Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Wir danken Jonas Ries und dem Ries-Labor für die Bereitstellung von Bildpuffern für die SMLM-Bildgebung. Wir danken auch Yumi Kim für den in diesem Protokoll verwendeten C. elegans-Stamm und Abby F. Dernburg für den Hühner-Anti-HTP-3-Antikörper. Wir danken Marko Lampe und Stefan Terjung von der Advanced Light Microscopy Facility am EMBL Heidelberg für ihre Unterstützung beim Einsatz des konfokalen Mikroskops Olympus iXplore SPIN SR. Diese Arbeiten wurden vom European Molecular Biology Laboratory und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) 452616889, SK) unterstützt. Wir erkennen den Zugang und die Dienstleistungen des Imaging-Zentrums am European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC) an, das großzügig von der Boehringer Ingelheim Foundation unterstützt wird.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die leiterartige Organisation des SC, die für die korrekte Rekombination und Segregation homologer Chromosomen essentiell ist, wurde erstmals vor fast 70 Jahren in der Elektronenmikroskopiebeobachtet 3,4. Während die Gesamtorganisation des SC in der Elektronenmikroskopie leicht aufgelöst werden kann, erfordert die Lokalisierung einzelner Komponenten innerhalb dieses Komplexes einen gezielteren Ansatz. Mit seiner Breite von nur ~100 nm kann die Substruktur des SC nicht durch herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Die hochauflösende Mikroskopie ist jedoch zu einem wichtigen Treiber für neue Entdeckungen über die Struktur und Funktion des synaptonemalen Komplexes 16,19,24,25,26,27,28,29,30 geworden. Um diese Forschung zu erleichtern, haben wir ein Montageverfahren demonstriert, das es ermöglicht, die Architektur des SC im C. elegans-Gonadengewebe mit SMLM- und STED-Mikroskopie zu untersuchen.
Ein entscheidender Schritt zur Optimierung der Auflösung in der SMLM-Bildgebung ist die direkte Vernetzung des Keimbahngewebes mit einem Poly-L-Lysin-beschichteten Deckglas (Schritt 4). Die kovalente Anheftung des Gewebes an das Deckglas ist unerlässlich, um Bewegungen innerhalb der Probe zu reduzieren, die zu großen Drifts führen und die Bildgebung über lange Zeiträume für SMLM unmöglich machen würden. Darüber hinaus führt selbst eine suboptimale Bindung, die die Kerne, die SCs enthalten, in einiger Entfernung vom Deckglas belässt, zu einem signifikanten Abfall der erreichbaren Auflösung aufgrund sphärischer Aberrationen (Abbildung 4). Alternativ zu der hier verwendeten kovalenten Bindung kann gefärbtes Keimbahngewebe auch zwischen zwei versiegelten Deckgläsern in einem kleinen Tropfen Bildgebungspuffer19,30 immobilisiert werden. Diese Immobilisierungsmethode reduziert jedoch das Volumen des Bildgebungspuffers in der Probe stark von 1 ml, das im hier optimierten Protokoll verwendet wird, auf nur wenige μL, was zu einer Ansäuerung des Bildgebungspuffers führt und die Zeit, für die die Probe abgebildet werden kann, stark verkürzt 38,53,54.
Lange Aufnahmezeiten sowohl für die SMLM- als auch für die STED-Mikroskopie beschränken den Einsatz dieser Methoden auf die Bildgebung chemisch fixierter Proben. Hier sorgt die Paraformaldehydfixierung dafür, dass die Struktur des SC während der Probenvorbereitung und Bildgebung erhalten bleibt. Trotz der hier getroffenen Vorsichtsmaßnahmen, um das SC in intaktem Gewebe abzubilden, ist die resultierende Struktur des SC nach der Fixierung nicht notwendigerweise identisch mit der Struktur in seinem nativen Zustand innerhalb eines lebenden Organismus. Da ein einzelnes Bild des fixierten SC eine einzige "Momentaufnahme" der biologischen Struktur darstellt, bleibt dieser Ansatz für die Dynamik der nativen Struktur in vivo blind.
Informationen über die Dynamik und Variabilität makromolekularer Strukturen lassen sich aber auch gewinnen, indem man nicht nur eine, sondern viele "Momentaufnahmen" aufnimmt. Während dieser Ansatz Veränderungen in der Struktur des SC während Pachyten19 beheben kann, gibt es mehrere Faktoren, die die Anzahl der Bilder begrenzen, die von einer einzigen Probe aufgenommen werden können, die mit diesem Protokoll erstellt wurde. Erstens führen die hohen Laserleistungen, die während der Bildaufnahme verwendet werden, zu einem dauerhaften Bleichen der Fluorophore und schließen die Abbildung benachbarter Regionen von Interesse oder mehrerer Z-Ebenen aus, wodurch die Anzahl der Bilder, die von einer einzigen Probe aufgenommen werden können, erheblich reduziert wird. Zweitens ist die Proben-/Gewebedichte auf dem mit dieser Methode hergestellten Deckglas gering, was die Anzahl der Bilder, die von einem einzelnen Deckglas aufgenommen werden können, erheblich einschränkt. Die geringe Probendichte verbietet auch die Verwendung automatisierter Bildakquisitionspipelines, die dazu beigetragen haben, Licht auf andere biologische Fragen zu werfen 34,55,56,57,58,59. Die Probendichte kann jedoch von einem erfahrenen Benutzer leicht erhöht werden.
Das hier vorgestellte Protokoll ist optimiert, um eine hohe Markierungsdichte zu erhalten, die notwendig ist, um eine optimale Auflösung in SMLM35 zu erreichen. Während frühere Protokolle das Gewebe vor der Immunfärbung kovalent an das Deckglas anheften16, verbindet dieses neue Protokoll das Gewebe erst mit dem Deckglas, nachdem die Proben in Lösung gefärbt wurden. Diese Modifikation ermöglicht es den Antikörpern, die für die Immunmarkierung verwendet werden, von allen Seiten frei auf das Gewebe zuzugreifen, während die kovalente Anheftung des Gewebes an das Deckglas verhindern kann, dass Antikörper die Kerne erreichen, die dem Deckglas am nächsten sind, wodurch der Grad der Markierung verringert wird. Zusammen verbessern die hier beschriebenen Modifikationen die Auflösung von 40-50 nm (FRC-Auflösung)16 auf 30-40 nm (dieses Protokoll).
Wichtig ist, dass zwar eine hohe Markierungsdichte und eine hohe Konzentration von Antikörpern für SMLM unerlässlich sind, wir jedoch festgestellt haben, dass bessere STED-Mikroskopiebilder mit niedrigeren Antikörperkonzentrationen erhalten werden (Schritt 3). Bei einer Auflösung von mehreren zehn Nanometern wird die Größe der Moleküle, mit denen das interessierende Protein markiert wird, immer wichtiger. Wir haben daher F(ab')2-Fragmente verwendet, die halb so groß sind wie Antikörper voller Länge. Die Verbesserung des lokalen Kontrasts aufgrund einer kleineren Signalquelle und damit die durch diese Modifikation gewonnene Auflösung im Vergleich zur Verwendung von vollständigen sekundären Antikörpern ermöglichte die Auflösung der beiden C-Termini von SYP-5 innerhalb der zentralen Region durch TauSTED, die nicht durch konventionelle STED mit Antikörpern voller Länge aufgelöst werden (16 und Daten nicht gezeigt). Wir gehen davon aus, dass dieses optimierte Protokoll für die Bildgebung von SCs in intakten C. elegan-Keimbahnendie Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des SC während der Meiose erleichtern wird.

Die Reduzierung der Anzahl der Chromosomen um die Hälfte während der Meiose ist der Schlüssel zur Erzeugung gesunder Nachkommen in sich sexuell fortpflanzenden Organismen. Um diese Reduktion der Chromosomenzahl zu erreichen, müssen sich homologe Chromosomen während der Meiose I paaren und trennen. Um die genaue Segregation homologer Chromosomen zu gewährleisten, durchlaufen Keimzellen eine verlängerte Prophase I, in der homologe Chromosomen paaren, synapsieren und rekombinieren, um physikalische Verbindungen zwischen Homologenzu erzeugen 1. Das SC hat sich als die zentrale Struktur herausgestellt, die für die Regulierung der korrekten Progression durch meiotische Prophase2 entscheidend ist.
Das SC ist ein Komplex, dessen allgemeine Struktur evolutionär erhalten ist, obwohl es wenig Homologie zwischen seinen Proteinkomponenten gibt. Das SC wurde erstmals in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als eine dreiteilige, leiterartige Struktur identifiziert, die aus zwei lateralen Elementen oder Achsen, einem zentralen Bereich, der von transversalen Filamenten gebildet wird, und einem zentralen Element 3,4 besteht. Die Bestimmung der Organisation einzelner Komponenten innerhalb des Komplexes ist der Schlüssel zum besseren Verständnis der Rolle des SC während der meiotischen Prophase.
Der Modellorganismus C. elegans ist ideal geeignet, um die Struktur und Funktion des SC zu untersuchen, da seine Keimbahnen eine große Anzahl meiotischer Kerne mit vollständig zusammengesetzten SCs5 enthalten. Genetische und biochemische Studien haben gezeigt, dass die Chromosomenachsen von drei verschiedenen Cohesin-Komplexen6,7 und vier HORMA-Domänenproteinen namens HTP-1/2/3 und HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans gebildet werden. In der zentralen Region des SC wurden bisher sechs Proteine identifiziert, die Coiled-Coil-Domänen enthalten 12,13,14,15,16,17. Um den Abstand zwischen den beiden Achsen zu überbrücken, dimerisieren SYP-1, -5 und -6 kopf-an-kopf (Abbildung 1), während drei weitere Proteine ihre Interaktion im zentralen Element16,17,18,19 stabilisieren.
Ein detaillierter Einblick in die Organisation dieser Proteine ist unerlässlich, um die vielen Funktionen des SC während der Meiose zu verstehen. Da die Breite des zentralen Bereichs des SC nur ~100 nm beträgt, kann seine Substruktur nicht durch beugungsbegrenzte Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Die Visualisierung von Komponenten innerhalb einer Struktur dieser Größe ist jedoch durch hochauflösende Mikroskopie leicht möglich. Tatsächlich haben sich die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), die Expansionsmikroskopie 20, die Stimulated-Emission Depletion (STED)-Mikroskopie21 und die Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM)22,23 als wesentliche Werkzeuge zur Untersuchung der molekularen Architektur des SC über die Spezies 16,24,25,26,27,28,29 erwiesen. 30.
Um die Auflösungsgrenze zu überwinden, setzt die STED-Mikroskopie darauf, den beugungsbegrenzten Punkt des Emissionslichts mit einem donutförmigen Strahl des STED-Lasers zu überlagern, der theoretisch die Punktspreizfunktion auf molekulare Dimensionen31,32 einschränkt. Die Auflösung, die durch STED in biologischen Proben praktisch erreichbar ist, bleibt jedoch im Bereich von einigen zehn Nanometern in xy33.
Noch höhere Auflösungen in biologischen Proben können mit SMLM-Techniken erzielt werden. SMLM nutzt die blinkenden Eigenschaften spezifischer Fluorophore, um Objekte auf der Subbeugungsebene aufzulösen, indem räumlich überlappende Fluorophore zeitlich getrennt werden. Die Probe wird dann wiederholt abgebildet, um verschiedene Untergruppen von Fluorophoren zu erfassen. Die Position der Fluorophore innerhalb der Probe wird dann bestimmt, indem die Punktspreizfunktion (PSF) an die erhaltenen Signale über alle Bilder angepasst wird, die Strukturen bis zu 15 nm23,34 auflösen können.
Zusammengenommen kodieren die lokalisierten Bilder die Positionen aller Fluorophore. Die Auflösung von SMLM wird durch die Markierungsdichte und die Blinkeigenschaften des Fluorophors bestimmt. Nach dem Nyquist-Shannon-Kriterium ist es unmöglich, Objekte zuverlässig aufzulösen, die weniger als das Doppelte des durchschnittlichen Label-zu-Label-Abstands haben. Daher wird eine hohe Markierungsdichte für hochauflösende Bildgebung benötigt. Für das SC in C. elegans kann eine hohe Markierungsdichte erreicht werden, indem Epitopmarkierungen verwendet werden, die an bestimmten Stellen endogener Proteine mittels Genom-Editierung angebracht sind. Die Epitop-Tags können dann mit spezifischen monoklonalen Antikörpern mit hohen Affinitäten in hoher Dichte angefärbt werden19,30. Gleichzeitig muss der Einschaltzyklus einzelner Fluorophore kurz genug sein, um sicherzustellen, dass räumlich überlappende Fluorophore nicht gleichzeitig eingefangen werden35.
Aufgrund dieser beiden Anforderungen erfordert die Auflösung der Struktur großer makromolekularer Komplexe wie dem SC die Abbildung einer ausreichend großen Anzahl von Bildern und kann daher mehrere Stunden dauern. Der Fallstrick langer Abbildungszeiten besteht darin, dass Proben aufgrund von Bewegung des Tisches oder kleinen Strömen innerhalb des Probenpuffers dazu neigen, zu driften. Schon kleine Bewegungen in der Größenordnung von 10 nm sind bei der nm-Auflösung schädlich und müssen korrigiert werden. Die üblicherweise verwendeten Driftkorrekturmethoden sind jedoch nicht robust genug, um Bilder von zwei Kanälen, die nacheinander abgebildet wurden, genau zu überlagern36. Dies ist problematisch, da biologische Fragestellungen oft eine präzise Detektion und Lokalisierung mehrerer Ziele innerhalb derselben Probe erfordern. Um diese Probleme zu umgehen, wurden Methoden wie die ratiometrische Bildgebung entwickelt. Die ratiometrische Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Abbildung mehrerer Fluorophore mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren, mit einer anschließenden Zuordnung jedes detektierten Signals zu seinem jeweiligen Fluorophor basierend auf dem Verhältnis der Intensitäten in spektral unterschiedlichen Kanälen37,38.
Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der Organisation makromolekularer Komplexe wie des SC dreidimensionale (3D) Informationen. Um eine Superauflösung in drei Dimensionen (3D-SMLM) zu erreichen, wird eine zylindrische Linse in den optischen Pfad des emittierten Lichts eingebaut, die die Form des PSF eines Fluorophors in Abhängigkeit von seiner Entfernung von der Fokusebene verzerrt. Daher kann die genaue Position eines Fluorophors in der z-Ebene extrapoliert werden, indem die Form seines Emissionssignals35,39 analysiert wird. Die Kombination dieser Fortschritte in SMLM ermöglicht die Abbildung der 3D-Organisation makromolekularer Komplexe, einschließlich des SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Während der Meiose müssen homologe Chromosomen einander erkennen und aneinander haften, um ihre korrekte Segregation zu ermöglichen. Eines der Schlüsselereignisse, das die Interaktion homologer Chromosomen sichert, ist der Aufbau des synaptonemalen Komplexes (SC) in der meiotischen Prophase I. Obwohl es wenig Sequenzhomologie zwischen Proteinkomponenten innerhalb des SC zwischen verschiedenen Spezies gibt, wurde die allgemeine Struktur des SC während der Evolution weitgehend konserviert. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen erscheint das SC als dreigliedrige, leiterartige Struktur, die aus lateralen Elementen oder Achsen, transversalen Filamenten und einem zentralen Element besteht. 
Die genaue Identifizierung der Lokalisation einzelner Komponenten innerhalb des Komplexes durch Elektronenmikroskopie zur Bestimmung der molekularen Struktur des SC bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen erlaubt es, einzelne Proteinkomponenten innerhalb des Komplexes zu identifizieren. Da das SC jedoch nur ~100 nm breit ist, kann seine Substruktur nicht durch beugungsbegrenzte konventionelle Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden. Daher erfordert die Bestimmung der molekularen Architektur des SC hochauflösende Lichtmikroskopietechniken wie strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), Stimulated-Emission Depletion (STED) Mikroskopie oder Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM). 
Um die Struktur und Wechselwirkungen einzelner Komponenten innerhalb des SC zu erhalten, ist es wichtig, den Komplex in einer Umgebung zu beobachten, die seiner natürlichen Umgebung in den Keimzellen nahe kommt. Daher demonstrieren wir ein immunhistochemisches und bildgebendes Protokoll, das die Untersuchung der Substruktur des SC in intaktem, extrudiertem Caenorhabditis elegans-Keimbahngewebe mit SMLM- und STED-Mikroskopie ermöglicht. Die direkte Fixierung des Gewebes am Deckglas reduziert die Bewegung der Proben während der Bildgebung und minimiert Aberrationen in der Probe, um die hohe Auflösung zu erreichen, die erforderlich ist, um die Substruktur des SC in seinem biologischen Kontext zu visualisieren.

Um das SC innerhalb des C. elegans-Keimbahngewebes durch SMLM abzubilden, haben wir 2-Farben-ratiometrisches 3D-SMLM verwendet, um HTP-3, eine Komponente der Chromosomenachsen, und den C-Terminus des transversalen Filaments SYP-5 endogen mit einem Hämagglutinin (HA) -Tag zu lokalisieren. Die Lage beider Proteine innerhalb des SC von C. elegans wurde zuvor durch andere Studien bestimmt16,30.
Um Lichtstreuung und optische Aberrationen in dicken biologischen Proben zu minimieren, haben wir den untersten z-Schnitt der meiotischen Kerne abgebildet, die die SCs enthalten (Abbildung 3, gelbe Linien). Für jedes aufgenommene Bild wurde die Piezo-Stufenposition der Abbildungsebene relativ zur Piezo-Stufenposition markiert, wenn das Objektiv auf das Deckglas fokussiert wurde. Dies ermöglichte die Berechnung des Piezoabstands vom Deckglas. Erfolgreich montierte Proben werden stabil in der Nähe des Deckglases befestigt und behalten die Gonadenform (d.h. das Gewebe wird während des Postfixationsschritts nicht zwischen den beiden Deckgläsern zerquetscht). Die Qualität der Probenmontage kann leicht unter einem Stereomikroskop beurteilt werden, da gut befestigte Gonaden in Lösung keine Bewegung zeigen (Schritt 4.2.6). Aufgrund der Stochastizität des Montageprozesses wird das Gonadengewebe jedoch nicht unbedingt vollständig flach auf dem Deckglas ausgelegt. Daher kann die untere Ebene der Kerne, die SCs enthalten, in unterschiedlichen Abständen relativ zum Deckglas innerhalb derselben Gonade gefunden werden.
Um zu veranschaulichen, wie sich die Auflösung in Abhängigkeit von der Befestigung des Gewebes am Deckglas ändert, haben wir Bilder in verschiedenen Piezoabständen zum Deckglas aufgenommen. Um die Qualität eines einzelnen Bildes zu beurteilen, wurden die Fourierringkorrelationskurven (FRC)50,51 berechnet und die Auflösung wurde mit dem FRCResolution-Plugin innerhalb der SMAP-Software48 bestimmt. Zwei repräsentative Kerne, die aus zwei separaten 3D-SMLM-Bildern extrahiert wurden, die in unterschiedlichen Abständen zum Deckglas aufgenommen wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt. Bei SCs, die sich in der Nähe des Deckglases befinden, sind die Chromosomenachsen und der C-Terminus von SYP-5::HA in allen drei Dimensionen gut aufgelöst (Abbildung 4A, 0,8 μm vom Deckglas). Um zwei Strukturen aufzulösen, die durch einen bestimmten Abstand getrennt sind, muss die erreichte FRC-Auflösung in der Regel kleiner als die Hälfte dieses Abstands in der axialen Auflösung sein.
Um die gleichen Strukturen seitlich zu trennen, müssen noch kleinere FRC-Auflösungswerte erreicht werden. Tatsächlich beträgt die FRC-Auflösung in Proben, die sich in unmittelbarer Nähe des Deckglases befinden, 38 nm für den AlexaFluor 647-Kanal und 34 nm für den CF680-Kanal und damit deutlich unter dem erwarteten Abstand von 84 nm zwischen den C-Termini von SYP-516. Diese Entschließung löst daher leicht die Organisation des SC nicht nur in frontaler, sondern auch in lateraler Sicht (Abbildung 4B i,ii). Im Gegensatz dazu verschlechtert sich die Auflösung in SCs, die sich in einem Abstand von 5 μm vom Deckglas befinden, aufgrund von Lichtstreuung und sphärischen Aberrationen (Abbildung 4B). Die FRC-Auflösungen in diesem Abstand sinken auf 47 nm (AlexaFluor 647) und 41 nm (CF680), was die C-Termini von SYP-5 nicht vollständig auflösen kann. Da die optischen Aberrationen die laterale Auflösung stärker beeinträchtigen als die axiale Auflösung, werden HTP-3- und SYP-5-Bänder im Querschnitt der Seitenansicht in Proben, die sich in einem Abstand von 5 μm vom Deckglas befinden, nicht mehr eindeutig aufgelöst (Abbildung 4B ii). Der Vergleich der FRC-Auflösung von Bildern, die in verschiedenen Piezoabständen vom Deckglas aufgenommen wurden, ergab, dass das abgebildete Gewebe nicht weiter als 2 μm vom Deckglas entfernt sein sollte (Abbildung 5). Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung der korrekten Ausführung des Postfixationsschritts, bei dem das Gewebe erfolgreich mit der Poly-L-Lysin-Beschichtung des Deckglases vernetzt werden muss.
Um die erreichbare Auflösung mit einer anderen Super-Resolution-Technik zu demonstrieren, haben wir auch SCs in festem intaktem Keimbahngewebe mit TauSTED-Mikroskopie abgebildet. Abbildung 6A zeigt TauSTED-Bilder mit der höchsten und niedrigsten Auflösung, die in dieser Studie erreicht wurde, geschätzt aus Linienprofilen des SC in Frontalansicht (Abbildung 6B). In beiden Kernen konnten wir die beiden Lokalisationsbanden von HTP-3 in den Chromosomenachsen und die C-Termini von SYP-5 in der zentralen Region auflösen, was zeigt, dass die in TauSTED mit diesem optimierten Protokoll erreichbare Auflösung unter 84 nm liegt. Unter optimalen Bedingungen (Abbildung 6A, oben) konnten wir die C-Termini in leicht geneigten Ansichten des SC auflösen, die nur 50 nm voneinander entfernt waren (Abbildung 6A, gelbes Rechteck und 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Organisation des synaptonemalen Komplexes bei Caenorhabditis elegans. Der Cartoon zeigt eine vereinfachte Struktur des SC in C. elegans , die zwei homologe Chromosomen (grau) überbrückt. Die Struktur wird in Frontal-, Seiten- und Querschnittsansichten dargestellt. Chromosomenachsen werden als rote Balken dargestellt, während transversale Filamente in Cyan dargestellt werden. Transversale Filamentproteine (SYP-1, 5, 6 in C. elegans) sind im zentralen Bereich Kopf an Kopf (Cyan-Ball-Stick-Grafik) ausgerichtet, um den Abstand zwischen den beiden Achsen zu überbrücken. Die erwarteten Abstände zwischen den Achsen und den C-Termini von Querfilamenten werden angegeben. Abkürzung: SC = synaptonemaler Komplex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> Abbildung 2: Illustration der in der Studie verwendeten Probenvorbereitung . (A) Junge Erwachsene C. elegans werden am Kopf oder Schwanz seziert (grüne, gestrichelte Linien) und wie im Protokoll beschrieben verarbeitet. (B) Einzelne Schritte des Verfahrens sind mit Grafiken gekennzeichnet, die mit grauen Pfeilen verbunden sind. Abkürzungen: STED = stimulated-emission depletion; SMLM = Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> Abbildung 3: Lage des Gewebeschnitts, der durch Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie beobachtet werden kann. MIP einer sich drehenden Scheibe konfokales Bild einer ganzen Mount C. elegans Gonade. Das Gewebe wurde für HTP-3 und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA) gefärbt, und das kombinierte Signal ist grau dargestellt. Einzelne konfokale Bilder wurden mit dem Grid / Collection Stitching Fiji Plugin52 zusammengefügt, um ein Bild der gesamten Gonade zu erstellen. Der Einschub zeigt eine xy-Ansicht der untersten z-Ebene, die die SCs enthält. Die Lokalisation dieser Ebene ist in orthogonalen Ansichten des Gewebeschnitts dargestellt, der durch ein Rechteck im MIP-Bild der Gonade (gelbe Linien) angezeigt wird. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: MIP = Maximum Intensity Projection; SCs = synaptonemale Komplexe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> Abbildung 4: Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von HTP-3 und den C-Termini des SYP-5. (A,B) Links: SMLM-Bilder, die Pachytenkerne zeigen, die auf HTP-3 (rot) gefärbt sind, und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA, Cyan) (Maßstabsbalken = 1 μm). Mitte: Vergrößerte Bilder von Regionen von Interesse, die in A und B angezeigt werden, mit entsprechenden Querschnittsansichten unter jedem Bild (i, ii; Maßstabsbalken = 100 nm). Die Abschnitte des SC in vergrößerten Bildern werden gedreht, um die Chromosomenachsen parallel zur y-Achse auszurichten. Rechts: Grafische Darstellung der Lokalisierung der interessierenden Proteine innerhalb des SC, die die Orientierung des SC in den vergrößerten Regionen darstellt, die in der Mitte der Abbildung angezeigt werden. Abkürzungen: SMLM = Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie; SC = synaptonemaler Komplex. Rohdaten zur Rekonstruktion von SMLM-Bildern sind über die BioStudies-Datenbank60 verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> Abbildung 5: Die Fourierring-Korrelationsauflösung von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiebildern hängt vom Abstand der abgebildeten z-Ebene von der Ebene des Deckglases ab. Farbige Linien zeigen FRC-Kurven von Bildern, die in unterschiedlichen Abständen (wie durch den Farbbalken dargestellt) vom Deckglas aufgenommen wurden. Der 1/7-Schwellenwert, der zur Bestimmung der FRC-Auflösung verwendet wird, wird durch eine schwarze horizontale Linie angezeigt. Einschübe zeigen die Abhängigkeit der FRC-Auflösung vom Piezoabstand vom Deckglas. Das Plotten erfolgte durch ein eigens geschriebenes R-Skript (Version 4.1.2, Supplementary File 1), in dem Originalkurven mit Funktionen aus dem Paket "ggplot2" geglättet wurden. Abkürzungen: FRC = Fourierringkorrelation; SMLM = Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie; SC = synaptonemaler Komplex. Daten für FRC-Kurven und SMLM-Daten sind über die BioStudies-Datenbank60 verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> Abbildung 6: Stimulierte Emissionsabbaumikroskopie, verstärkt durch Fluoreszenzlebensdauer-basierte Information (TauSTED), löst zwei Lokalisierungsbanden sowohl für HTP-3 als auch für den C-Terminus von SYP-5 auf. (A) Zwei repräsentative TauSTED-Bilder zeigen Pachytenkerne gefärbt für HTP-3 (rot) und den C-Terminus von SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) mit höherer (oben) und niedrigerer (unten) Strukturdefinition (Maßstabsbalken = 1 μm). Die Rechtecke markieren Bereiche mit den aufgelösten C-Termini von SYP-5 frontal (weiß) und einer leicht geneigten Ansicht (gelb) des SC. (B,C) Verteilung des HTP-3 (rot) und des C-Terminus des SYP-5 (cyan) Signals aufgelöst durch TauSTED. Linienprofile von Regionen von Interesse, die das SC in frontalen (B) oder leicht geneigten (C) Ansichten enthalten, werden als vollständige Linien mit Intensität auf den Maximalwert normalisiert. Linienprofile wurden mit Fiji ImageJ erstellt. Gestrichelte Linien in B zeigen die gemittelten Daten für jedes Protein. Die dicke Cyanlinie in C entspricht dem Linienprofil mit dem kürzesten aufgelösten Abstand zwischen den C-Termini von SYP-5. Um die Abstände zwischen den Antikörpern zu bestimmen, die auf bestimmte Proteine abzielen, wurden die Linienprofile (n = 9 (B), n = 7 (C)) mit einem eigens geschriebenen R-Skript (Version 4.1.2, Supplementary File 1) mit Doppelgaussien versehen. Der mittlere Abstand ± die Standardabweichung (B) und der Bereich mit fett hervorgehobenem Mindestwert (C) sind jeweils oben in jedem Diagramm angegeben. Abkürzungen: STED = stimulated emission depletion microscopy; SC = synaptonemaler Komplex. Angezeigte Bilder und Datenpunkte von gezeichneten Linienprofilen sind über die BioStudies-Datenbank60 verfügbar (Zugangs-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer und Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 1: Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie-Erfassung. Video zeigt Fluorophore, die mit einer angemessenen Rate blinken (50 Bilder werden gezeigt, Maßstabsbalken = 5 μm, 20 ms/Bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 1: Datenanalyseskript. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Die hochauflösende Mikroskopie kann einen detaillierten Einblick in die Organisation von Komponenten innerhalb des synaptonemalen Komplexes bei der Meiose geben. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Auflösung einzelner Proteine des Synaptonemalkomplexes Caenorhabditis elegans .

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Der synaptonemale Komplex ist eine Schlüsselkomponente für die Meiose. Um seine Funktion zu untersuchen, müssen wir auch seine Struktur verstehen, für die sich die hochauflösende Mikroskopie als unglaublich nützlich erwiesen hat. Wir haben unser Protokoll optimiert, um immungefärbte C.elegans-Gonade stabil an einem Deckglas zu befestigen, was dazu beiträgt, die Auflösung in intaktem Gewebe bis auf 30 Nanometer zu verbessern.Das Design von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Experimenten, die anschließende Analyse und auch die Interpretation der Daten kann sehr anspruchsvoll sein und sollte am besten zusammen mit einem Experten eingerichtet werden. Ivana Cavka, Doktorandin im Labor, demonstriert das Verfahren. Die Aufnahme der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie-Bilder wird auch von Rory Power, einem Optikingenieur am MBL Imaging Center, gezeigt.Beginnen Sie mit der Auswahl altersgerechter Caenorhabditis elegans-Würmer aus NGM-Agarplatten. Übertragen Sie die Würmer in einen 30-Mikroliter-Tropfen EBTT auf einem Deckglas. Waschen Sie die Würmer mit zusätzlichen 30 Mikrolitern EBTT.Entfernen Sie 30 Mikroliter der Lösung und lassen Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen mit den Würmern auf dem Deckglas zurück. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Köpfe und / oder Schwänze der Würmer abzuschneiden, um die Gonade zu extrudieren. Bei einer erfolgreichen Dissektion wird das Gonadengewebe vollständig außerhalb des Wurmkörpers extrudiert.Pipettieren Sie 30 Mikroliter der Fixierlösung in den Tropfen der sezierten Würmer. Durch Pipettieren mischen und die Proben eine Minute lang fixieren lassen. Stoppen Sie die Fixierung genau nach einer Minute, indem Sie die Würmer mit einer 20-Mikroliter-Pipette auf ein mit TBST gefülltes PCR-Röhrchen überführen.Führen Sie dann eine Wäsche durch, indem Sie die sezierten Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge drehen. Sobald der Überstand entfernt ist, resuspendieren Sie die Würmer in 200 Mikrolitern frischem TBST. Nach dem letzten Waschen die Würmer in 200 Mikrolitern PBST resuspendieren und das PCR-Röhrchen auf Eis legen.Drehen Sie die sezierten Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter kaltes Methanol hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und lassen Sie die Proben 30 bis 60 Sekunden in Methanol auf Eis. Waschen Sie die Proben zweimal mit 200 Mikrolitern PBST.Nachdem Sie die Proben gedreht und den Überstand entfernt haben, fügen Sie die blockierende Lösung zu den Proben hinzu und halten Sie sie 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen die Arbeitslösungen im Blockierpuffer. Drehen Sie die Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge, entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu.Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben dreimal in PBST. Verdünnen Sie die beschrifteten Fab prime zwei Fragmente zu den Arbeitslösungen im Blockierpuffer.Nach dem dritten Waschgang die Proben herunterschleudern, den Überstand entfernen und 30 bis 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzufügen. Die Probe in eine dunkle Kammer geben und 30 Minuten bis zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für fünf bis 15 Minuten.Schleudern Sie die gefärbten Proben herunter und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 50 Mikroliter PBST hinzu und übertragen Sie die gefärbten Würmer auf ein Deckglas. Pipettieren Sie 5,7 bis 6,3 Mikroliter der postfixativen Lösung auf ein Poly-L-Lycin-Deckglas.Pipettieren Sie die sezierten Würmer im gleichen Volumen ab und geben Sie sie in den Fixiertropfen auf dem Poly-L-Lysin-Deckglas. Decken Sie die Probe mit einem kleinen Deckglas ab. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Stück Filterpapier und fixieren Sie die Probe für drei bis fünf Minuten in einer dunklen Kammer.Frieren Sie die Proben ein, indem Sie sie auf einen Aluminiumblock in Trockeneis legen. Entfernen Sie nach mindestens 20 Minuten das kleinere Deckglas mit einem Rasierer. Tauchen Sie das Deckglas für etwa 10 Sekunden in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen mit eiskaltem PBS oder Methanol, das bei minus 20 Grad Celsius gekühlt ist.Legen Sie das Deckglas in eine Vertiefung einer mit PBST-Puffer gefüllten Platte mit sechs Vertiefungen. Entfernen Sie das PBST aus dem Brunnen, fügen Sie frisches PBST hinzu und lassen Sie die Probe fünf Minuten stehen. Nach erneutem Waschen mit PBST lassen Sie die Proben bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius.Beurteilen Sie vor der Bildgebung die Qualität der Probenmontage unter einem Stereomikroskop. Wenn Sie den hier gezeigten maßgeschneiderten Probenhalter verwenden, wickeln Sie den Magnetring mit Parafilm ein und bereiten Sie dann einen Milliliter Bildpuffer vor. Nehmen Sie ein Deckglas von der Sechs-Well-Platte.Legen Sie es in die speziell angefertigte Halterung und befestigen Sie das Deckglas mit dem mit Parafilm umwickelten Magnetring in der Halterung. Pipettieren Sie vorsichtig den Bildpuffer in der Kammer, die durch den Magnetring auf der Oberseite der Probe erzeugt wird, und verschließen Sie die Kammer mit Parafilm. Um die Probe zu montieren, fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Clean Oil Objektiv hinzu.Ohne Luft in das Tauchöl einzuführen, legen Sie den Probenhalter mit der montierten Probe vorsichtig auf den Mikroskoptisch. Bewegen Sie die Piezostufe mithilfe des EMU-Plug-in-Fensters in MicroManager 2, bis das Signal des Fokus-Lock-Lasers an der Quadranten-Fotodiode erkannt wird. Erfassen Sie ein Back-Focal Plane-Bild mit geringerer Leistung mit einem Laser bei 640 Nanometern Anregung, um das Fehlen von Luftblasen im Immersionsöl zu bestätigen.Lokalisieren Sie das Gonadengewebe mit der Hellfeldbeleuchtung. Konzentrieren Sie sich mit einer Beleuchtung mit geringer Intensität bei 640 Nanometern auf den Gewebeabschnitt, der viele synaptonemale Komplexe enthält. Belichten Sie die Probe bei hoher Bestrahlungsstärke mit Beleuchtung bei 640 Nanometern für etwa 30 Sekunden, bis eine angemessene Blinkrate erreicht ist.Erfassen Sie 200.000 Bilder mit einer Belichtungszeit von 20 Millisekunden mit dem mehrdimensionalen Erfassungswerkzeug in MicroManager 2. In der Zwischenzeit richten Sie die UV-Aktivierung mit der Aktivierungsoption des EMU-Plugins ein, um die gewünschte Blinkrate beizubehalten. Die unterste Ebene der meiotischen Kerne, die synaptonemale Komplexe enthalten, wurde innerhalb einer Caenorhabditis elegans-Gonade unter Verwendung von HTP-3- und SYP-5-Färbung visualisiert.Die Chromosomenachsen im C-Terminus von SYP-5 HA waren in allen drei Dimensionen in synaptonemalen Komplexen in der Nähe des Deckglases gut aufgelöst. Die Auflösung verschlechtert sich jedoch in synaptonemalen Komplexen, die sich in einem Abstand von fünf Mikrometern vom Deckglas befinden, aufgrund von Lichtstreuung und sphärischen Aberrationen. Bilder, die in verschiedenen Piezoabständen vom Deckglas aufgenommen wurden, zeigten, dass das abgebildete Gewebe nicht weiter als zwei Mikrometer vom Deckglas entfernt sein sollte.Das Probenvorbereitungsprotokoll kann auch mit der TauSTED-Mikroskopie verwendet werden. Mit der optimierten Probenvorbereitung wurden HTP-3 in den Chromosomenachsen und die C-Termini von SYP-5 im zentralen Bereich in Frontalansicht und leicht geneigter Ansicht aufgelöst. Um die beste Auflösung zu erhalten, müssen die Gonaden eng mit dem Deckglas vernetzt sein, um sicherzustellen, dass die synaptonemalen Komplexe nicht weiter als zwei Mikrometer vom Deckglas entfernt sind.Wir verwenden dieses Protokoll nicht nur für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie, sondern auch für die Mikroskopie der stimulierten Emissionsverarmung. Es kann auch für andere hochauflösende Mikroskopietechniken nützlich sein.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...