Name: genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Silvia Marchet ve Constanza Lamperti'ye (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) bu protokol için açıklayıcı örnekler olarak kullanılan m.3243A>G cybrid hücrelerini hazırladıkları ve sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Mitokondriyal Genetik Grubu (MRC-MBU, Cambridge Üniversitesi) üyelerine bu araştırma sırasında yararlı tartışmalar için teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma, İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi'nin (MC_UU_00015/4 ve MC_UU_00028/3) çekirdek finansmanı ile desteklenmiştir. P.A.N. ve P.S.-P. ayrıca sırasıyla Lily Vakfı ve Champ Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada kullanılan insan 3243A>G cybrid hücrelerinin ve ölümsüzleştirilmiş m.5024C>T MEF'lerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verilmiştir. Hasta hücreleri Cambridge Üniversitesi'nde toplanmadığı için bu durumda etik onay gerekli değildi. Bununla birlikte, insan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Pirosekans için örnek DNA'yı hazırlarken PCR kurulumu için en iyi uygulamaları takip etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Aynı primerlerin kullanıldığı sık amplifik...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+Structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66,083+human+genomes.">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li><li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics.">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li><li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations:+A+mini-review.">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li><li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA.">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li><li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mitochondrial+disease.">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li><li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing.">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases.">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li><li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations.">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs.">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li><li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo.">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li><li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation.">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing.">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li><li>Andr&#233;asson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology.">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes.">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li><li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing.">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li><li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MELAS+syndrome:+Clinical+manifestations,+pathogenesis,+and+treatment+options.">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li><li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+single-chain,+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA.">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li><li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA.">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li><li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy.">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li><li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology.">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li><li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A&gt;G+mitochondrial+disease:+The+role+of+nuclear+factors.">Phenotypic heterogeneity in m.3243A&gt;G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li><li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-&#946;1+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration.">OXPHOS dysfunction regulates integrin-&#946;1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li><li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease.">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li><li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction.">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).</li></ol>

Protokolün başarısı için kritik bir husus, özellikle düşük miktarda başlangıç malzemesi kullanıldığında kontaminasyondan kaçınmaktır. Numuneleri hazırlarken mümkün olduğunca UV davlumbaz ve filtrelenmiş pipet uçlarının kullanılması, ayrıca ön amplifikasyon ve amplifikasyon sonrası alanların ayrı tutulması önerilir. Boş ölçümler ve bilinen heteroplazmi örnekleri (vahşi tip DNA gibi), teknik veya biyolojik önyargıyı kontrol etmek için kıyaslama ölçütü olarak kullanılmak ?...

Mitokondriyal genom, matris olarak adlandırılan mitokondrinin en iç bölmesinde bulunan küçük (16.5 kb) dairesel moleküller (mtDNA) formunda bulunur ve mitokondriyal solunum zincirinin 13 alt birimini ve ayrıca mitokondriyal ribozom1 tarafından yerinde translasyonu için gerekli olan tRNA'ları ve rRNA'ları kodlar. Bu genom, mitokondriyal fonksiyon için gerekli olan tüm proteinlerin yaklaşık% 1'ini temsil eder, geri kalanı nükleer DNA (nDNA) tarafından kodlanır. Mitokondrilerin, alfa-proteobakteriyel bir ata ile atasal bir ökaryotik hücre arasındaki endosimbiyotik füzyon olayından türetildiği varsayılmaktadır. Bu varsayımsal simbiyoz gerçekleştikten sonra, mitokondrinin genetik bilgisi, modernsiyanobakterilerin genomlarıyla karşılaştırıldığında mtDNA'nın yukarıda belirtilen kompaktlığını açıklayan çağlar boyunca çekirdeğe kademeli olarak aktarıldı. Genlerin böyle bir transferi, mtDNA'da bulunan dizilere oldukça homolog olan uzun nDNA uzantılarının varlığı ile en güçlü şekilde kanıtlanmıştır. Bu nükleer mitokondriyal diziler (NUMT'ler), genotipleme sırasında yaygın bir yanlış yorumlama kaynağıdır ve mtDNA3'ü genotiplendirirken nükleer önyargıları önlemek için bazı önlemler alınmalıdır (Şekil 1A).
mtDNA'nın bir diğer ayırt edici özelliği, kopya sayısının hücre tipine bağlı olarak değişmesi vehücre başına on binlerce kopya 4 arasında herhangi bir yerde numaralandırılmasıdır. Bu çok kopyalı doğası nedeniyle, mtDNA, tek bir hücre içinde çok çeşitli genotipleri barındırabilir, bu da kromozomların zigotluğu göz önüne alındığında, nükleer genlerle ilişkili ayrık alellerin aksine, alellerin daha sürekli bir dağılımına neden olabilir. Mitokondriyal alellerin bu heterojenliği, tipik olarak belirli bir mutasyonun yüzde prevalansında belirli bir hücredeki toplam mtDNA'nın bir oranı olarak ifade edilen mitokondriyal heteroplazmi olarak adlandırılır. Heteroplazmi, bir hücrede bulunan benzersiz bir mtDNA türünü ifade eden homoplazmi ile karşılaştırılabilir.
Mitokondriyal heteroplazminin ölçülmesi, patojenik varyantları barındıran mtDNA moleküllerinin oranını ölçerken özellikle ilgi çekicidir. Bu tür varyantlar, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), küçük indeller veya büyük ölçekli delesyonlar şeklinde gelir5. Çoğu insan patojenik varyantlar için heteroplazmiktir; Bununla birlikte, genellikle eşik etkisi6 olarak adlandırılan bir fenomende patojenik mtDNA'nın daha yüksek heteroplazmi seviyelerinde ortaya çıkan herhangi bir klinik fenotip sergilemezler. Patojenite ile ilişkili değerler, patojenik mutasyonun doğasına ve meydana geldiği dokuya büyük ölçüde bağlı olsa da, tipik olarak% 60 heteroplazmi7'nin üzerindedir.
Mitokondriyal genotiplemenin yaygın olduğu birkaç araştırma alanı vardır. Tıp alanında, mtDNA mutasyonlarının test edilmesi veya ölçülmesi, birçoğu kökenleri olarak mtDNA anormalliklerine sahip olan mitokondriyal hastalıklar için bir tanı kriteri olarak hizmet edebilir5. İnsan patojenik mutasyonlarının incelenmesine ek olarak, mtDNA'da patojenik SNP'leri barındıran hayvan modellerinin prevalansının artması muhtemeldir, mitokondriyal olarak hedeflenmiş DddA kaynaklı sitozin baz editörleri (DdCBE'ler)8 ve adenin baz düzenlemesi için TALE bazlı deaminazlar (TALED'ler) tarafından sağlanan mitokondriyal baz düzenlemesinin son zamanlarda ortaya çıkması göz önüne alındığında9. Bu yaklaşım, anormal mitokondriyal genotipler ile ortaya çıkan işlev bozuklukları arasındaki etkileşimi anlamada etkili olacaktır. Ayrıca, insan mitokondriyal hastalıklarında terapötik bir strateji olarak nihai kullanım için mitokondriyal genomun, heteroplazmi kayması olarak bilinen bir yaklaşımla yeniden şekillendirilmesi için devam eden bilimsel araştırmalar da vardır. Bu araştırma alanı öncelikle mutasyona özgü nükleazların mitokondriyal matrise yönlendirilmesini içerir; bu, patojenik mtDNA'nın tercihli bozulmasına neden olur ve fenotip10,11,12,13'te kurtarmalara yol açar. Mitokondriyal genotipin yeniden şekillendirilmesini içeren herhangi bir deney, heteroplazmi kaymalarını değerlendirmek için sağlam bir nicel yöntem gerektirir.
MtDNA'yı genotiplemek için çok çeşitli yöntemler kullanılır ve bunlar mutasyonun doğasına göre değişir. Yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri, mtDNA'daki SNP'lerin nicelleştirilmesi söz konusu olduğunda daha hassastır; Bununla birlikte, bu yöntemler, özellikle numune sayısı küçükse, mitokondriyal heteroplazminin rutin nicelleştirilmesi için engelleyici derecede pahalı olmaya devam etmektedir. Sanger dizilimi, SNP'lerin algılanmasına da izin verebilir; Bununla birlikte, bu yaklaşım nicel değildir ve genellikle düşük heteroplazmi seviyelerini tespit etmekte başarısız olur veya yüksek heteroplazmileri tahmin ederken yanlış olabilir. Pyrosequencing, minimal hazırlık içeren ve herhangi bir mtDNA örneği için heteroplazminin hızlı bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayan bir tahlil olarak, bu iki uç nokta arasında uygun bir uzlaşma olarak önerilmektedir. Bu yöntem, adli analiz 14,15, klinik tanı 16 veya mtDNA'nın tek hücrelerden genotiplenmesi 17 dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda çok sayıda araştırmacı tarafından mitokondriyal SNP'leri ölçmek için rutin olarak kullanılmıştır.
Bu tahlil, mtDNA'da SNP'yi çevreleyen bir bölgenin ilk PCR preamplifikasyon adımını içerir ve bunu daha önce üretilen amplikonun bir ipliğini kullanarak sentez yoluyla bir sıralama testi izler. Ön amplifikasyon adımında kullanılan iki primerden biri, 5' ucunda biyotinillenmelidir, bu da pirozanslama aparatının, dizileme reaksiyonu için şablon olarak kullanılacak tek DNA ipliğini izole etmesini sağlayacaktır. Üçüncü bir dizileme primeri daha sonra tutulan biyotinile iplikçik üzerine tavlanır, bu da deoksinükleotidler olarak ortaya çıkan DNA sentezinin reaksiyon odasına önceden tanımlanmış bir sırayla dağıtılmasına izin verir. Pirosequencer, ışıldayan bir okumaya dayanarak dahil edilen her bir bazın miktarını kaydeder ve DNA sentezi üzerine mutant ve vahşi tip mitokondriyal alellerin nispi nicelleştirilmesine izin verir (Şekil 1B). Lüminesans, ATP varlığında ışık yayan bir lusiferaz enzimi tarafından üretilir, bu da bir ATP sülfürilazın her bir nükleotid tarafından salınan pirofosfatlardan her birleşme olayında de novo sentezlediği ışığı yayar. Bu iki reaksiyon şu şekilde özetlenebilir:
1. PPi (nükleotid birleşmesinden) + APS → ATP + sülfat (ATP sülfürilaz)
2. ATP + lusiferin +O2 → AMP + PPi + oksilüsiferin + CO2 + ışık (lusiferaz)
İkinci reaksiyonda lusiferaz ile çapraz reaksiyona giren ATP olmadan pirosequencer tarafından adenin bazlarının tespit edilmesi bir zorluktur. Bununla birlikte, bu, DNA sentezi için bir adenin analoğu, yani dATPαS kullanılarak çözülür. Lusiferaz için mükemmel bir substrat olmamasına rağmen, pirosequencer tarafından dijital olarak ayarlanan ve 0.9 faktörüne ayarlanan diğer üç nükleotid ile karşılaştırıldığında daha güçlü bir lüminesans üretir. Bu doğal değişkenlik nedeniyle, SNP pozisyonunda adenin diziliminden kaçınılması önerilmektedir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).
Aşağıdaki protokol, pirozanslama ile mtDNA heteroplazmi değerlendirme yöntemini detaylandırmakta ve mtDNA'daki SNP'leri genotiplendirirken biyolojik veya teknik önyargıyı önlemek için amplifikasyon primerlerinin tasarımında gerekli önlemleri özetlemektedir. İkincisi, astar setlerinin dijital olarak incelenmesini ve seçilmesini, ön amplifikasyon PCR'sinin optimize edilmesini ve son olarak tahlilin sıralanmasını ve rafine edilmesini içerir. İki uygulamalı örnek tahlil gösterilmiştir: birincisi, en yaygın insan patojenik varyantı m.3243A>G18'in optimizasyonu ve ikincisi, Cambridge 10,11,12,19,20,21,22'deki Minczuk laboratuvarında geliştirilen teknolojiler kullanılarak heteroplazmi kayması geçiren fare embriyonik fibroblast (MEF) hücrelerinin genotiplenmesi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Assay Design&#160;2.0</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Absorber Strips&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Autoprep&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Cartridge Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Disks</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark Q48 Magnetic beads&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>974203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q48 Software License (1)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>9024325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial genome by pyrosequencing

Mitokondriyal genomdaki (mtDNA) mutasyonlar maternal kalıtsal genetik hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, mtDNA polimorfizmlerine olan ilgi, mtDNA mutagenezi ile model üretme yeteneğinin yakın zamanda geliştirilmesi ve mitokondriyal genetik anormallikler ile kanser, diyabet ve demans gibi yaşa bağlı yaygın hastalıklar arasındaki ilişkinin yeni bir şekilde değerlendirilmesi nedeniyle son yıllarda artmıştır. Pyrosequencing, rutin genotipleme deneyleri için mitokondriyal alanda yaygın olarak kullanılan bir sentez yoluyla sıralama tekniğidir. Masif paralel dizileme yöntemleriyle karşılaştırıldığında göreceli olarak satın alınabilirliği ve uygulama kolaylığı, onu mitokondriyal genetik alanında paha biçilmez bir teknik haline getirmekte ve heteroplazminin artan esneklikle hızlı bir şekilde nicelleştirilmesine izin vermektedir. Bu yöntemin pratikliğine rağmen, mtDNA genotiplemesinin bir aracı olarak uygulanması, özellikle biyolojik veya teknik kökenli belirli önyargılardan kaçınmak için belirli kılavuzların gözlemlenmesini gerektirir. Bu protokol, heteroplazmi ölçümü bağlamında kullanılmak üzere pyrosequencing testlerinin tasarlanması ve uygulanmasında gerekli adımları ve önlemleri özetlemektedir.

Bu bölümde, insan patojenik mtDNA mutasyonu için bir pirozanslama testinin örnek optimizasyonunun yanı sıra, mitokondriyal çinko parmak nükleazları (mtZFN'ler) ile tedavi edilen heteroplazmik (m.5024C>T) fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) genotiplendirilmesinden elde edilen dizileme verileri sunulmaktadır. Tahlilin insan hücreleri için optimize edilmesi ve iki farklı tahlilin karşılaştırılması, en doğru olanın nasıl seçileceğini gösterirken, ikinci örnekte genetiği değiştirilmiş M...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing at JoVE.com

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki tek nükleotid polimorfizmlerini genotiplemek için kullanılabilen sentez tekniği ile bir dizilemedir. Bu yöntem, diğer sıralama yöntemlerine kıyasla uygulama kolaylığı ve maliyet etkinliği açısından avantajlıdır. Mitokondriyal DNA'daki patojenik varyantların heteroplazmi değerlerini belirleyerek bazı mitokondriyal hastalıklar için tanı yöntemi olarak kolayca kullanılabilir.Başlamak için, genotiplendirilen türler için bir mitokondriyal DNA dizi dosyası elde edin ve tek nükleotid polimorfizminin veya SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun. SNP sahasının yukarı ve aşağı akış yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarım yazılımına yapıştırın.Polimorfik tabanı vurgulayın, üzerine sağ tıklayın ve ardından analiz edilen SNP tabanını pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlamak için Hedef Bölgeyi Ayarla'yı seçin. Astar seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki Oynat simgesine basın ve yazılımın otomatik olarak astar üçlüsünü, şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pirozanslama makinesindeki sentez ile sıralama için üçüncü astarı oluşturmasını bekleyin. Sağ tıklayın ve tüm astar setlerini korumak için Tüm Astar Setlerini Kopyala'yı seçin.Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın, Yeni Tahlil'i seçin, ardından alel niceleme testi şablonunu seçin. Analiz edilecek dizayı, dizileme astarının doğrudan aşağı yönündeki nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin.Dağıtım Sırası Oluştur'a basın ve yazılımın sentez reaksiyonu ile dizilemede dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin. Kaydedin ve test için bir ad verin. Daha sonra, analiz edilecek DNA'yı mikrolitre başına 5 nanograma seyrelterek çalıştırmayı gerçekleştirin.İlk çalıştırmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun. Daha sonra, amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 5 mikrolitre seyreltilmiş DNA ve 25 mikrolitre reaksiyondan oluşan bir ön dizileme PCR'si gerçekleştirin. Dosya kurulumunu çalıştırmak için, pirosequencer yazılımında Yeni Çalıştır'ı seçin.Pirosequencer, bir pyrosequencing diski üzerinde tek bir dizileme kuyusunu temsil eden boş bir kare ile 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu aynı anda sıralayabilir. Bir kareye sağ tıklayıp Testi Yükle'yi seçerek tahlilleri yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu otomatik olarak ayarlayın. Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadığınız sürece çalışma modunu standart olarak ayarlayın. Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun.Ardından çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin. Pirosequencer'ı hazırlamak için, cihazın ana dokunmatik ekranındaki temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların saat 9 pozisyonunda buluştuğundan emin olun.USB belleği taktıktan sonra, daha önce hazırlanan çalıştırma dosyalarını yüklemek için Sırala düğmesine basın. Reaktifleri, gerektiği gibi, makinedeki ilgili enjektörlere yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin. Kuyucuklara 3 mikrolitre boncuk yükleyin ve ardından ilgili numuneye dizilenmek üzere her PCR reaksiyonunun 10 mikrolitresini yükleyin.Numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğine dair göstergeyi arayın. Plaka tutma somununu sökün ve yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalayın.Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Yeni oluşturulan çalıştırma dosyası USB sürücüsünde göründükten sonra, Sonucu Çalıştır dosyasına çift tıklayın.Bu, nükleotid birleşmesi üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve ilgilenilen mitokondriyal aleli nicelleştirir. Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen renk puanlarını arayın. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı ve ardından Tam Rapor'u seçerek pirogramları ve çalıştırmanın her bir kutusundan elde edilen sonuçları içeren bir PDF dosyası oluşturun.Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz. Bu şekilde gösterildiği gibi m. 3243A>G mutasyonu için seçilen her iki setten amplifikasyon primerleri kullanılarak bir PCR amplifikasyonunun agaroz jel elektroforezi.Burada Het, analiz edilecek neredeyse homoplazmik m. 3243A>G örneğini belirtir. Kalibrasyon için molar standartlar kullanılarak her iki astar setinin performansının bir karşılaştırması bu şekilde gösterilmiştir.Ölçülen değerler dikey noktalı çizgilerle gösterilir. Test edilen iki tahlilin her birinin ideal bir ölçüme ne kadar yakın olduğunu göstermek için bir X = Y doğrusal fonksiyonu görüntülenir. X eksenindeki hücre çizgilerinin adları, bu tahlil kullanılarak genotiplendirilen çeşitli cybrid klonlarının adlarıdır.Her iki tahlil kullanılarak bilinmeyen m. 3243A>G heteroplazmisinin dört cybrid klonu üzerinde genotipleme sonuçları burada gösterilmiştir. Sıralama teknik üçlü olarak yapıldı.Mitokondriyal çinko parmak nükleazı ile tedavi edilen hücrelerin genotipleme sonuçları, tedavi edilmemiş ve alay ile tedavi edilmiş kontroller ve sonuçları üretmek için kullanılan iki MEF hücre örneği PCR replikasından elde edilen pirogramlar ve vahşi tip genotipleme kontrolü burada gösterilmiştir. Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki çeşitli gen terapisi teknolojilerini değerlendirmek için gen terapisi deneyleri için bir okuma olarak kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Single-stage Dynamic Reanimation of the Smile in Irreversible Facial Paralysis by Free Functional Muscle Transfer

Ücretsiz Fonksiyonel kas transferi ile geri dönüşümsüz Yüz felci içinde Smile Tek aşamalı Dinamik Reanimasyon

Unilateral facial paralysis is a common disease that is associated with significant functional, aesthetic and psychological issues. Though idiopathic ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz<em&gt; In Vivo</em&gt;: Tek Gemi İnme Bir Model

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

İndaktif Plazma - - Lazer Ablasyon Beyin Dokusu Görüntüleme Metaller Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Sıçanlarda Mono-İyodoasetatın Eklem İçi Enjeksiyonu ile İndüklenen Osteoartrit Ağrı Modeli

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Sıçan Karaciğer Nakli Modelinde Hemodinamik Değişiklikleri Simüle Ederek Organ İskemi-Reperfüzyon Yaralanması

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...