирования. Он может быть легко использован в качестве метода диагностики некоторых митохондриальных заболеваний путем определения значений гетероплазмии патогенных вариантов в митохондриальной ДНК.Для начала получите файл последовательности митохондриальной ДНК для генотипируемого вида и определите положение однонуклеотидного полиморфизма или SNP. Убедитесь, что используемая эталонная последовательность использует соответствующую базовую нумерацию для изучаемой мутации, чтобы можно было легко идентифицировать положение SNP. Скопируйте 1 000 пар оснований вверх и вниз по течению от сайта SNP и вставьте усеченную последовательность в программное обеспечение для проектирования пиросеквенирующей грунтовки.Выделите полиморфное основание, щелкните его правой кнопкой мыши и выберите «Установить целевую область», чтобы установить проанализированное основание SNP в качестве цели анализа пиросеквенирования. Нажмите значок «Воспроизвести» в правом верхнем углу интерфейса, чтобы запустить выбор праймера, и подождите, пока программа автоматически сгенерирует трио праймеров, два праймера для предварительной амплификации матричной ДНК и третий праймер для секвенирования путем синтеза в пиросеквенирующей машине. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Копировать все наборы учебников», чтобы сохранить все наборы учебников.Откройте программное обеспечение для запуска, поставляемое с пиросеквенсором, выберите «Новый анализ», затем выберите шаблон анализа количественного определения аллелей. Введите последовательность, подлежащую анализу, в соответствующее поле, введя нуклеотиды непосредственно после праймера секвенирования. Для переменной позиции обозначьте два возможных основания, разделенных косой чертой.Нажмите «Создать порядок диспенсации» и позвольте программному обеспечению автоматически определить подходящий порядок для нуклеотидов, которые будут распределяться в секвенировании по реакции синтеза. Сохраните и укажите имя для анализа. Затем выполните прогон, разбавив анализируемую ДНК до 5 нанограммов на микролитр.В первом прогоне убедитесь, что в качестве эталона включены образцы известной гетероплазмии и образцы дикого типа. Затем проводят пресеквенирование ПЦР 5 микролитров разбавленной ДНК и 25 микролитров реакций, используя амплификационные праймеры и параметры. Чтобы запустить настройку файла, выберите «Новый запуск» в программном обеспечении пиросеквенсора.Пиросеквенсор может одновременно секвенировать 48 отдельных предварительно усиленных реакций с пустым квадратом, представляющим собой одну секвенирующую яму на пиросеквенирующем диске. Загрузите анализы, щелкнув правой кнопкой мыши квадрат и выбрав «Загрузить анализ». При необходимости секвенируйте до четырех отдельных анализов с разными праймерами секвенирования.Установите автоматический режим выдачи праймера, чтобы автоматически назначать камеру впрыска для каждого праймера секвенирования, используемого для прогона. Установите стандартный режим выполнения, если на одном диске секвенирования не выполняется четыре разных типа анализов. Убедитесь, что количество анализов в файле шаблона запуска совпадает с количеством амплируемых реакций ПЦР.Затем сохраните запущенные файлы на USB-накопитель. Чтобы заправить пиросеквенсор, нажмите кнопку очистки на главном сенсорном экране устройства и очистите все форсунки водой высокой чистоты, следуя инструкциям на экране. Вставляя полосу амортизатора в машину, убедитесь, что концы сходятся в положении «9 часов».После подключения USB-накопителя нажмите кнопку «Последовательность», чтобы загрузить подготовленные ранее файлы запуска. Следуйте инструкциям на устройстве, чтобы загрузить и заправить реагенты, по мере необходимости, в соответствующие форсунки на машине. Загрузите 3 микролитра шариков в лунки, а затем загрузите 10 микролитров каждой реакции ПЦР для секвенирования в соответствующий образец.Пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать образец с магнитными шариками. Ищите в загрунтованном пиросеквенсоре индикацию того, что диск может быть загружен в машину. Отвинтите пластину, удерживающую гайку, и совместите загруженную пластину образца с металлическим штифтом в отсеке диска.После того, как пластина плотно ввинчена в отсек пластины, запустите последовательность, нажав кнопку запуска на сенсорном интерфейсе. После завершения запуска извлеките USB-накопитель из машины и снова подключите его к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение пиросеквенсора. После того, как только что сгенерированный файл запуска появится на USB-накопителе, дважды щелкните файл результата запуска.Это автоматически анализирует выход люциферазы из каждой лунки при включении нуклеотидов и количественно определяет интересующий митохондриальный аллель. Ищите цветовые показатели, отображаемые программным обеспечением, в зависимости от качества чтения. Чтобы сохранить результаты, выберите «Отчеты» в верхнем окне, а затем «Полный отчет», чтобы создать PDF-файл, содержащий пирограммы и результаты из каждой скважины прогона.Кроме того, вы можете загрузить результаты в других форматах на вкладке «Отчеты». Электрофорез в агарозном геле амплификации ПЦР с использованием амплификационных праймеров из обоих наборов, выбранных для мутации m. 3243A>G, как показано на этом рисунке.Здесь Het обозначает почти гомоплазматический образец m. 3243A>G, подлежащий анализу. На этом рисунке показано сравнение характеристик обоих наборов праймеров с использованием молярных эталонов для калибровки.Измеренные значения обозначаются вертикальными пунктирными линиями. Линейная функция X = Y отображается, чтобы проиллюстрировать, насколько близок каждый из двух тестируемых анализов к идеальному измерению. Названия клеточных линий по оси X — это названия различных клонов кибридов, которые были генотипированы с помощью этого анализа.Здесь показаны результаты генотипирования четырех клонов цибридов неизвестной гетероплазмии m. 3243A>G с использованием обоих анализов. Секвенирование проводили в техническом трипликате.Здесь показаны результаты генотипирования митохондриальных клеток, обработанных нуклеазой цинкового пальца, наряду с необработанными и имитационно обработанными контрольными группами, а также пирограммы из двух реплик ПЦР-образцов клеток MEF, использованных для получения результатов, а также контроль генотипирования дикого типа. Пиросеквенирование может быть использовано в качестве считывания для экспериментов по генной терапии для оценки различных технологий генной терапии в митохондриальной ДНК.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Использование первичных фибробластов человека для мониторинга митохондриальной фенотипы в области болезни Паркинсона

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Идентификация<em&gt; Спящая красавица</em&gt; Транспозонов вставки в твердых опухолей с использованием Linker-опосредованного ПЦР

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Одноступенчатый Dynamic Реанимация улыбкой в ​​необратимому параличу лицевого от свободных функциональных мышц Transfer

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Роза Бенгалия фототромбоза конфокальной оптической томографии<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель одно судно инсульта

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Визуализации Металлы в ткани головного мозга методом лазерной абляции - индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Культура ткани модель Ex Vivo сортопопуляциях осложнений в пролиферативной диабетической ретинопатии

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Модель боли при остеоартрите, вызванная внутрисуставной инъекцией моно-йодоацетата у крыс

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Травма ишемии-реперфузии органов путем моделирования гемодинамических изменений в модели трансплантации печени крыс

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...