Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Vi vill tacka Silvia Marchet och Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) för att ha förberett och tillhandahållit m.3243A>G cybridceller som används som illustrativa exempel för detta protokoll. Vi vill också erkänna medlemmarna i Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) för användbar diskussion under denna forskning. Detta arbete stöddes av kärnfinansiering från Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 och MC_UU_00028/3). P.A.N. och P.S.-P. stöds dessutom av The Lily Foundation respektive The Champ Foundation.

Informerat samtycke gavs för användning av humana 3243A>G cybridceller och de förevigade m.5024C>T MEF som användes i denna studie. Etiskt godkännande krävdes inte i detta fall eftersom patientcellerna inte samlades in vid University of Cambridge. Användning av humana fibroblaster kan dock kräva etiskt godkännande. Det rekommenderas starkt att följa bästa praxis för PCR-inställning när du förbereder prov-DNA för pyrosequencing. Frekvent amplifiering med identiska primrar kan leda till amplikonkontaminerin...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

En kritisk aspekt för protokollets framgång är att undvika kontaminering, särskilt vid användning av små mängder utgångsmaterial. Det rekommenderas att använda en UV-huv och filtrerade pipettspetsar när proverna förbereds när det är möjligt, samt att hålla förförstärknings- och efterförstärkningsområdena åtskilda. Blankmätningar och prover av känd heteroplasmi (t.ex. vildtyps-DNA) bör alltid inkluderas för att användas som riktmärken för att kontrollera teknisk eller biologisk partiskhet. </p...

Det mitokondriella genomet existerar i form av små (16, 5 kb) cirkulära molekyler (mtDNA) närvarande i mitokondriernas innersta fack som heter matrisen och kodar för 13 subenheter i mitokondriell andningskedja, liksom de tRNA och rRNA som är nödvändiga för deras översättning in situ av mitokondriell ribosom1. Detta genom representerar ungefär 1% av alla proteiner som är nödvändiga för mitokondriell funktion, varav resten kodas av kärn-DNA (nDNA). Det antas vanligen att mitokondrier härrör från en endosymbiotisk fusionshändelse mellan en alfa-proteobakteriell förfader och en förfäders eukaryota cell. När denna hypotetiska symbios ägde rum överfördes mitokondriernas genetiska information gradvis till kärnan under eoner, vilket förklarar den ovannämnda kompaktiteten hos mtDNA jämfört med genomerna hos moderna cyanobakterier2. En sådan överföring av gener bevisas starkast av förekomsten av långa sträckor av nDNA som är mycket homologa med sekvenserna som finns i mtDNA. Dessa nukleära mitokondriella sekvenser (NUMT) är en vanlig källa till feltolkning under genotypning, och vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas för att undvika nukleära fördomar vid genotypning mtDNA3 (figur 1A).
Ett annat särdrag hos mtDNA är att dess kopieringsnummer varierar beroende på celltyp, numrering var som helst från tiotusentals kopior per cell4. På grund av denna multi-copy natur kan mtDNA hysa ett brett spektrum av genotyper inom en enda cell, vilket kan resultera i en mer kontinuerlig distribution av alleler i motsats till de diskreta allelerna associerade med kärngener när man överväger kromosomernas zygositet. Denna heterogenitet av mitokondriella alleler kallas mitokondriell heteroplasmi, vilket typiskt uttrycks i procentuell prevalens av en given mutation som en andel av det totala mtDNA i en given cell. Heteroplasmi kan kontrasteras med homoplasmi, vilket hänvisar till en unik art av mtDNA som finns över en cell.
Mätning av mitokondriell heteroplasmi är av särskilt intresse vid kvantifiering av andelen mtDNA-molekyler som innehåller patogena varianter. Sådana varianter kommer i form av enkla nukleotidpolymorfismer (SNP), små indeler eller storskaliga borttagningar5. De flesta människor är heteroplasmatiska för patogena varianter; De uppvisar emellertid inga kliniska fenotyper, som ofta bara manifesterar sig vid högre heteroplasmatiska nivåer av patogent mtDNA i ett fenomen som kallas tröskeleffekt6. Medan värdena associerade med patogenicitet är starkt beroende av arten av den patogena mutationen och vävnaden i vilken den förekommer, ligger de vanligtvis över 60% heteroplasmi7.
Det finns flera forskningsområden där mitokondriell genotypning är vanligt. Inom det medicinska området kan testning eller kvantifiering av mtDNA-mutationer fungera som ett diagnostiskt kriterium för mitokondriella sjukdomar, varav många har mtDNA-avvikelser som ursprung5. Förutom studien av humana patogena mutationer kommer förekomsten av djurmodeller som innehåller patogena SNP i mtDNA sannolikt att öka, med tanke på den senaste tillkomsten av mitokondriell basredigering som möjliggjorts av mitokondriellt riktade DddA-härledda cytosinbasredigerare (DdCBE)8 och TALE-baserade deaminaser (TALED) för adeninbasredigering9. Detta tillvägagångssätt kommer att vara avgörande för att förstå samspelet mellan avvikande mitokondriella genotyper och de resulterande dysfunktionerna. Det pågår också vetenskaplig forskning om ombyggnad av mitokondriellt genom för ultimat användning som en terapeutisk strategi vid mänskliga mitokondriella sjukdomar via ett tillvägagångssätt som kallas heteroplasmiskiftning. Detta forskningsområde handlar främst om att rikta mutationsspecifika nukleaser till mitokondriell matris; Detta resulterar i preferensnedbrytning av patogent mtDNA, vilket leder till räddningar i fenotyp10,11,12,13. Alla experiment som involverar ombyggnad av mitokondriell genotyp kräver en robust kvantitativ metod för att bedöma heteroplasmiskift.
En mängd olika metoder används för att genotyp mtDNA, och dessa varierar beroende på mutationens natur. Nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) är mer exakta när det gäller att kvantifiera SNP i mtDNA; Dessa metoder förblir dock oöverkomligt dyra för rutinmässig kvantifiering av mitokondriell heteroplasmi, särskilt om antalet prover är litet. Sanger-sekvensering kan också möjliggöra detektering av SNP; Detta tillvägagångssätt är dock inte kvantitativt och misslyckas ofta med att upptäcka låga nivåer av heteroplasmi eller kan vara felaktigt vid uppskattning av höga heteroplasmier. Pyrosequencing, som en analys som involverar minimal förberedelse och möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi för vilket mtDNA-prov som helst, föreslås som en lämplig kompromiss mellan dessa två ytterligheter. Denna metod har använts rutinmässigt för att kvantifiera mitokondriella SNP av många forskare i olika sammanhang, inklusive rättsmedicinsk analys 14,15, klinisk diagnos16 eller genotypning av mtDNA från enstaka celler17.
Denna analys innefattar ett första PCR-föramplifieringssteg av en region som flankerar SNP i mtDNA, vilket följs av en sekvenserings-för-syntesanalys med användning av en sträng av den tidigare genererade ampliconen. En av de två primrarna som används i föramplifieringssteget måste biotinyleras på 5'-änden, vilket gör det möjligt för pyrosequencing-apparaten att isolera den enda DNA-strängen som ska användas som mall för sekvenseringsreaktionen. En tredje sekvenseringsprimer glödgas sedan på den kvarhållna biotinylerade strängen, vilket möjliggör begynnande DNA-syntes som deoxinukleotider som ska dispenseras i en fördefinierad ordning i reaktionskammaren. Pyrosequencern registrerar mängden av varje bas som införlivas baserat på en självlysande avläsning, vilket möjliggör relativ kvantifiering av mitokondriella alleler av mutant och vildtyp vid DNA-syntes (figur 1B). Luminiscensen genereras av ett luciferasenzym, som avger ljus i närvaro av ATP som ett ATP-sulfurylas syntetiserar de novo vid varje inkorporeringshändelse från pyrofosfaterna som frigörs av varje nukleotid. Dessa två reaktioner kan sammanfattas enligt följande:
1. PPi (från nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylas)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + ljus (luciferas)
Att detektera adeninbaser av pyrosequencern utan att ATP korsreagerar med luciferas i den andra reaktionen är en utmaning. Detta löses emellertid genom att använda en adeninanalog för DNA-syntes, nämligen dATPαS. Trots att det inte är ett perfekt substrat för luciferas, producerar det en starkare luminiscens jämfört med de tre andra nukleotiderna, som justeras digitalt av pyrosequenceren och ställs in på en faktor 0,9. På grund av denna inneboende variabilitet föreslås att man undviker sekvensering av adenin vid SNP-positionen (se diskussionen för mer information).
Följande protokoll beskriver metoden för mtDNA-heteroplasmibedömning genom pyrosequencing och beskriver de nödvändiga försiktighetsåtgärderna vid utformningen av amplifieringsprimrarna för att undvika biologisk eller teknisk bias vid genotypning av SNP i mtDNA. Det senare innebär digital kartläggning och val av primeruppsättningar, optimering av förförstärknings-PCR och slutligen sekvensering och raffinering av analysen. Två tillämpade exempelanalyser demonstreras: för det första optimeringen av den vanligaste humana patogena varianten m.3243A>G18, och för det andra genotypningen av musembryonala fibroblastceller (MEF) som har genomgått heteroplasmiförskjutning med hjälp av teknik som utvecklats vid Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mutationer i mitokondriellt genom (mtDNA) har associerats med maternellt ärftliga genetiska sjukdomar. Intresset för mtDNA-polymorfismer har dock ökat de senaste åren på grund av den nyligen utvecklade förmågan att producera modeller med mtDNA-mutagenes och en ny uppskattning av sambandet mellan mitokondriella genetiska avvikelser och vanliga åldersrelaterade sjukdomar som cancer, diabetes och demens. Pyrosequencing är en sekvenserings-för-syntes-teknik som används allmänt över mitokondriella fältet för rutinmässiga genotypningsexperiment. Dess relativa överkomliga jämfört med massiva parallella sekvenseringsmetoder och enkel implementering gör det till en ovärderlig teknik inom mitokondriell genetik, vilket möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi med ökad flexibilitet. Trots praktiken av denna metod kräver dess genomförande som ett medel för mtDNA-genotypning observation av vissa riktlinjer, särskilt för att undvika vissa fördomar av biologiskt eller tekniskt ursprung. Detta protokoll beskriver nödvändiga steg och försiktighetsåtgärder vid utformning och implementering av pyrosequencing-analyser för användning i samband med heteroplasmimätning.

Detta avsnitt presenterar ett exempel på optimering av en pyrosequencing-analys för en human patogen mtDNA-mutation, samt sekvenseringsdata från genotypning av heteroplasmatiska (m.5024C>T) musembryonala fibroblaster (MEF) behandlade med mitokondriella zinkfingernukleaser (mtZFN). Optimering av analysen för mänskliga celler och jämförelse av två olika analyser visar hur man väljer den mest exakta, medan genotypning av genetiskt modifierade MEF-celler i det andra exemplet fungerar som ett tillämpat exempel på a...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pyrosequencing-analyser möjliggör robust och snabb genotypning av mitokondriellt DNA-enkelnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiska celler eller vävnader.

Genotypning av enstaka nukleotidpolymorfismer i mitokondriellt genom pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing är en sekvensering genom syntesteknik som kan användas för att genotypa enstaka nukleotidpolymorfismer i mitokondriellt DNA. Denna metod är fördelaktig i sin enkla implementering och kostnadseffektivitet jämfört med andra sekvenseringsmetoder. Det kan enkelt användas som en diagnostisk metod för vissa mitokondriella sjukdomar genom att bestämma heteroplasmiska värden av patogena varianter i mitokondriellt DNA.För att börja, skaffa en mitokondriell DNA-sekvensfil för arten som genotypas och identifiera positionen för den enda nukleotidpolymorfismen eller SNP. Se till att den referenssekvens som används använder lämplig basnumrering för den studerade mutationen så att SNP: s position lätt kan identifieras. Kopiera 1 000 baspar uppströms och nedströms SNP-platsen och klistra in den trunkerade sekvensen i pyrosequencing-primerdesignprogramvaran.Markera den polymorfa basen, högerklicka på den och välj sedan Ange målregion för att ange den analyserade SNP-basen som mål för pyrosequencing-analysen. Tryck på Play-ikonen i det övre högra hörnet av gränssnittet för att starta primervalet och vänta tills programvaran automatiskt genererar primertrios, två primers för föramplifiering av mall-DNA och den tredje primern för sekvensering av syntesen i pyrosequencing-maskinen. Högerklicka och välj Kopiera alla primeruppsättningar för att behålla alla primeruppsättningar.Öppna körningsprogramvaran som medföljer pyrosequencern, välj Ny analys och välj sedan mallen för allelkvantifieringsanalys. Mata in sekvensen som ska analyseras i motsvarande ruta genom att skriva in nukleotiderna direkt nedströms sekvenseringsprimern. För den variabla positionen, beteckna de två möjliga baserna, åtskilda av ett snedstreck.Tryck på Generate Dispensation Order och låt programvaran automatiskt bestämma en lämplig ordning för nukleotiderna som ska dispenseras i sekvenseringen genom syntesreaktion. Spara och ange ett namn för analysen. Därefter utför körningen genom att späda DNA som ska analyseras till 5 nanogram per mikroliter.I den första körningen, se till att inkludera prover av känd heteroplasmi som referens och vildtypprover. Utför sedan en presequencing PCR av 5 mikroliter utspätt DNA och 25 mikroliter reaktioner, med användning av amplifieringsprimrar och parametrar. För att köra filinställningen, välj Ny Kör i pyrosequencerprogramvaran.Pyrosequencern kan samtidigt sekvensera 48 separata förförstärkta reaktioner med en tom kvadrat som representerar en enda sekvenseringsbrunn på en pyrosequencingskiva. Ladda analyserna genom att högerklicka på en fyrkant och välja Ladda analys. Vid behov, sekvensera upp till fyra separata analyser med olika sekvenseringsprimers.Ställ in primerdispenseringsläget på automatiskt för att automatiskt tilldela en injektionskammare för varje sekvenseringsprimer som används för körningen. Ställ in körläget på standard, såvida du inte kör fyra olika typer av analyser på en sekvenseringsskiva. Se till att antalet analyser i körmallfilen matchar antalet PCR-reaktioner som förstärks.Spara sedan körfilerna på en USB-enhet. För att fylla pyrosequencern, tryck på rengöringsknappen på enhetens huvudpekskärm och rengör alla injektorer med vatten med hög renhet enligt instruktionerna på skärmen. När du sätter in absorbatorremsan i maskinen, se till att ändarna möts i klockan 9.När du har anslutit USB-minnet trycker du på sekvensknappen för att ladda de körfiler som förberetts tidigare. Följ instruktionerna på enheten för att ladda och fylla reagenserna, efter behov, i motsvarande injektorer på maskinen. Ladda 3 mikroliter pärlor i brunnarna och ladda sedan 10 mikroliter av varje PCR-reaktion som ska sekvenseras i motsvarande prov.Pipettera upp och ner för att blanda provet med magnetkulorna. Leta efter indikationen i den grundade pyrosequencern att skivan kan laddas i maskinen. Skruva loss plattans hållmutter och rikta in den laddade provplattan mot metallstiftet i skivfacket.När plattan är ordentligt fastskruvad i plattfacket, starta sekvenseringskörningen genom att trycka på startknappen på pekskärmsgränssnittet. När körningen är klar tar du bort USB-enheten från maskinen och ansluter den till datorn som kör pyrosequencerprogramvaran. När den nyligen genererade körningsfilen visas på USB-enheten dubbelklickar du på filen Kör resultat.Detta analyserar automatiskt luciferasproduktionen för varje brunn vid nukleotidinkorporering och kvantifierar den mitokondriella allelen av intresse. Leta efter färgpoängen som visas av programvaran baserat på kvaliteten på läsningarna. För att spara resultaten, välj Rapporter i det övre fönstret, följt av Fullständig rapport för att generera en PDF-fil som innehåller pyrogrammen och resultaten från varje brunn i körningen.Du kan också ladda ner resultaten i andra format under fliken Rapporter. Agarosgelelektrofores av en PCR-amplifiering med användning av amplifieringsprimrar från båda uppsättningarna valda för m. 3243A>G-mutationen som visas i denna figur.Här betecknar Het det nästan homoplasmatiska m. 3243A>G-provet som ska analyseras. En jämförelse av prestanda för båda primeruppsättningarna med molstandarder för kalibrering visas i denna figur.De uppmätta värdena betecknas med de vertikala prickade linjerna. En X = Y linjär funktion visas för att illustrera hur nära var och en av de två testade analyserna är en idealisk mätning. Namnen på cellinjerna på X-axeln är namnen på de olika cybridklonerna som genotypades med hjälp av denna analys.Genotypningsresultat på fyra cybridkloner av okänd m. 3243A>G heteroplasmi med båda analyserna visas här. Sekvenseringen utfördes i tekniskt tre exemplar.Genotypningsresultat av mitokondriella zinkfingernukleasbehandlade celler, tillsammans med obehandlade och mockbehandlade kontroller, och pyrogrammen från två MEF-cellprov PCR-replikat som används för att generera resultaten samt genotypkontrollen av vildtyp visas här. Pyrosequencing kan användas som avläsning för genterapiexperiment för att utvärdera olika genterapitekniker i mitokondriellt DNA.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Användning av primära humana fibroblaster för övervakning Mitokondriella fenotyper inom området för Parkinsons sjukdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifiering av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Transposoninsättningar i solida tumörer med Linker-medierad PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Insamling och Utvinning av saliv-DNA för nästa generations sekvense

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Enstegs Dynamic Reanimation av Smile i Irreversible ansiktsförlamning med gratis Funktionell Muscle Transfer

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal optisk avbildning<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av enda kärl Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Imaging Metaller i hjärnvävnad genom laserablation - induktivt kopplad plasma - masspektrometri (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Ett Ex Vivo vävnadsodling modell för fibrovaskulär komplikationer i proliferativ diabetesretinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Artros smärtmodell inducerad av intraartikulär injektion av monojodoacetat hos råttor

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Organ ischemi-reperfusion skada genom att simulera hemodynamic förändringar i råtta lever transplantation modell

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...