Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

نود أن نشكر جوناس ريس ومختبر ريس على مشاركة مخازن التصوير لتصوير SMLM. نشكر أيضا Yumi Kim على سلالة C. elegans المستخدمة في هذا البروتوكول و Abby F. Dernburg على الجسم المضاد للدجاج المضاد ل HTP-3. نشكر ماركو لامب وستيفان تيريونغ من مرفق الفحص المجهري الضوئي المتقدم في EMBL هايدلبرغ على دعمهما في استخدام مجهر أوليمبوس iXplore SPIN SR متحد البؤر. تم دعم هذا العمل من قبل المختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية و Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية - 452616889 ، SK). نحن نقدر الوصول والخدمات التي يقدمها مركز التصوير في المختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية (EMBL IC)، بدعم سخي من مؤسسة بوهرنجر إنجلهايم.

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

لوحظ التنظيم الشبيه بالسلم ل SC ، وهو أمر ضروري لإعادة التركيب الصحيح وفصل الكروموسومات المتماثلة ، لأول مرة منذ ما يقرب من 70 عاما في المجهر الإلكتروني 3,4. في حين أن التنظيم العام ل SC يتم حله بسهولة في المجهر الإلكتروني ، فإن توطين المكونات الفردية داخل هذا المجمع يتطلب نهجا أكثر استهدافا. مع عرضه ~ 100 نانومتر فقط ، لا يمكن حل البنية التحتية ل SC بواسطة الفحص المجهري الفلوري التقليدي. ومع ذلك ، أصبح الفحص المجهري فائق الدقة محركا رئيسيا للاكتشافات الجديدة حول بنية ووظيفة المجمع المشبكي 16،19،24،25،26،27،28،29،30. لتسهيل هذا البحث ، قمنا بإظهار إجراء تركيب يسمح بدراسة بنية SC داخل أنسجة الغدد التناسلية C. elegans باستخدام الفحص المجهري SMLM و STED.
تتمثل الخطوة الحاسمة لتحسين الدقة في تصوير SMLM في ربط أنسجة الخط الجرثومي مباشرة بغطاء مطلي ب poly-L-lysine (الخطوة 4). يعد الارتباط التساهمي للأنسجة بغطاء الغطاء ضروريا لتقليل الحركات داخل العينة التي من شأنها أن تؤدي إلى انجرافات كبيرة وتجعل التصوير على مدى فترات طويلة من الزمن ل SMLM مستحيلا. بالإضافة إلى ذلك ، حتى المرفق دون المستوى الأمثل الذي يترك النوى التي تحتوي على SCs على مسافة من غطاء الغطاء يؤدي إلى انخفاض كبير في الدقة التي يمكن تحقيقها الناتجة عن الانحرافات الكروية (الشكل 4). بدلا من الملحق التساهمي المستخدم هنا ، يمكن أيضا تثبيت أنسجة الخط الجرثومي الملطخة بين غطاءين مختومين في قطرة صغيرة من مخزن التصويرالمؤقت 19,30. ومع ذلك ، فإن طريقة التثبيت هذه تقلل بشدة من حجم المخزن المؤقت للتصوير في العينة من 1 مل المستخدم في البروتوكول الأمثل هنا إلى بضعة ميكرولتر فقط ، مما سيؤدي إلى تحمض المخزن المؤقت للتصوير وتقليل الوقت الذي يمكن فيه تصوير العينةبشدة 38،53،54.
تحد أوقات الاستحواذ الطويلة لكل من الفحص المجهري SMLM و STED من استخدام هذه الطرق لتصوير العينات الثابتة كيميائيا. هنا ، يضمن تثبيت بارافورمالدهيد الحفاظ على هيكل SC أثناء تحضير العينات والتصوير. ومع ذلك ، على الرغم من الاحتياطات المتخذة هنا لتصوير SC داخل الأنسجة السليمة ، فإن البنية الناتجة من SC بعد التثبيت ليست بالضرورة مطابقة للبنية في حالتها الأصلية داخل كائن حي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن صورة واحدة من SC الثابت تمثل "لقطة" واحدة للبنية البيولوجية ، فإن هذا النهج يظل أعمى عن ديناميكيات البنية الأصلية في الجسم الحي.
ومع ذلك ، يمكن أيضا الحصول على معلومات حول ديناميات وتنوع الهياكل الجزيئية الكبيرة من خلال الحصول ليس فقط على "لقطة" واحدة ولكن العديد من "اللقطات". في حين أن هذا النهج يمكن أن يحل التغييرات في بنية SC خلال pachytene19 ، هناك العديد من العوامل التي تحد من عدد الصور التي يمكن الحصول عليها من عينة واحدة معدة باستخدام هذا البروتوكول. أولا ، تؤدي قوى الليزر العالية المستخدمة أثناء الحصول على الصور إلى تبييض دائم للفلوروفورات وتمنع تصوير المناطق المجاورة ذات الأهمية أو مستويات z المتعددة ، مما يقلل بشكل كبير من عدد الصور التي يمكن الحصول عليها من عينة واحدة. ثانيا ، كثافة العينة / الأنسجة على غطاء الغطاء المعد بهذه الطريقة منخفضة ، مما يحد بشكل كبير من عدد الصور التي يمكن الحصول عليها من غطاء واحد. تحظر كثافة العينة المنخفضة أيضا استخدام خطوط أنابيب الحصول على الصور الآلية التي ساعدت في إلقاء الضوء على الأسئلة البيولوجية الأخرى34،55،56،57،58،59. ومع ذلك ، يمكن زيادة كثافة العينة قليلا بواسطة مستخدم متمرس.
تم تحسين البروتوكول المقدم هنا للحصول على كثافة عالية لوضع العلامات اللازمة لتحقيق الدقة المثلى في SMLM35. في حين أن البروتوكولات السابقة تربط الأنسجة تساهميا بالغطاء قبل التلطيخ المناعي16 ، فإن هذا البروتوكول الجديد يربط الأنسجة بالغطاء فقط بعد تلطيخ العينات في المحلول. يسمح هذا التعديل للأجسام المضادة المستخدمة في وضع العلامات المناعية بالوصول بحرية إلى الأنسجة من جميع الجوانب ، في حين أن الارتباط التساهمي للأنسجة بالغطاء قد يقيد الأجسام المضادة من الوصول إلى النوى الأقرب إلى الغطاء ، وبالتالي تقليل درجة وضع العلامات. تعمل التعديلات الموضحة هنا معا على تحسين الدقة من 40-50 نانومتر (دقة FRC)16 إلى 30-40 نانومتر (هذا البروتوكول).
الأهم من ذلك ، في حين أن كثافة وضع العلامات العالية والتركيز العالي للأجسام المضادة أمر ضروري ل SMLM ، وجدنا أنه يتم الحصول على صور مجهرية أفضل STED باستخدام تركيزات أقل من الأجسام المضادة (الخطوة 3). بدقة عشرات النانومتر ، يصبح حجم الجزيئات المستخدمة لتسمية البروتين محل الاهتمام ذا أهمية متزايدة. لذلك استخدمنا شظايا F (ab') 2 التي تبلغ نصف حجم الأجسام المضادة كاملة الطول. سمح التحسن في التباين المحلي بسبب مصدر إشارة أصغر ، وبالتالي الدقة المكتسبة من هذا التعديل مقارنة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية كاملة الطول ، بحل اثنين من C-termini من SYP-5 داخل المنطقة الوسطى بواسطة TauSTED ، والتي لم يتم حلها بواسطة STED التقليدي باستخدام الأجسام المضادة كاملة الطول (16 والبيانات غير معروضة). نتوقع أن هذا البروتوكول الأمثل لتصوير SCs في الخطوط الجرثومية C. eleganالسليمة سيسهل التحقيق في العلاقة بين البنية والوظيفة ل SC أثناء الانقسام الاختزالي.

يعد تقليل عدد الكروموسومات بمقدار النصف أثناء الانقسام الميوزي أمرا أساسيا لتوليد ذرية صحية في الكائنات الحية التي تتكاثر جنسيا. لتحقيق هذا الانخفاض في عدد الكروموسومات، يجب أن تتزاول الكروموسومات المتماثلة وتنفصل أثناء الانقسام الميوزي الأول. لضمان الفصل الدقيق للكروموسومات المتماثلة ، تخضع الخلايا الجرثومية للطور التمهيدي الأول الممتد ، حيث تتزاوج الكروموسومات المتماثلة ، وتشبك ، وتعيد الاتحاد لتوليد روابط مادية بين المتماثلات1. برزت SC كهيكل مركزي أساسي في تنظيم التقدم الصحيح من خلال الطور الاختزالي2.
SC عبارة عن مركب يتم الحفاظ على هيكله العام تطوريا ، على الرغم من وجود القليل من التماثل بين مكوناته البروتينية. تم تحديد SC لأول مرة في الصور المجهرية الإلكترونية على أنها بنية ثلاثية تشبه السلم تتكون من عنصرين أو محورين جانبيين ، ومنطقة مركزية تتكون من خيوط عرضية ، وعنصر مركزي 3,4. يعد تحديد تنظيم المكونات الفردية داخل المجمع أمرا أساسيا لتعزيز فهمنا لدور اللجنة العليا خلال الطور الاختزالي.
يعتبر الكائن الحي النموذجي C. elegans مناسبا بشكل مثالي لدراسة بنية ووظيفة SC نظرا لأن خطوطه الجرثومية تحتوي على عدد كبير من النوى الاختزالية مع SCs المجمعة بالكامل5. كشفت الدراسات الجينية والكيميائية الحيوية أن محاور الكروموسوم تتكون من ثلاثة مجمعات متماسكة متميزة6،7 وأربعة بروتينات مجال HORMA تسمى HTP-1/2/3 و HIM-3 7،8،9،10،11 في C. elegans. في المنطقة الوسطى من SC ، تم تحديد ستة بروتينات تحتوي على مجالات لفائف ملفوفة حتى الآن12،13،14،15،16،17. لسد المسافة بين المحورين ، يتم تضخيم SYP-1 و -5 و -6 بطريقة وجها لوجه (الشكل 1) ، بينما تعمل ثلاثة بروتينات إضافية على استقرار تفاعلها في العنصر المركزي16،17،18،19.
يعد الحصول على رؤية تفصيلية لتنظيم هذه البروتينات أمرا ضروريا لفهم وظائف SC العديدة أثناء الانقسام الاختزالي. نظرا لأن عرض المنطقة المركزية من SC هو ~ 100 نانومتر فقط ، فلا يمكن حل بنيتها التحتية عن طريق الفحص المجهري الفلوري المحدود الحيود. ومع ذلك ، فإن تصور المكونات داخل هيكل بهذا الحجم يمكن تحقيقه بسهولة عن طريق الفحص المجهري فائق الدقة. في الواقع ، ظهر مجهر الإضاءة الهيكلي (SIM) ، والمجهر التوسعي 20 ، والمجهر المستنفد للانبعاثات المحفزة (STED) 21 ، والمجهر التعريبي أحادي الجزيء (SMLM)22،23 كأدوات أساسية لدراسة البنية الجزيئية ل SC عبر الأنواع16،24،25،26،27،28،29 ، 30.
للتغلب على حد الدقة ، يعتمد الفحص المجهري STED على تراكب البقعة المحدودة للحيود لضوء الانبعاث بحزمة على شكل دونات من ليزر STED ، والذي يضيق نظريا وظيفة انتشار النقطة وصولا إلى الأبعاد الجزيئية31,32. ومع ذلك ، فإن الدقة التي يمكن تحقيقها عمليا بواسطة STED ضمن العينات البيولوجية تظل في نطاق بضع عشرات من النانومتر في xy33.
يمكن الحصول على دقة أعلى في العينات البيولوجية باستخدام تقنيات SMLM. يسخر SMLM الخصائص الوامضة لفلوروفورات معينة لحل الأشياء على مستوى الحيود الفرعي عن طريق فصل الفلوروفورات المتداخلة مكانيا في الوقت المناسب. ثم يتم تصوير العينة بشكل متكرر لالتقاط مجموعات فرعية مختلفة من الفلوروفور. ثم يتم تحديد موضع الفلوروفورات داخل العينة عن طريق تركيب وظيفة انتشار النقطة (PSF) للإشارات التي تم الحصول عليها عبر جميع الصور ، والتي يمكنها حل الهياكل حتى 15 نانومتر23,34.
مجتمعة ، تشفر الصور المترجمة مواضع جميع الفلوروفورات. يتم تحديد دقة SMLM من خلال كثافة وضع العلامات وخصائص وميض الفلوروفور. وفقا لمعيار Nyquist-Shannon ، من المستحيل حل الكائنات التي تقل عن ضعف متوسط المسافة من الملصق إلى الملصق بشكل موثوق. وبالتالي ، هناك حاجة إلى كثافة عالية لوضع العلامات للتصوير عالي الدقة. بالنسبة إلى SC في C. elegans ، يمكن تحقيق كثافة عالية لوضع العلامات باستخدام علامات epitope المرفقة بمواقع محددة من البروتينات الداخلية باستخدام تحرير الجينوم. يمكن بعد ذلك تلطيخ علامات epitope بكثافة عالية باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة محددة ذات صلات عالية19,30. في الوقت نفسه ، يجب أن تكون دورة الفلوروفورات الفردية قصيرة بما يكفي لضمان عدم التقاط الفلوروفورات المتداخلة مكانيا في نفس الوقت35.
بسبب هذين الشرطين ، يتطلب حل بنية المجمعات الجزيئية الكبيرة مثل SC تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الصور ، وبالتالي يمكن أن يستغرق عدة ساعات. مأزق أوقات التصوير الطويلة هو أن العينات تميل إلى الانجراف بسبب حركة المرحلة أو التيارات الصغيرة داخل المخزن المؤقت للعينة. حتى الحركات الصغيرة في حدود 10 نانومتر ضارة بدقة نانومتر ويجب تصحيحها. ومع ذلك ، فإن طرق تصحيح الانجراف المستخدمة بشكل شائع ليست قوية بما يكفي لتراكب الصور بدقة لقناتين تم تصويرهما بالتتابع36. هذا يمثل مشكلة لأن الأسئلة البيولوجية غالبا ما تتطلب الكشف الدقيق وتحديد موقع أهداف متعددة داخل نفس العينة. للتحايل على هذه القضايا ، تم تطوير طرق مثل التصوير النسبي. يسمح التصوير النسبي بالتصوير المتزامن للعديد من الفلوروفورات ذات أطياف الإثارة والانبعاث المتداخلة ، مع تخصيص لاحق لكل إشارة مكتشفة إلى الفلوروفور الخاص بها بناء على نسبة الشدة في القنوات المتميزة طيفيا37,38.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن دراسة تنظيم المجمعات الجزيئية مثل SC تتطلب معلومات ثلاثية الأبعاد (3D). لتحقيق دقة فائقة في ثلاثة أبعاد (3D-SMLM) ، يتم دمج عدسة أسطوانية في المسار البصري للضوء المنبعث الذي يشوه شكل PSF للفلوروفور اعتمادا على بعده عن المستوى البؤري. ومن ثم ، يمكن استقراء الموضع الدقيق للفلوروفور في المستوى z من خلال تحليل شكل إشارة الانبعاث35,39. الجمع بين هذه التطورات في SMLM يسمح لتصوير تنظيم 3D من المجمعات الجزيئية ، بما في ذلك SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

أثناء الانقسام الميوزي، يجب أن تتعرف الكروموسومات المتماثلة على بعضها البعض وتلتصق بعضها ببعض للسماح بفصلها الصحيح. أحد الأحداث الرئيسية التي تؤمن تفاعل الكروموسومات المتماثلة هو تجميع المركب المشبكي (SC) في الطور الأول الاختزالي. على الرغم من وجود القليل من التماثل التسلسلي بين مكونات البروتين داخل SC بين الأنواع المختلفة ، فقد تم الحفاظ على الهيكل العام ل SC بشكل كبير أثناء التطور. في الصور المجهرية الإلكترونية ، يظهر SC كهيكل ثلاثي يشبه السلم يتكون من عناصر أو محاور جانبية ، وخيوط عرضية ، وعنصر مركزي. 
ومع ذلك ، فإن التحديد الدقيق لتوطين المكونات الفردية داخل المجمع بواسطة المجهر الإلكتروني لتحديد التركيب الجزيئي ل SC لا يزال يمثل تحديا. على النقيض من ذلك ، يسمح الفحص المجهري الفلوري بتحديد مكونات البروتين الفردية داخل المجمع. ومع ذلك ، نظرا لأن SC يبلغ عرضه ~ 100 نانومتر فقط ، فلا يمكن حل بنيته التحتية عن طريق الفحص المجهري الفلوري التقليدي المحدود الحيود. وبالتالي ، فإن تحديد البنية الجزيئية ل SC يتطلب تقنيات مجهرية ضوئية فائقة الدقة مثل مجهر الإضاءة المهيكل (SIM) ، أو الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، أو الفحص المجهري لتوطين الجزيء الواحد (SMLM). 
للحفاظ على بنية وتفاعلات المكونات الفردية داخل SC ، من المهم مراقبة المجمع في بيئة قريبة من بيئته الأصلية في الخلايا الجرثومية. لذلك ، نظهر بروتوكولا للكيمياء والتصوير المناعي يتيح دراسة البنية التحتية ل SC في أنسجة الخط الجرثومي Caenorhabditis elegans السليمة والمبثوقة باستخدام الفحص المجهري SMLM و STED. يقلل تثبيت الأنسجة مباشرة على الغطاء من حركة العينات أثناء التصوير ويقلل من الانحرافات في العينة لتحقيق الدقة العالية اللازمة لتصور البنية التحتية ل SC في سياقها البيولوجي.

لتصوير SC داخل نسيج الخط الجرثومي C. elegans بواسطة SMLM ، استخدمنا 3D-SMLM بنسبة 2 لون لتوطين HTP-3 ، وهو أحد مكونات محاور الكروموسوم ، والنهاية C للخيوط المستعرضة SYP-5 الموسومة داخليا بعلامة هيماجلوتينين (HA). تم تحديد موقع كلا البروتينين داخل SC من C. elegans سابقا من خلال دراسات أخرى16,30.
لتقليل تشتت الضوء والانحرافات البصرية المتأصلة في العينات البيولوجية السميكة ، قمنا بتصوير الجزء z السفلي من النوى الاختزالية التي تحتوي على SCs (الشكل 3 ، الخطوط الصفراء). لكل صورة تم الحصول عليها ، تم تمييز موضع مرحلة بيزو لمستوى التصوير بالنسبة إلى موضع مرحلة بيزو عندما كان الهدف مركزا على الغطاء. هذا سمح بحساب مسافة بيزو من الغطاء. يتم تثبيت العينات المثبتة بنجاح بثبات بالقرب من الغطاء وتحتفظ بشكل الغدد التناسلية (أي ، لا يتم سحق الأنسجة بين الغطاءين أثناء خطوة ما بعد التثبيت). يمكن تقييم جودة تركيب العينة بسهولة تحت مجهر ستيريو لأن الغدد التناسلية المرفقة جيدا لا تظهر أي حركة في المحلول (الخطوة 4.2.6). ومع ذلك ، نظرا لعشوائية عملية التركيب ، لن يتم بالضرورة وضع أنسجة الغدد التناسلية بشكل مسطح تماما على الغطاء. لذلك ، يمكن العثور على المستوى السفلي للنوى التي تحتوي على SCs على مسافات متفاوتة بالنسبة إلى غطاء الغلاف داخل نفس الغدد التناسلية.
لتوضيح كيفية تغير الدقة اعتمادا على ارتباط الأنسجة بغطاء الغطاء ، حصلنا على صور على مسافات بيزو مختلفة إلى غطاء الغطاء. لتقييم جودة صورة فردية ، تم حساب منحنيات ارتباط حلقة فورييه (FRC)50,51 وتم تحديد الدقة باستخدام المكون الإضافي FRCResolution داخل برنامج SMAP48. يتم عرض نواتين تمثيليتين مستخرجتين من صورتين منفصلتين 3D-SMLM تم التقاطهما على مسافات مختلفة إلى غطاء الغطاء في الشكل 4. في SCs الواقعة بالقرب من الغطاء ، يتم حل محاور الكروموسوم والنهاية C ل SYP-5::HA بشكل جيد في جميع الأبعاد الثلاثة (الشكل 4A ، 0.8 ميكرومتر من غطاء الغطاء). لحل هيكلين مفصولين بمسافة معينة ، يجب أن تكون دقة FRC المحققة بشكل عام أصغر من نصف هذه المسافة في الدقة المحورية.
لفصل نفس الهياكل بشكل جانبي ، يجب تحقيق قيم دقة FRC أصغر. في الواقع ، في العينات التي تقع على مقربة من غطاء الغطاء ، تبلغ دقة FRC 38 نانومتر لقناة AlexaFluor 647 و 34 نانومتر لقناة CF680 ، وبالتالي أقل بكثير من المسافة المتوقعة البالغة 84 نانومتر بين C-termini ل SYP-516. وبالتالي فإن هذا القرار يحل بسهولة تنظيم مجلس الأمن ليس فقط في المناظر الأمامية ولكن أيضا في المناظر الجانبية (الشكل 4B i ، ii). على النقيض من ذلك ، تتدهور الدقة في SCs الواقعة على مسافة 5 ميكرومتر من غطاء الغطاء بسبب تشتت الضوء والانحرافات الكروية (الشكل 4 ب). تنخفض دقة FRC عند هذه المسافة إلى 47 نانومتر (AlexaFluor 647) و 41 نانومتر (CF680) ، والتي لا يمكنها حل C-termini ل SYP-5 بالكامل. نظرا لأن الانحرافات البصرية تضعف الدقة الجانبية بشكل أكثر حدة من الدقة المحورية ، لم يعد يتم حل نطاقات HTP-3 و SYP-5 بوضوح في المقطع العرضي للعرض الجانبي في العينات الموجودة على مسافة 5 ميكرومتر من الغطاء (الشكل 4B ii). كشفت مقارنة دقة FRC للصور التي تم الحصول عليها على مسافات بيزو مختلفة من الغطاء أن الأنسجة المصورة يجب ألا تزيد عن 2 ميكرومتر من الغطاء (الشكل 5). تسلط هذه النتيجة الضوء على أهمية التنفيذ الصحيح لخطوة ما بعد التثبيت ، والتي يجب خلالها ربط الأنسجة بنجاح بطلاء poly-L-lysine لغطاء الغطاء.
لإثبات الدقة التي يمكن تحقيقها باستخدام تقنية أخرى فائقة الدقة ، قمنا أيضا بتصوير SCs في أنسجة جرثومية ثابتة سليمة باستخدام الفحص المجهري TauSTED. يوضح الشكل 6A صور TauSTED بأعلى وأدنى دقة تم تحقيقها في هذه الدراسة كما تم تقديرها من ملفات تعريف خط SC في المنظر الأمامي (الشكل 6B). في كلتا النواتين ، يمكننا حل نطاقي التوطين ل HTP-3 في محاور الكروموسوم و C-termini ل SYP-5 في المنطقة الوسطى ، مما يدل على أن الدقة التي يمكن تحقيقها في TauSTED باستخدام هذا البروتوكول الأمثل أقل من 84 نانومتر. في ظل الظروف المثلى (الشكل 6A ، أعلى) ، يمكننا حل C-termini في مناظر مائلة قليلا ل SC مفصولة ب 50 نانومتر فقط (الشكل 6A ، مستطيل أصفر و 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لتنظيم المجمع المتشابك في Caenorhabditis elegans. يظهر الرسم الكاريكاتوري بنية مبسطة ل SC في C. elegans تسد بين كروموسومين متماثلين (رمادي). يظهر الهيكل في طرق العرض الأمامية والجانبية والمقطعية. تعرض محاور الكروموسومات في صورة أشرطة حمراء، بينما تظهر الخيوط المستعرضة باللون السماوي. يتم توجيه بروتينات الخيوط المستعرضة (SYP-1 ، 5 ، 6 في C. elegans) بطريقة وجها لوجه (رسومات عصا الكرة السماوية) في المنطقة الوسطى لسد المسافة بين المحورين. يشار إلى المسافات المتوقعة بين المحاور و C-termini للخيوط المستعرضة. اختصار: SC = مجمع متشابك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> الشكل 2: رسم توضيحي لتحضير العينة المستخدمة في الدراسة . (أ) يتم تشريح صغار C. elegans البالغين عند رؤوسهم أو ذيلهم (خطوط خضراء متقطعة) ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. (ب) يشار إلى الخطوات الفردية للطريقة برسومات متصلة بأسهم رمادية. الاختصارات: STED = استنفاد الانبعاثات المحفزة ؛ SMLM = مجهر توطين جزيء واحد ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> الشكل 3: موقع مقطع الأنسجة الذي يمكن ملاحظته بواسطة مجهر توطين جزيء واحد. MIP لصورة متحدة البؤر لقرص دوار لجبل كامل C. elegans الغدد التناسلية. تم تلطيخ الأنسجة ل HTP-3 والنهاية C ل SYP-5 (SYP-5::HA) ، وتظهر الإشارة المدمجة باللون الرمادي. تم خياطة الصور البؤرية الفردية باستخدام المكون الإضافي Grid / Collection stitch Fiji52 لإنشاء صورة للغدد التناسلية بأكملها. يظهر الجزء الداخلي طريقة عرض xy للمستوى z السفلي الذي يحتوي على SCs. يظهر توطين هذه الطائرة في مناظر متعامدة لقسم الأنسجة المشار إليه بواسطة مستطيل في صورة MIP للغدد التناسلية (خطوط صفراء). قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: MIP = أقصى إسقاط للكثافة ؛ SCs = مجمعات متشابكة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> الشكل 4: مجهر توطين جزيء واحد ل HTP-3 و C-termini ل SYP-5. (أ ، ب) إلى اليسار: صور SMLM تظهر نوى باكيتين ملطخة ب HTP-3 (أحمر) والمحطة C ل SYP-5 (SYP-5::HA، سماوي) (شريط المقياس = 1 ميكرومتر). مركز: صور مكبرة للمناطق ذات الأهمية المشار إليها في A و B مع طرق عرض مقطعية مقابلة معروضة أسفل كل صورة (i ، ii ؛ شريط المقياس = 100 نانومتر). يتم تدوير امتدادات SC داخل الصور المكبرة لتوجيه محاور الكروموسوم الموازية للمحور y. يمين: تمثيل رسومي لتوطين البروتينات ذات الأهمية داخل SC يصور اتجاه SC في المناطق المكبرة المعروضة في وسط الشكل. الاختصارات: SMLM = مجهر توطين جزيء واحد ؛ SC = مجمع متشابك. تتوفر البيانات الأولية لإعادة بناء صور SMLM من خلال قاعدة بيانات BioStudies60 (معرف الانضمام: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> الشكل 5: تعتمد دقة ارتباط حلقة فورييه لصور الفحص المجهري لتوطين الجزيء الواحد على مسافة المستوى z المصور من مستوى قسيمة الغطاء. تظهر الخطوط الملونة منحنيات FRC للصور التي تم الحصول عليها على مسافات مختلفة (كما هو موضح بواسطة شريط الألوان) من قسيمة الغلاف. يشار إلى عتبة 1/7 المستخدمة لتحديد دقة FRC بخط أفقي أسود. تظهر الأجزاء الداخلية اعتماد دقة FRC على مسافة بيزو من غطاء الغطاء. تم تنفيذ التخطيط بواسطة برنامج نصي R مكتوب خصيصا (الإصدار 4.1.2 ، الملف التكميلي 1) حيث تم تنعيم المنحنيات الأصلية بوظائف من حزمة "ggplot2". الاختصارات: FRC = ارتباط حلقة فورييه ؛ SMLM = مجهر توطين جزيء واحد ؛ SC = مجمع متشابك. تتوفر بيانات منحنيات FRC وبيانات SMLM من خلال قاعدة بيانات BioStudies60 (معرف الانضمام: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> الشكل 6: يعمل الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفز المعزز بالمعلومات القائمة على العمر الفلوري (TauSTED) على حل نطاقي توطين لكل من HTP-3 والنهاية C ل SYP-5. (أ) تظهر صورتان تمثيليتان TauSTED نوى باكيتين ملطخة ب HTP-3 (أحمر) والنهاية C ل SYP-5 (SYP-5::HA ، سماوي) مع تعريف هيكلي أعلى (أعلى) وأقل (أسفل) (شريط مقياس = 1 ميكرومتر). تحدد المستطيلات المناطق باستخدام C-termini الذي تم حله ل SYP-5 في الأمام (الأبيض) ومنظر مائل قليلا (أصفر) ل SC. (B ، C) توزيع HTP-3 (أحمر) والنهاية C لإشارة SYP-5 (سماوي) تم حلها بواسطة TauSTED. يتم عرض ملفات تعريف الخطوط للمناطق ذات الأهمية التي تحتوي على SC في طرق العرض الأمامية (B) أو المائلة قليلا (C) كخطوط كاملة مع تسوية الكثافة إلى الحد الأقصى للقيمة. تم إنشاء ملفات تعريف الخطوط باستخدام Fiji ImageJ. توضح الخطوط المتقطعة في B متوسط البيانات لكل بروتين. يتوافق الخط السماوي السميك في C مع ملف تعريف الخط مع أقصر مسافة تم حلها بين C-termini ل SYP-5. لتحديد المسافات بين الأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات معينة ، تم تزويد ملفات تعريف الخط (n = 9 (B) ، n = 7 (C)) بغاوسيان مزدوج باستخدام برنامج نصي R مكتوب خصيصا (الإصدار 4.1.2 ، الملف التكميلي 1). يشار إلى متوسط المسافة ± الانحراف المعياري (B) والنطاق مع الحد الأدنى للقيمة المظللة بالخط العريض (C) أعلى كل رسم بياني ، على التوالي. الاختصارات: STED = الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة ؛ SC = مجمع متشابك. تتوفر الصور ونقاط البيانات المعروضة لملفات تعريف الخطوط المرسومة من خلال قاعدة بيانات BioStudies60 (معرف الانضمام: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الجدول 1: تكوين المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الفيديو التكميلي 1: اكتساب المجهر لتوطين جزيء واحد. فيديو يظهر وميض الفلوروفورات بمعدل مناسب (يتم عرض 50 إطارا ، شريط المقياس = 5 ميكرومتر ، 20 مللي ثانية / إطار). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
الملف التكميلي 1: البرنامج النصي لتحليل البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

يمكن أن يوفر الفحص المجهري فائق الدقة نظرة تفصيلية على تنظيم المكونات داخل مجمع المشابك في الانقسام الاختزالي. هنا ، نوضح بروتوكولا لحل البروتينات الفردية لمجمع Caenorhabditis elegans synaptonemal.

الفحص المجهري فائق الدقة للمجمع المشبكي داخل الخط الجرثومي Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

مجمع المشبك هو عنصر رئيسي للانقسام الاختزالي. لدراسة وظيفتها ، يجب أن نفهم أيضا هيكلها الذي تبين أن الفحص المجهري فائق الدقة مفيد بشكل لا يصدق. لقد قمنا بتحسين بروتوكولنا لربط الغدد التناسلية C.elegans الملطخة بالمناعة بثبات بغطاء مما يساعد على تحسين الدقة حتى 30 نانومتر في الأنسجة السليمة.يمكن أن يكون تصميم تجارب الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ، والتحليل اللاحق ، وكذلك تفسير البيانات أمرا صعبا للغاية ويجب إعداده بشكل أفضل مع خبير. ستوضح الإجراء إيفانا كافكا ، زميلة ما قبل الدكتوراه في المختبر. كما سيتم عرض الحصول على صور مجهرية توطين جزيء واحد من قبل روري باور ، مهندس بصري في مركز التصوير MBL.ابدأ بقطف ديدان Caenorhabditis elegans المطابقة للعمر من ألواح أجار NGM. انقل الديدان إلى قطرة 30 ميكرولتر من EBTT على غطاء غطاء. اغسل الديدان ب 30 ميكرولتر إضافية من EBTT.قم بإزالة 30 ميكرولتر من المحلول تاركا قطرة 30 ميكرولتر مع الديدان على غطاء الغطاء. استخدم شفرة مشرط لقطع رؤوس الديدان و / أو ذيولها لبثق الغدد التناسلية. في تشريح ناجح ، سيتم بثق أنسجة الغدد التناسلية بالكامل خارج جسم الدودة.ماصة 30 ميكرولتر من محلول التثبيت في قطرة الديدان تشريح. تخلط عن طريق ماصة واترك العينات لإصلاح لمدة دقيقة واحدة. أوقف التثبيت بعد دقيقة واحدة بالضبط عن طريق نقل الديدان باستخدام ماصة 20 ميكرولتر على أنبوب PCR مملوء ب TBST.ثم قم بإجراء غسل عن طريق تدوير العينات المشرحة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. بمجرد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الديدان في 200 ميكرولتر من TBST الطازج. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الديدان في 200 ميكرولتر من PBST وضع أنبوب PCR على الجليد.قم بتدوير العينات المشرحة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة وإزالة المادة الطافية. أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الميثانول البارد ، واخلطه عن طريق السحب ، واترك العينات في الميثانول لمدة 30 إلى 60 ثانية على الثلج. اغسل العينات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBST.بعد تدوير العينات وإزالة المادة الطافية ، أضف محلول الحجب إلى العينات واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة. تمييع الأجسام المضادة الأولية لحلول العمل في المخزن المؤقت للحظر. قم بتدوير العينات على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، وإزالة محلول الحجب ، وإضافة 30 إلى 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي.احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل العينات ثلاث مرات في PBST. قم بتخفيف جزأين Fab Prime المسمى إلى حلول العمل في المخزن المؤقت للحظر.بعد الغسيل الثالث ، قم بتدوير العينات لأسفل ، وإزالة المادة الطافية ، وإضافة 30 إلى 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي. ضع العينة في غرفة مظلمة واحتضنها لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة خمس إلى 15 دقيقة.قم بتدوير العينات الملطخة وإزالة المادة الطافية. أضف 50 ميكرولترا من PBST وانقل الديدان الملطخة إلى غطاء غطاء. ماصة 5.7 إلى 6.3 ميكرولتر من محلول ما بعد التثبيت على غطاء بولي ل لايسين.ماصة قبالة الديدان تشريح في نفس الحجم ونقلها إلى قطرة من المثبت على غطاء بولي ل ليسين. قم بتغطية العينة بغطاء صغير. قم بإزالة السائل الزائد باستخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح وثبت العينة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في غرفة مظلمة.قم بتجميد العينات عن طريق وضعها على كتلة من الألومنيوم في الثلج الجاف. بعد 20 دقيقة على الأقل ، قم بإزالة الغطاء الأصغر باستخدام ماكينة حلاقة. اغمس الغطاء في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على PBS بارد أو ميثانول مبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 ثوان تقريبا.ضع الغطاء في بئر من لوحة من ستة آبار مملوءة بمخزن مؤقت PBST. أخرج PBST من البئر ، وأضف PBST طازجا واترك العينة لمدة خمس دقائق. بعد الغسيل باستخدام PBST مرة أخرى ، اترك العينات عند أربع درجات مئوية حتى التصوير.قبل التصوير ، قم بتقييم جودة تركيب العينة تحت مجهر ستيريو. في حالة استخدام حامل العينة المصنوع خصيصا الموضح هنا ، لف الحلقة المغناطيسية بالبارافيلم ، ثم قم بإعداد ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتصوير. خذ غطاء من لوحة الآبار الستة.ضعه في الحامل المصنوع خصيصا وقم بتثبيت غطاء الغطاء في الحامل بحلقة مغناطيسية ملفوفة بالبارافيلم. ماصة برفق مخزن التصوير المؤقت في الحجرة التي أنشأتها الحلقة المغناطيسية أعلى العينة وأغلق الحجرة باستخدام البارافيلم. لتركيب العينة ، أضف قطرة واحدة من زيت الغمر إلى هدف الزيت النظيف.دون إدخال أي هواء في زيت الغمر ، ضع حامل العينة برفق مع العينة المركبة على مرحلة المجهر. باستخدام نافذة المكون الإضافي EMU داخل MicroManager 2 ، حرك مرحلة بيزو حتى يتم اكتشاف الإشارة من ليزر قفل التركيز عند الصمام الثنائي الضوئي الربعي. احصل على صورة المستوى البؤري الخلفي عند طاقة أقل باستخدام ليزر عند إثارة 640 نانومتر لتأكيد عدم وجود فقاعات هواء في زيت الغمر.توطين أنسجة الغدد التناسلية باستخدام إضاءة برايتفيلد. باستخدام إضاءة منخفضة الكثافة عند 640 نانومتر ، ركز على قسم الأنسجة الذي يحتوي على العديد من مجمعات المشابك العصبية. استمر في تعريض العينة عند إشعاع عال مع إضاءة عند 640 نانومتر لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتم تحقيق معدل وميض مناسب.احصل على 200،000 إطار مع وقت تعريض يبلغ 20 مللي ثانية باستخدام أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد في MicroManager 2. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية باستخدام خيار التنشيط الخاص بالمكون الإضافي EMU للحفاظ على معدل الوميض المطلوب. تم تصور المستوى السفلي للنوى الاختزالية التي تحتوي على معقدات متشابكة داخل الغدد التناسلية Caenorhabditis elegans باستخدام تلطيخ HTP-3 و SYP-5.تم حل محاور الكروموسوم في النهاية C ل SYP-5 HA بشكل جيد في جميع الأبعاد الثلاثة في مجمعات synaptonemal الموجودة بالقرب من غطاء الغطاء. ومع ذلك ، فإن الدقة تتدهور في مجمعات synaptonemal تقع على مسافة خمسة ميكرومتر من الغطاء بسبب تشتت الضوء والانحرافات الكروية. كشفت الصور التي تم الحصول عليها على مسافات بيزو مختلفة من غطاء الغطاء أن الأنسجة المصورة يجب ألا تزيد عن ميكرومترين من الغطاء.يمكن أيضا استخدام بروتوكول تحضير العينة مع الفحص المجهري TauSTED. مع إعداد العينة الأمثل ، تم حل HTP-3 في محاور الكروموسوم و C-termini من SYP-5 في المنطقة الوسطى في الرؤية الأمامية والرؤية المائلة قليلا. للحصول على أفضل دقة ، يجب ربط الغدد التناسلية بإحكام بغطاء الغطاء للتأكد من أن مجمعات المشابك لا تبعد أكثر من ميكرومتر عن غطاء الغطاء.نحن نستخدم هذا البروتوكول ليس فقط للفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ، ولكن أيضا لفحص مجهر استنفاد الانبعاثات المحفز. قد يكون مفيدا أيضا لتقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة الأخرى.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...