Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Nous tenons à remercier Jonas Ries et le laboratoire Ries d’avoir partagé des tampons d’imagerie pour l’imagerie SMLM. Nous remercions également Yumi Kim pour la souche C. elegans utilisée dans ce protocole et Abby F. Dernburg pour l’anticorps poulet-anti-HTP-3. Nous remercions Marko Lampe et Stefan Terjung de l’Advanced Light Microscopy Facility de l’EMBL Heidelberg pour leur soutien dans l’utilisation du microscope confocal Olympus iXplore SPIN SR. Ce travail a été soutenu par le Laboratoire européen de biologie moléculaire et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche - 452616889, SK). Nous reconnaissons l’accès et les services fournis par le Centre d’imagerie du Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL IC), généreusement soutenu par la Fondation Boehringer Ingelheim.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’organisation en échelle du SC, essentielle à la recombinaison et à la ségrégation correctes des chromosomes homologues, a été observée pour la première fois il y a près de 70 ans en microscopie électronique 3,4. Alors que l’organisation globale du SC est facilement résolue en microscopie électronique, la localisation des composants individuels au sein de ce complexe nécessite une approche plus ciblée. Avec sa largeur de seulement ~100 nm, la sous-structure du SC ne peut pas être résolue par la microscopie à fluorescence conventionnelle. Cependant, la microscopie à super-résolution est devenue un moteur majeur de nouvelles découvertes sur la structure et la fonction du complexe synaptonémique 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Pour faciliter cette recherche, nous avons démontré une procédure de montage qui permet d’étudier l’architecture du SC dans le tissu gonade de C. elegans avec SMLM et microscopie STED.
Une étape critique pour optimiser la résolution dans l’imagerie SMLM consiste à réticuler directement le tissu germinal à une lame de couverture recouverte de poly-L-lysine (étape 4). La fixation covalente du tissu à la lamelle de couverture est essentielle pour réduire les mouvements à l’intérieur de l’échantillon qui entraîneraient de grandes dérives et rendraient impossible l’imagerie sur de longues périodes pour SMLM. De plus, même une fixation sous-optimale qui laisse les noyaux contenant des SC à distance de la lamelle de couverture entraîne une baisse significative de la résolution réalisable résultant d’aberrations sphériques (Figure 4). Alternativement à l’accessoire covalent utilisé ici, le tissu germinal coloré peut également être immobilisé entre deux lamelles de couverture scellées dans une petite goutte de tampon d’imagerie19,30. Cependant, cette méthode d’immobilisation réduit considérablement le volume de tampon d’imagerie dans l’échantillon de 1 mL utilisé dans le protocole optimisé ici à seulement quelques μL, ce qui entraînera une acidification du tampon d’imagerie et réduira considérablement le temps pendant lequel l’échantillon peut être imagé 38,53,54.
Les longs temps d’acquisition pour la microscopie SMLM et STED limitent l’utilisation de ces méthodes à l’imagerie d’échantillons fixés chimiquement. Ici, la fixation du paraformaldéhyde garantit que la structure du SC est préservée pendant la préparation et l’imagerie des échantillons. Cependant, malgré les précautions prises ici pour imager le SC dans un tissu intact, la structure résultante du SC après fixation n’est pas nécessairement identique à la structure à l’état natif dans un organisme vivant. De plus, puisqu’une seule image du SC fixe représente un seul « instantané » de la structure biologique, cette approche reste aveugle à la dynamique de la structure native in vivo.
Cependant, des informations sur la dynamique et la variabilité des structures macromoléculaires peuvent également être obtenues en acquérant non pas un seul, mais de nombreux « instantanés ». Bien que cette approche puisse résoudre les changements dans la structure du SC au cours du pachytène19, plusieurs facteurs limitent le nombre d’images pouvant être acquises à partir d’un seul échantillon préparé à l’aide de ce protocole. Premièrement, les puissances laser élevées utilisées lors de l’acquisition d’images entraînent un blanchiment permanent des fluorophores et empêchent l’imagerie de régions d’intérêt adjacentes ou de plusieurs plans Z, réduisant ainsi considérablement le nombre d’images pouvant être acquises à partir d’un seul échantillon. Deuxièmement, la densité de l’échantillon ou du tissu sur la lamelle de couverture préparée par cette méthode est faible, ce qui limite considérablement le nombre d’images pouvant être acquises à partir d’une seule lamelle de couverture. La faible densité d’échantillons interdit également l’utilisation de pipelines automatisés d’acquisition d’images qui ont permis de faire la lumière sur d’autres questions biologiques 34,55,56,57,58,59. Cependant, la densité de l’échantillon peut être légèrement augmentée par un utilisateur expérimenté.
Le protocole présenté ici est optimisé pour obtenir une densité d’étiquetage élevée nécessaire pour obtenir une résolution optimale dans SMLM35. Alors que les protocoles précédents fixaient de manière covalente le tissu à la lamelle de couverture avant l’immunomarquage16, ce nouveau protocole ne relie le tissu au couvercle qu’après que les échantillons aient été colorés en solution. Cette modification permet aux anticorps utilisés pour l’immunomarquage d’accéder librement au tissu de tous les côtés, tandis que la fixation covalente du tissu à la lamelle de couverture peut empêcher les anticorps d’atteindre les noyaux les plus proches de la lame, réduisant ainsi le degré de marquage. Ensemble, les modifications décrites ici améliorent la résolution de 40-50 nm (résolution FRC)16 à 30-40 nm (ce protocole).
Il est important de noter que, bien qu’une densité de marquage élevée et une concentration élevée d’anticorps soient essentielles pour SMLM, nous avons constaté que de meilleures images de microscopie STED sont obtenues en utilisant des concentrations d’anticorps plus faibles (étape 3). À une résolution de plusieurs dizaines de nanomètres, la taille des molécules utilisées pour marquer la protéine d’intérêt devient de plus en plus importante. Nous avons donc utilisé des fragments F(ab')2 qui font la moitié de la taille des anticorps pleine longueur. L’amélioration du contraste local due à une source de signal plus petite, et donc à la résolution obtenue par cette modification par rapport à l’utilisation d’anticorps secondaires pleine longueur, a permis la résolution des deux terminus C de SYP-5 dans la région centrale par TauSTED, qui ne sont pas résolus par STED conventionnel utilisant des anticorps pleine longueur (16 et données non présentées). Nous prévoyons que ce protocole optimisé pour l’imagerie des SC dans les lignées germinales intactes de C. eleganfacilitera l’étude de la relation structure-fonction du SC pendant la méiose.

Réduire de moitié le nombre de chromosomes pendant la méiose est essentiel pour générer une progéniture saine chez les organismes à reproduction sexuée. Pour obtenir cette réduction du nombre de chromosomes, les chromosomes homologues doivent apparier et se séparer pendant la méiose I. Pour assurer la ségrégation précise des chromosomes homologues, les cellules germinales subissent une prophase I étendue, au cours de laquelle les chromosomes homologues s’apparient, se synapsent et se recombinent pour générer des liens physiques entre les homologues1. Le SC est devenu la structure centrale clé pour réguler la progression correcte à travers la prophaseméiotique 2.
Le SC est un complexe dont la structure générale est conservée au cours de l’évolution, même s’il y a peu d’homologie entre ses composants protéiques. Le SC a d’abord été identifié en micrographie électronique comme une structure tripartite, semblable à une échelle, composée de deux éléments latéraux ou axes, d’une région centrale formée de filaments transversaux et d’un élément central 3,4. La détermination de l’organisation des composants individuels au sein du complexe est essentielle pour faire progresser notre compréhension du rôle du CS pendant la prophase méiotique.
L’organisme modèle C. elegans est idéal pour étudier la structure et la fonction du SC puisque ses lignées germinales contiennent un grand nombre de noyaux méiotiques avec des SC5 entièrement assemblés. Des études génétiques et biochimiques ont révélé que les axes chromosomiques sont formés par trois complexes de cohésinedistincts 6,7 et quatre protéines du domaine HORMA appelées HTP-1/2/3 et HIM-3 7,8,9,10,11 chez C. elegans. Dans la région centrale du SC, six protéines contenant des domaines enroulés ont été identifiées à ce jour 12,13,14,15,16,17. Pour combler la distance entre les deux axes, SYP-1, -5 et -6 se dimérisent de manière directe (Figure 1), tandis que trois protéines supplémentaires stabilisent leur interaction dans l’élément central16,17,18,19.
L’obtention d’un aperçu détaillé de l’organisation de ces protéines est essentielle pour comprendre les nombreuses fonctions du SC pendant la méiose. Comme la largeur de la région centrale du SC n’est que de ~100 nm, sa sous-structure ne peut pas être résolue par la microscopie à fluorescence limitée par diffraction. Cependant, la visualisation des composants dans une structure de cette taille est facilement réalisable par microscopie à super-résolution. En effet, la microscopie à illumination structurée (SIM), la microscopieà expansion 20, la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) 21 et la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM)22,23 sont apparues comme des outils essentiels pour étudier l’architecture moléculaire du SC chez les espèces 16,24,25,26,27,28,29, 30.
Pour surmonter la limite de résolution, la microscopie STED repose sur la superposition du point limité par diffraction de la lumière d’émission avec un faisceau en forme de beignet du laser STED, ce qui restreint théoriquement la fonction d’étalement du point jusqu’aux dimensions moléculaires31,32. Cependant, la résolution pratiquement réalisable par STED dans les échantillons biologiques reste de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres en xy33.
Une résolution encore plus élevée dans les échantillons biologiques peut être obtenue avec les techniques SMLM. SMLM exploite les propriétés de clignotement de fluorophores spécifiques pour résoudre des objets au niveau de sous-diffraction en séparant les fluorophores qui se chevauchent spatialement dans le temps. L’échantillon est ensuite imagé à plusieurs reprises pour capturer différents sous-ensembles de fluorophores. La position des fluorophores dans l’échantillon est ensuite déterminée en ajustant la fonction d’étalement ponctuel (PSF) aux signaux obtenus sur toutes les images, ce qui peut résoudre des structures jusqu’à 15 nm23,34.
Prises ensemble, les images localisées codent les positions de tous les fluorophores. La résolution du SMLM est déterminée par la densité de marquage et les caractéristiques de clignotement du fluorophore. Selon le critère de Nyquist-Shannon, il est impossible de résoudre de manière fiable des objets dont la distance moyenne est inférieure à deux fois la distance moyenne d’étiquette à étiquette. Ainsi, une densité d’étiquetage élevée est nécessaire pour l’imagerie haute résolution. Pour le SC chez C. elegans, une densité de marquage élevée peut être obtenue en utilisant des marqueurs épitopiques attachés à des sites spécifiques de protéines endogènes en utilisant l’édition du génome. Les marqueurs d’épitopes peuvent ensuite être colorés à haute densité à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques à forte affinité19,30. Dans le même temps, le cycle en cours des fluorophores individuels doit être suffisamment court pour garantir que les fluorophores qui se chevauchent dans l’espace ne sont pas capturés en même temps35.
En raison de ces deux exigences, la résolution de la structure de grands complexes macromoléculaires tels que le SC nécessite l’imagerie d’un nombre suffisamment important d’images, et peut donc prendre plusieurs heures. Le piège des longs temps d’imagerie est que les échantillons ont tendance à dériver en raison du mouvement de l’étage ou de petits courants dans le tampon de l’échantillon; Même de petits mouvements de l’ordre de 10 nm sont préjudiciables à la résolution nm et doivent être corrigés. Cependant, les méthodes de correction de la dérive couramment utilisées ne sont pas assez robustes pour superposer avec précision les images de deux canaux imagées séquentiellement36. Ceci est problématique car les questions biologiques demandent souvent une détection et une localisation précises de plusieurs cibles au sein d’un même échantillon. Pour contourner ces problèmes, des méthodes telles que l’imagerie ratiométrique ont été développées. L’imagerie ratiométrique permet l’imagerie simultanée de plusieurs fluorophores avec des spectres d’excitation et d’émission qui se chevauchent, avec une assignation ultérieure de chaque signal détecté à son fluorophore respectif en fonction du rapport des intensités dans des canaux spectralement distincts37,38.
De plus, l’étude de l’organisation de complexes macromoléculaires tels que le SC nécessite des informations tridimensionnelles (3D). Pour obtenir une super-résolution en trois dimensions (3D-SMLM), une lentille cylindrique est incorporée dans le trajet optique de la lumière émise qui déforme la forme du PSF d’un fluorophore en fonction de sa distance au plan focal. Par conséquent, la position précise d’un fluorophore dans le plan z peut être extrapolée en analysant la forme de son signal d’émission35,39. La combinaison de ces avancées en SMLM permet d’imager l’organisation 3D des complexes macromoléculaires, y compris le SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Pendant la méiose, les chromosomes homologues doivent se reconnaître et adhérer les uns aux autres pour permettre leur ségrégation correcte. L’un des événements clés qui sécurise l’interaction des chromosomes homologues est l’assemblage du complexe synaptonémique (SC) dans la prophase méiotique I. Même s’il y a peu d’homologie de séquence entre les composants protéiques au sein du SC entre les différentes espèces, la structure générale du SC a été hautement conservée au cours de l’évolution. En micrographie électronique, le SC apparaît comme une structure tripartite, semblable à une échelle, composée d’éléments latéraux ou d’axes, de filaments transversaux et d’un élément central. 
Cependant, l’identification précise de la localisation des composants individuels dans le complexe par microscopie électronique pour déterminer la structure moléculaire du SC reste difficile. En revanche, la microscopie à fluorescence permet d’identifier les composants protéiques individuels du complexe. Cependant, comme le SC n’a qu’une largeur de ~100 nm, sa sous-structure ne peut pas être résolue par la microscopie à fluorescence conventionnelle limitée par diffraction. Ainsi, la détermination de l’architecture moléculaire du SC nécessite des techniques de microscopie optique à super-résolution telles que la microscopie à illumination structurée (SIM), la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) ou la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM). 
Pour maintenir la structure et les interactions des composants individuels au sein du SC, il est important d’observer le complexe dans un environnement proche de son environnement natif dans les cellules germinales. Par conséquent, nous démontrons un protocole d’immunohistochimie et d’imagerie qui permet l’étude de la sous-structure du SC dans le tissu germinale intact et extrudé de Caenorhabditis elegans avec SMLM et microscopie STED. La fixation directe du tissu sur la lamelle de couverture réduit le mouvement des échantillons pendant l’imagerie et minimise les aberrations dans l’échantillon pour atteindre la haute résolution nécessaire pour visualiser la sous-structure du SC dans son contexte biologique.

Pour imager le SC dans le tissu germinal de C. elegans par SMLM, nous avons utilisé le ratio 3D-SMLM à 2 couleurs pour localiser HTP-3, un composant des axes chromosomiques, et l’extrémité C du filament transversal SYP-5 marqué de manière endogène avec une étiquette d’hémagglutinine (HA). L’emplacement des deux protéines dans le SC de C. elegans a déjà été déterminé par d’autres études16,30.
Pour minimiser la diffusion de la lumière et les aberrations optiques inhérentes aux échantillons biologiques épais, nous avons imagé la section z la plus basse des noyaux méiotiques qui contiennent les SC (Figure 3, lignes jaunes). Pour chaque image acquise, la position de l’étage piézoélectrique du plan d’imagerie a été marquée par rapport à la position de l’étage piézoélectrique lorsque l’objectif était focalisé sur la lamelle de couverture. Cela a permis de calculer la distance piézoélectrique par rapport à la lamelle de couverture. Les échantillons montés avec succès sont fixés de manière stable près de la lamelle de couverture et conservent la forme de la gonade (c.-à-d. que le tissu n’est pas écrasé entre les deux lamelles de couverture pendant l’étape de postfixation). La qualité du montage de l’échantillon peut facilement être évaluée au stéréomicroscope puisque les gonades bien attachées ne montrent aucun mouvement en solution (étape 4.2.6). Néanmoins, en raison de la stochasticité du processus de montage, le tissu gonade ne sera pas nécessairement disposé complètement à plat sur la lamelle de couverture. Par conséquent, le plan inférieur des noyaux contenant des SC peut être trouvé à des distances variables par rapport à la lamelle de couverture dans la même gonade.
Pour illustrer comment la résolution change en fonction de la fixation du tissu au couvercle, nous avons acquis des images à différentes distances piézoélectriques par rapport au couvercle. Pour évaluer la qualité d’une image individuelle, les courbes de corrélation en anneaux de Fourier (FRC)50,51 ont été calculées et la résolution a été déterminée à l’aide du plugin FRCResolution dans le logiciel SMAP48. Deux noyaux représentatifs extraits de deux images 3D-SMLM distinctes prises à différentes distances de la lamelle de couverture sont représentés à la figure 4. Dans les SC situés près de la lamelle de couverture, les axes chromosomiques et l’extrémité C de SYP-5::HA sont bien résolus dans les trois dimensions (Figure 4A, 0,8 μm de la lamelle de couverture). Pour résoudre deux structures séparées par une distance donnée, la résolution FRC obtenue doit généralement être inférieure à la moitié de cette distance dans la résolution axiale.
Pour séparer latéralement les mêmes structures, des valeurs de résolution FRC encore plus petites doivent être atteintes. En effet, dans les échantillons situés à proximité immédiate de la lamelle de couverture, la résolution FRC est de 38 nm pour le canal AlexaFluor 647 et de 34 nm pour le canal CF680, et donc bien en dessous de la distance attendue de 84 nm entre les terminus C de SYP-516. Cette résolution résout donc facilement l’organisation du CS non seulement en vue frontale mais aussi en vue latérale (Figure 4B i,ii). En revanche, la résolution se détériore dans les SC situés à une distance de 5 μm de la lamelle de couverture en raison de la diffusion de la lumière et des aberrations sphériques (Figure 4B). Les résolutions FRC à cette distance tombent à 47 nm (AlexaFluor 647) et 41 nm (CF680), ce qui ne peut pas résoudre complètement les terminus C de SYP-5. Étant donné que les aberrations optiques altèrent la résolution latérale plus sévèrement que la résolution axiale, les bandes HTP-3 et SYP-5 ne sont plus clairement résolues dans la section transversale de la vue latérale dans les échantillons situés à une distance de 5 μm de la lamelle de couverture (figure 4B ii). La comparaison de la résolution FRC des images acquises à différentes distances piézoélectriques du bordereau de couverture a révélé que le tissu imagé ne devrait pas se trouver à plus de 2 μm du glissement de couverture (Figure 5). Ce résultat souligne l’importance d’une exécution correcte de l’étape postfixation, au cours de laquelle le tissu doit être réticulé avec succès au revêtement poly-L-lysine de la lamelle de couverture.
Pour démontrer la résolution réalisable avec une autre technique de super-résolution, nous avons également imagé des SC dans un tissu germinal intact fixe avec la microscopie TauSTED. La figure 6A montre les images TauSTED avec la résolution la plus élevée et la plus faible obtenue dans cette étude, estimées à partir des profils linéaires du SC en vue frontale (figure 6B). Dans les deux noyaux, nous avons pu résoudre les deux bandes de localisation de HTP-3 dans les axes chromosomiques et les terminus C de SYP-5 dans la région centrale, démontrant que la résolution réalisable dans TauSTED en utilisant ce protocole optimisé est inférieure à 84 nm. Dans des conditions optimales (Figure 6A, en haut), nous avons pu résoudre les C-termini dans des vues légèrement inclinées du SC qui n’étaient séparées que par 50 nm (Figure 6A, rectangle jaune et 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de l’organisation du complexe synaptonémique chez Caenorhabditis elegans. La caricature montre une structure simplifiée du SC chez C. elegans reliant deux chromosomes homologues (gris). La structure est représentée en vue frontale, latérale et en coupe transversale. Les axes chromosomiques sont affichés sous forme de barres rouges tandis que les filaments transversaux sont représentés en cyan. Les protéines de filament transversal (SYP-1, 5, 6 chez C. elegans) sont orientées de manière directe (graphiques cyan ball-stick) dans la région centrale pour combler la distance entre les deux axes. Les distances attendues entre les axes et les terminus C des filaments transversaux sont indiquées. Abréviation : SC = complexe synaptonémique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration de la préparation de l’échantillon utilisée dans l’étude. (A) Les jeunes adultes de C. elegans sont disséqués à la tête ou à la queue (verts, lignes pointillées) et traités comme décrit dans le protocole. (B) Les étapes individuelles de la méthode sont indiquées par des graphiques reliés par des flèches grises. Abréviations : STED = appauvrissement des émissions stimulées; SMLM = microscopie de localisation à molécule unique; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> Figure 3 : Localisation de la coupe tissulaire qui peut être observée par microscopie de localisation d’une seule molécule. MIP d’une image confocale à disque rotatif d’une gonade entière du mont C. elegans. Le tissu a été coloré pour HTP-3 et l’extrémité C de SYP-5 (SYP-5::HA), et le signal combiné est indiqué en gris. Des images confocales individuelles ont été assemblées à l’aide du plugin Fiji52 de Grid/Collection Stitching pour créer une image de la gonade entière. L’encart montre une vue xy du plan z le plus bas contenant les SC. La localisation de ce plan est montrée dans les vues orthogonales de la section tissulaire indiquée par un rectangle dans l’image MIP de la gonade (lignes jaunes). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : PIM = projection de l’intensité maximale; SC = complexes synaptonémiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> Figure 4 : Microscopie de localisation d’une seule molécule de HTP-3 et des terminus C du SYP-5. (A,B) À gauche : images SMLM montrant des noyaux de pachytène colorés pour HTP-3 (rouge) et l’extrémité C de SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) (barre d’échelle = 1 μm). Centre: Images agrandies des régions d’intérêt indiquées dans A et B avec les vues en coupe correspondante affichées sous chaque image (i, ii; barre d’échelle = 100 nm). Les tronçons du SC dans les images zoomées sont tournés pour orienter les axes chromosomiques parallèlement à l’axe y. Droite: Représentation graphique de la localisation des protéines d’intérêt dans le SC représentant l’orientation du SC dans les régions zoomées affichées au centre de la figure. Abréviations : SMLM = microscopie de localisation à molécule unique; SC = complexe synaptonémique. Les données brutes pour reconstruire les images SMLM sont disponibles dans la base de données BioStudies60 (ID d’acquisition : S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> Figure 5 : La résolution de corrélation en anneau de Fourier des images de microscopie de localisation monomoléculaire dépend de la distance entre le plan z imagé et le plan de la lame. Les lignes colorées montrent les courbes FRC des images acquises à différentes distances (comme illustré par la barre de couleur) à partir de la lame. Le seuil 1/7 utilisé pour déterminer la résolution FRC est indiqué par une ligne horizontale noire. Les encarts montrent la dépendance de la résolution FRC sur la distance piézoélectrique de la lamelle de couverture. Le traçage a été effectué par un script R personnalisé (version 4.1.2, Fichier supplémentaire 1) dans lequel les courbes originales ont été lissées avec des fonctions du paquet « ggplot2 ». Abréviations : FRC = corrélation de l’anneau de Fourier; SMLM = microscopie de localisation à molécule unique; SC = complexe synaptonémique. Les données pour les courbes FRC et les données SMLM sont disponibles dans la base de données BioStudies60 (ID d’acquisition : S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> Figure 6 : La microscopie à déplétion des émissions stimulées améliorée par les informations basées sur la durée de vie de fluorescence (TauSTED) résout deux bandes de localisation pour HTP-3 et l’extrémité C de SYP-5. (A) Deux images représentatives de TauSTED montrent des noyaux de pachytène colorés pour HTP-3 (rouge) et l’extrémité C de SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) avec une définition structurelle supérieure (en haut) et inférieure (en bas) (barre d’échelle = 1 μm). Les rectangles marquent les régions avec les terminus C résolus de SYP-5 en frontal (blanc) et une vue légèrement inclinée (jaune) du SC. (B,C) Distribution du HTP-3 (rouge) et de l’extrémité C du signal SYP-5 (cyan) résolus par TauSTED. Les profils linéaires des régions d’intérêt qui contiennent le SC en vue frontale (B) ou légèrement inclinée (C) sont représentés sous forme de lignes pleines avec une intensité normalisée à la valeur maximale. Les profils de ligne ont été générés à l’aide de Fiji ImageJ. Les lignes pointillées dans B montrent les données moyennes pour chaque protéine. La ligne cyan épaisse en C correspond au profil de ligne avec la distance résolue la plus courte entre les terminus C de SYP-5. Pour déterminer les distances entre les anticorps ciblant des protéines spécifiques, les profils de lignée (n = 9 (B), n = 7 (C)) ont été ajustés avec des gaussiens doubles à l’aide d’un script R écrit sur mesure (version 4.1.2, fichier supplémentaire 1). La distance moyenne ±écart type (B) et la plage dont la valeur minimale est indiquée en gras (C) sont indiquées en haut de chaque graphique, respectivement. Abréviations : STED = microscopie à déplétion par émission stimulée; SC = complexe synaptonémique. Les images affichées et les points de données des profils linéaires tracés sont disponibles dans la base de données BioStudies60 (ID d’acquisition : S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition des tampons et des solutions utilisés dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Vidéo supplémentaire 1 : Acquisition par microscopie à localisation d’une seule molécule. Vidéo montrant des fluorophores clignotant à une vitesse appropriée (50 images sont montrées, barre d’échelle = 5 μm, 20 ms / image). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Script d’analyse des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

La microscopie à super-résolution peut fournir un aperçu détaillé de l’organisation des composants au sein du complexe synaptonémique dans la méiose. Ici, nous démontrons un protocole pour résoudre les protéines individuelles du complexe synaptonemal Caenorhabditis elegans .

Microscopie à super-résolution du complexe synaptonémique dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Le complexe synaptonémique est un composant clé de la méiose. Pour étudier sa fonction, nous devons également comprendre sa structure pour laquelle la microscopie à super résolution s’est avérée incroyablement utile. Nous avons optimisé notre protocole pour attacher de manière stable la gonade immunocolorée de C. elegans à une lamelle de couverture, ce qui contribue à améliorer la résolution jusqu’à 30 nanomètres dans les tissus intacts.La conception d’expériences de microscopie de localisation de molécules uniques, l’analyse ultérieure ainsi que l’interprétation des données peuvent être assez difficiles et doivent être mises en place avec un expert. La démonstration de la procédure sera Ivana Cavka, boursière pré-doctorale dans le laboratoire. L’acquisition des images de microscopie de localisation de molécule unique sera également présentée par Rory Power, ingénieur optique au MBL Imaging Center.Commencez par cueillir des vers Caenorhabditis elegans appariés selon l’âge dans des plaques de gélose NGM. Transférer les vers dans une goutte de 30 microlitres d’EBTT sur une lamelle de couverture. Lavez les vers avec 30 microlitres supplémentaires d’EBTT.Retirez 30 microlitres de la solution en laissant une goutte de 30 microlitres avec les vers sur la lamelle de couverture. Utilisez une lame de scalpel pour couper la tête des vers et / ou la queue pour extruder la gonade. Lors d’une dissection réussie, le tissu gonade sera entièrement extrudé à l’extérieur du corps du ver.Pipeter 30 microlitres de la solution fixatrice dans la goutte des vers disséqués. Mélanger par pipetage et laisser les échantillons fixer pendant une minute. Arrêtez la fixation exactement après une minute en transférant les vers à l’aide d’une pipette de 20 microlitres sur un tube PCR rempli de TBST.Effectuez ensuite un lavage en faisant tourner les échantillons disséqués sur une mini centrifugeuse de paillasse. Une fois le surnageant retiré, remettez les vers en suspension dans 200 microlitres de TBST frais. Après le lavage final, remettez les vers en suspension dans 200 microlitres de PBST et placez le tube PCR sur de la glace.Faites tourner les échantillons disséqués sur une mini centrifugeuse de paillasse et retirez le surnageant. Ajouter 50 à 100 microlitres de méthanol froid, mélanger par pipetage et laisser les échantillons dans du méthanol pendant 30 à 60 secondes sur de la glace. Lavez les échantillons deux fois avec 200 microlitres de PBST.Après avoir fait tourner les échantillons et retiré le surnageant, ajoutez la solution bloquante aux échantillons et conservez-la à température ambiante pendant 45 à 60 minutes. Diluer les anticorps primaires dirigés contre les solutions de travail dans le tampon bloquant. Faites tourner les échantillons sur une mini-centrifugeuse de paillasse, en retirant la solution bloquante, et ajoutez 30 à 50 microlitres de la solution d’anticorps primaire.Incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les échantillons trois fois dans PBST. Diluez les deux fragments Fab premiers étiquetés dans les solutions de travail dans le tampon de blocage.Après le troisième lavage, faites tourner les échantillons vers le bas, retirez le surnageant et ajoutez 30 à 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire. Placez l’échantillon dans une chambre sombre et incuber pendant 30 minutes à deux heures à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec PBST pendant cinq à 15 minutes.Faites tourner les échantillons colorés et retirez le surnageant. Ajouter 50 microlitres de PBST et transférer les vers colorés sur une lamelle de couverture. Pipeter 5,7 à 6,3 microlitres de la solution post-fixatrice sur une lamelle de couverture en poly-l-lycine.Enlever à la pipette les vers disséqués dans le même volume et transférer dans la goutte de fixateur sur la lamelle de couverture de poly-l-lysine. Couvrir l’échantillon avec un petit bordereau de couverture. Retirer l’excès de liquide à l’aide d’un petit morceau de papier filtre et fixer l’échantillon pendant trois à cinq minutes dans une chambre sombre.Congeler les échantillons en les plaçant sur un bloc d’aluminium dans de la glace sèche. Après au moins 20 minutes, retirez le plus petit couvercle à l’aide d’un rasoir. Trempez la lamelle de couverture dans un tube conique de 50 millilitres contenant du PBS glacé ou du méthanol refroidi à moins 20 degrés Celsius pendant environ 10 secondes.Placez la lamelle de couverture dans un puits d’une plaque à six puits remplie de tampon PBST. Retirer le PBST du puits, ajouter du PBST frais et laisser l’échantillon pendant cinq minutes. Après avoir lavé avec PBST une fois de plus, laissez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.Avant l’imagerie, évaluez la qualité du montage de l’échantillon au stéréomicroscope. Si vous utilisez le porte-échantillon sur mesure illustré ici, enveloppez l’anneau magnétique avec un parafilm, puis préparez un millilitre de tampon d’imagerie. Prenez un bordereau de couverture de la plaque à six puits.Placez-le dans le support sur mesure et fixez le couvercle dans le support avec l’anneau magnétique enveloppé de parafilm. Pipeter doucement le tampon d’imagerie dans la chambre créée par l’anneau magnétique sur le dessus de l’échantillon et sceller la chambre à l’aide d’un parafilm. Pour monter l’échantillon, ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif d’huile propre.Sans introduire d’air dans l’huile d’immersion, placez délicatement le porte-échantillon avec l’échantillon monté sur la platine du microscope. À l’aide de la fenêtre du plug-in EMU dans MicroManager 2, déplacez l’étage piézoélectrique jusqu’à ce que le signal du laser de verrouillage de mise au point soit détecté au niveau de la photodiode quadrant. Acquérir une image du plan focal arrière à faible puissance avec un laser à excitation de 640 nanomètres pour confirmer l’absence de bulles d’air dans l’huile d’immersion.Localisez le tissu gonade à l’aide de l’éclairage en fond clair. En utilisant un éclairage de faible intensité à 640 nanomètres, concentrez-vous sur la section tissulaire contenant de nombreux complexes synaptonémiques. Procéder à l’exposition de l’échantillon à un éclairement énergétique élevé avec un éclairage à 640 nanomètres pendant environ 30 secondes jusqu’à ce qu’une vitesse de clignotement appropriée soit atteinte.Acquérir 200 000 images avec un temps d’exposition de 20 millisecondes à l’aide de l’outil d’acquisition multidimensionnelle de MicroManager 2. Pendant ce temps, configurez l’activation UV à l’aide de l’option d’activation du plugin EMU pour maintenir le taux de clignotement souhaité. Le plan le plus bas des noyaux méiotiques contenant des complexes synaptonémiques a été visualisé dans une gonade de Caenorhabditis elegans en utilisant une coloration HTP-3 et SYP-5.Les axes chromosomiques de l’extrémité C de SYP-5 HA ont été bien résolus dans les trois dimensions dans des complexes synaptonémiques situés près de la lamelle de couverture. Cependant, la résolution se détériore dans les complexes synaptonémiques situés à une distance de cinq micromètres de la lamelle de couverture en raison de la diffusion de la lumière et des aberrations sphériques. Les images acquises à différentes distances piézoélectriques du bordereau de couverture ont révélé que le tissu imagé ne devait pas être à plus de deux micromètres du lameau de couverture.Le protocole de préparation des échantillons peut également être utilisé avec la microscopie TauSTED. Avec la préparation optimisée de l’échantillon, HTP-3 dans les axes chromosomiques et les C-termini de SYP-5 dans la région centrale ont été résolus en vue frontale et en vue légèrement inclinée. Pour obtenir la meilleure résolution, les gonades doivent être étroitement réticulées à la lamelle de couverture pour s’assurer que les complexes synaptonémiques ne sont pas à plus de deux micromètres de la lamelle de couverture.Nous utilisons ce protocole non seulement pour la microscopie de localisation d’une seule molécule, mais aussi pour la microscopie à déplétion d’émission stimulée. Il peut également être utile pour d’autres techniques de microscopie à super résolution.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

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Recherche

Biologie

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