Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

ברצוננו להודות לג'ונאס ריס ולמעבדת ריס על שיתוף מאגרי הדמיה להדמיית SMLM. אנו מודים גם ליומי קים על זן C. elegans המשמש בפרוטוקול זה ולאבי פ. דרנבורג על הנוגדן נגד HTP-3. אנו מודים למרקו לאמפה וסטפן טרג'ונג ממתקן מיקרוסקופיית האור המתקדם ב- EMBL היידלברג על תמיכתם בשימוש במיקרוסקופ הקונפוקלי Olympus iXplore SPIN SR. עבודה זו נתמכה על ידי המעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית ו- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית - 452616889, SK). אנו מכירים את הגישה והשירותים הניתנים על ידי מרכז ההדמיה במעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית (EMBL IC), הנתמכים בנדיבות על ידי קרן Boehringer Ingelheim.

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

הארגון דמוי הסולם של ה-SC, החיוני לרקומבינציה נכונה ולהפרדה של כרומוזומים הומולוגיים, נצפה לראשונה לפני כמעט 70 שנה במיקרוסקופיית אלקטרונים 3,4. בעוד שהארגון הכולל של ה- SC נפתר בקלות במיקרוסקופיית אלקטרונים, לוקליזציה של רכיבים בודדים בתוך קומפלקס זה דורשת גישה ממוקדת יותר. עם רוחבו של ~ 100 ננומטר בלבד, לא ניתן לפתור את תת-המבנה של ה- SC על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. עם זאת, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הפכה למניע מרכזי לתגליות חדשות על המבנה והתפקוד של הקומפלקס הסינפטונמלי 16,19,24,25,26,27,28,29,30. כדי להקל על מחקר זה, הדגמנו הליך הרכבה המאפשר ללמוד את הארכיטקטורה של SC בתוך C. elegans gonad רקמה עם SMLM ו STED מיקרוסקופיה.
שלב קריטי למיטוב הרזולוציה בהדמיית SMLM הוא קישור ישיר של רקמת הנבט לכיסוי מצופה פולי-L-ליזין (שלב 4). ההצמדה הקוולנטית של הרקמה לכיסוי חיונית כדי להפחית את התנועות בתוך הדגימה שיגרמו לסחף גדול ויהפכו את ההדמיה לאורך פרקי זמן ארוכים עבור SMLM לבלתי אפשרית. בנוסף, אפילו חיבור לא אופטימלי שמשאיר את הגרעינים המכילים SCs במרחק מהכיסוי מוביל לירידה משמעותית ברזולוציה הניתנת להשגה כתוצאה מסטיות כדוריות (איור 4). לחלופין, לחיבור הקוולנטי המשמש כאן, רקמת נבט מוכתמת יכולה גם להיות משותקת בין שני כיסויים אטומים בטיפה קטנה של מאגרהדמיה 19,30. עם זאת, שיטת אימוביליזציה זו מפחיתה מאוד את נפח מאגר ההדמיה בדגימה מ-1 מ"ל המשמש בפרוטוקול הממוטב כאן למספר μL בלבד, מה שיגרום להחמצת מאגר ההדמיה ויפחית מאוד את הזמן שבו ניתן לצלם את הדגימה 38,53,54.
זמני רכישה ארוכים הן עבור מיקרוסקופיית SMLM והן עבור מיקרוסקופיית STED מגבילים את השימוש בשיטות אלה להדמיה של דגימות קבועות כימית. כאן, קיבוע paraformaldehyde מבטיח כי המבנה של SC נשמר במהלך הכנת המדגם והדמיה. עם זאת, למרות אמצעי הזהירות שננקטו כאן כדי לדמות את ה-SC בתוך רקמה שלמה, המבנה המתקבל של ה-SC לאחר הקיבוע אינו בהכרח זהה למבנה במצבו הטבעי בתוך אורגניזם חי. יתר על כן, מכיוון שתמונה אחת של ה-SC הקבוע מייצגת "תמונת מצב" יחידה של המבנה הביולוגי, גישה זו נותרת עיוורת לדינמיקה של המבנה המקומי in vivo.
עם זאת, מידע על הדינמיקה והשונות של מבנים מקרומולקולריים יכול גם להתקבל על ידי רכישת לא רק אחד אלא רבים "תמונות". בעוד שגישה זו יכולה לפתור שינויים במבנה של SC במהלך pachytene19, ישנם מספר גורמים המגבילים את מספר התמונות שניתן לרכוש מדגימה אחת שהוכנה באמצעות פרוטוקול זה. ראשית, כוחות הלייזר הגבוהים המשמשים במהלך רכישת התמונה מובילים להלבנה קבועה של הפלואורופורים ומונעים הדמיה של אזורי עניין סמוכים או מישורי z מרובים, ובכך מפחיתים משמעותית את מספר התמונות שניתן לרכוש מדגימה אחת. שנית, צפיפות הדגימה/רקמה על הכיסוי שהוכן בשיטה זו נמוכה, מה שמגביל משמעותית את מספר התמונות שניתן לרכוש מכיסוי יחיד. צפיפות הדגימה הנמוכה אוסרת גם על שימוש בצינורות אוטומטיים לרכישת תמונות שעזרו לשפוך אור על שאלות ביולוגיות אחרות 34,55,56,57,58,59. עם זאת, צפיפות המדגם יכולה להיות מוגברת מעט על ידי משתמש מנוסה.
הפרוטוקול המוצג כאן מותאם להשגת צפיפות תיוג גבוהה הנחוצה להשגת רזולוציה אופטימלית ב- SMLM35. בעוד שפרוטוקולים קודמים מצמידים את הרקמה באופן קוולנטי לכיסוי לפני חיסון16, פרוטוקול חדש זה מצליב את הרקמה לכיסוי רק לאחר שהדגימות הוכתמו בתמיסה. שינוי זה מאפשר לנוגדנים המשמשים להדבקה חיסונית לגשת באופן חופשי לרקמה מכל הצדדים, בעוד שהחיבור הקוולנטי של הרקמה לכיסוי עשוי להגביל את הגעת הנוגדנים לגרעינים הקרובים ביותר לכיסוי, ובכך להפחית את מידת התווית. יחד, השינויים המתוארים כאן משפרים את הרזולוציה מ-40-50 ננומטר (רזולוציית FRC)16 ל-30-40 ננומטר (פרוטוקול זה).
חשוב לציין כי בעוד שצפיפות תיוג גבוהה וריכוז גבוה של נוגדנים חיוניים ל-SMLM, מצאנו שתמונות מיקרוסקופיות STED טובות יותר מתקבלות באמצעות ריכוזי נוגדנים נמוכים יותר (שלב 3). ברזולוציה של עשרות ננומטרים, גודל המולקולות המשמשות לתיוג החלבון המעניין הופך לחשוב יותר ויותר. לכן השתמשנו בשברי F(ab')2 שגודלם מחצית מגודלם של נוגדנים באורך מלא. השיפור בניגודיות המקומית עקב מקור אות קטן יותר, ולכן הרזולוציה שהושגה על ידי שינוי זה בהשוואה לשימוש בנוגדנים משניים באורך מלא, אפשרו את הרזולוציה של שני C-termini של SYP-5 באזור המרכז על ידי TauSTED, אשר אינם נפתרים על ידי STED קונבנציונאלי באמצעות נוגדנים באורך מלא (16 ונתונים לא מוצגים). אנו צופים כי פרוטוקול ממוטב זה להדמיית SCs ב-C. elegans germlines שלמים יקל על חקירת הקשר בין מבנה לתפקוד של ה-SC במהלך מיוזה.

הפחתת מספר הכרומוזומים בחצי במהלך המיוזה היא המפתח ליצירת צאצאים בריאים באורגניזמים המתרבים מינית. כדי להשיג הפחתה זו במספר הכרומוזומים, כרומוזומים הומולוגיים חייבים להזדווג ולהפריד במהלך מיוזה I. כדי להבטיח הפרדה מדויקת של כרומוזומים הומולוגיים, תאי הנבט עוברים פרופאזה I מורחבת, שבמהלכה כרומוזומים הומולוגיים מזווגים, סינפסה ומתאחדים מחדש כדי ליצור קשרים פיזיקליים בין הומולוגים1. ה- SC התגלה כמבנה המרכזי שהוא המפתח לוויסות ההתקדמות הנכונה באמצעות פרופאזה מיוטית2.
ה-SC הוא קומפלקס שהמבנה הכללי שלו נשמר מבחינה אבולוציונית, למרות שיש מעט הומולוגיה בין מרכיבי החלבון שלו. ה-SC זוהה לראשונה במיקרוגרפים של אלקטרונים כמבנה משולש, דמוי סולם, המורכב משני יסודות או צירים רוחביים, אזור מרכזי שנוצר על ידי חוטים רוחביים, ויסוד מרכזי 3,4. קביעת הארגון של רכיבים בודדים בתוך המתחם היא המפתח לקידום הבנתנו את תפקיד ה- SC במהלך פרופאזה מיוטית.
אורגניזם המודל C. elegans מתאים באופן אידיאלי לחקור את המבנה והתפקוד של SC מכיוון שהחיידקים שלו מכילים מספר רב של גרעינים מיוטיים עם SCs5 מורכבים במלואם. מחקרים גנטיים וביוכימיים גילו כי צירי הכרומוזומים נוצרים על ידי שלושה קומפלקסים שונים של קוהסין6,7 וארבעה חלבוני תחום HORMA הנקראים HTP-1/2/3 ו-HIM-3 7,8,9,10,11 ב-C. elegans. באזור המרכזי של ה-SC זוהו עד כה שישה חלבונים המכילים תחומים סליליים מפותלים 12,13,14,15,16,17. כדי לגשר על המרחק בין שני הצירים, SYP-1, -5 ו-6- מתעמעמים באופן ראש בראש (איור 1), בעוד ששלושה חלבונים נוספים מייצבים את האינטראקציה שלהם ביסוד המרכזי16,17,18,19.
קבלת תובנה מפורטת על הארגון של חלבונים אלה חיונית להבנת הפונקציות הרבות של SC במהלך מיוזה. מכיוון שרוחב האזור המרכזי של ה-SC הוא רק ~100 ננומטר, לא ניתן לפתור את תת-המבנה שלו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוגבלת עקיפה. עם זאת, הדמיה של רכיבים בתוך מבנה בגודל זה ניתנת להשגה בקלות על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. ואכן, מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), מיקרוסקופיית הרחבה 20, מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED) 21, ומיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולות בודדות (SMLM)22,23 התגלו ככלים חיוניים לחקר הארכיטקטורה המולקולרית של ה-SC על פני מינים 16,24,25,26,27,28,29, 30.
כדי להתגבר על מגבלת הרזולוציה, מיקרוסקופיית STED מסתמכת על כיסוי הנקודה המוגבלת בדיפרקציה של אור הפליטה עם קרן בצורת סופגנייה מלייזר STED, אשר תיאורטית מכווצת את פונקציית התפשטות הנקודות לממדים מולקולריים31,32. עם זאת, הרזולוציה הניתנת למעשה להשגה על ידי STED בתוך דגימות ביולוגיות נשארת בטווח של כמה עשרות ננומטרים ב- xy33.
רזולוציה גבוהה עוד יותר בדגימות ביולוגיות ניתן להשיג עם טכניקות SMLM. SMLM רותם את תכונות המצמוץ של פלואורופורים ספציפיים כדי לפתור אובייקטים ברמת תת-עקיפה על ידי הפרדת פלואורופורים חופפים מרחבית בזמן. לאחר מכן הדגימה מצולמת שוב ושוב כדי ללכוד תת-קבוצות שונות של פלואורופורים. המיקום של הפלואורופורים בתוך הדגימה נקבע לאחר מכן על ידי התאמת פונקציית התפשטות הנקודות (PSF) לאותות המתקבלים בכל התמונות, מה שיכול לפתור מבנים עד 15 ננומטר23,34.
יחד, התמונות המקומיות מקודדות את מיקומם של כל הפלואורופורים. הרזולוציה של SMLM נקבעת על ידי צפיפות הסימון והמאפיינים המצמוץ של הפלואורופור. על פי קריטריון ניקוויסט-שאנון, אי אפשר לפתור באופן אמין אובייקטים שהם פחות מפי שניים מהמרחק הממוצע בין תווית לתווית. לפיכך, יש צורך בצפיפות תיוג גבוהה להדמיה ברזולוציה גבוהה. עבור SC ב- C. elegans, ניתן להשיג צפיפות תיוג גבוהה על ידי שימוש בתגי אפיטופ המוצמדים לאתרים ספציפיים של חלבונים אנדוגניים באמצעות עריכת גנום. לאחר מכן ניתן להכתים את תגי האפיטופ בצפיפות גבוהה באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים בעלי זיקות גבוהות19,30. יחד עם זאת, המחזור של פלואורופורים בודדים חייב להיות קצר מספיק כדי להבטיח שפלואורופורים חופפים מרחבית לא יילכדו בו זמנית35.
בשל שתי דרישות אלה, פתרון המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים גדולים כגון SC דורש הדמיה של מספר גדול מספיק של תמונות, ולכן יכול לקחת כמה שעות. המלכודת של זמני הדמיה ארוכים היא שדגימות נוטות להיסחף עקב תנועה של השלב או זרמים קטנים בתוך מאגר הדגימה; אפילו תנועות קטנות בסדר גודל של 10 ננומטר מזיקות ברזולוציית NM ויש לתקן אותן. עם זאת, שיטות תיקון הסחף הנפוצות אינן חזקות מספיק כדי לכסות במדויק תמונות של שני ערוצים שצולמו ברצף36. זה בעייתי מכיוון ששאלות ביולוגיות מבקשות לעתים קרובות זיהוי מדויק ולוקליזציה של מטרות מרובות בתוך אותה דגימה. כדי לעקוף בעיות אלה, פותחו שיטות כגון הדמיה יחסותית. הדמיה רציומטרית מאפשרת הדמיה סימולטנית של פלואורופורים מרובים עם ספקטרום עירור ופליטה חופפים, עם הקצאה עוקבת של כל אות שזוהה לפלואורופור המתאים לו בהתבסס על יחס העוצמות בערוצים נפרדים ספקטרלית37,38.
בנוסף, לימוד הארגון של קומפלקסים מקרומולקולריים כגון SC דורש מידע תלת-ממדי (3D). כדי להשיג רזולוציית-על בשלושה ממדים (3D-SMLM), עדשה גלילית משולבת בנתיב האופטי של האור הנפלט המעוותת את צורת ה-PSF של פלואורופור בהתאם למרחקו ממישור המוקד. לפיכך, ניתן לבצע אקסטרפולציה של המיקום המדויק של פלואורופור במישור z על ידי ניתוח צורת אות הפליטה שלו35,39. שילוב ההתקדמות הזו ב-SMLM מאפשר הדמיה של הארגון התלת-ממדי של קומפלקסים מקרומולקולריים, כולל ה-SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

במהלך מיוזה, כרומוזומים הומולוגיים חייבים לזהות זה את זה ולהיצמד זה לזה כדי לאפשר הפרדה נכונה שלהם. אחד מאירועי המפתח שמבטיחים את האינטראקציה של כרומוזומים הומולוגיים הוא הרכבת הקומפלקס הסינפטונמלי (SC) בפרופאזה מיוטית I. אף על פי שאין כמעט הומולוגיה של רצף בין רכיבי חלבונים בתוך ה-SC בין מינים שונים, המבנה הכללי של ה-SC נשמר מאוד במהלך האבולוציה. במיקרוגרפים של אלקטרונים, ה-SC מופיע כמבנה משולש, דמוי סולם, המורכב מיסודות או צירים רוחביים, חוטים רוחביים ויסוד מרכזי. 
עם זאת, זיהוי מדויק של לוקליזציה של רכיבים בודדים בתוך המתחם על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לקבוע את המבנה המולקולרי של SC נותר מאתגר. לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת זיהוי של רכיבי חלבון בודדים בתוך המכלול. עם זאת, מכיוון שרוחב ה-SC הוא ~100 ננומטר בלבד, לא ניתן לפתור את תת-המבנה שלו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית מוגבלת עקיפה. לפיכך, קביעת הארכיטקטורה המולקולרית של ה-SC דורשת טכניקות של מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה במיוחד, כגון מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED) או מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת (SMLM). 
כדי לשמור על המבנה והאינטראקציות של רכיבים בודדים בתוך ה- SC, חשוב להתבונן במכלול בסביבה הקרובה לסביבה הטבעית שלה בתאי הנבט. לכן, אנו מדגימים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה והדמיה המאפשר לחקור את תת-המבנה של ה-SC ברקמת נבט של Caenorhabditis elegans שלמה, עם SMLM ומיקרוסקופיית STED. קיבוע ישיר של הרקמה לכיסוי מפחית את תנועת הדגימות במהלך ההדמיה וממזער סטיות בדגימה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה הדרושה כדי לדמיין את תת-המבנה של ה- SC בהקשר הביולוגי שלו.

כדי לדמות את ה-SC בתוך רקמת הנבט של C. elegans על-ידי SMLM, השתמשנו ב-3D-SMLM בעל יחס של 2 צבעים כדי למקם את HTP-3, רכיב של צירי הכרומוזומים, ואת C-terminus של הנימה הרוחבית SYP-5 המתויגת באופן אנדוגני עם תג המגלוטינין (HA). המיקום של שני החלבונים בתוך SC של C. elegans נקבע בעבר על ידי מחקרים אחרים16,30.
כדי למזער את פיזור האור ואת הסטיות האופטיות הטמונות בדגימות ביולוגיות עבות, דמיינו את חתך ה-z התחתון ביותר של גרעינים מיוטיים המכילים את ה-SCs (איור 3, קווים צהובים). עבור כל תמונה שנרכשה, מיקום הבמה של piezo של מישור ההדמיה סומן ביחס למיקום שלב piezo כאשר המטרה התמקדה בכיסוי. זה איפשר את חישוב המרחק piezo מן הכיסוי. דגימות שהורכבו בהצלחה מחוברות ביציבות קרוב לכיסוי ושומרות על צורת הגונד (כלומר, הרקמה אינה מרוסקת בין שני הכיסויים במהלך שלב הפוסט-פיקסציה). ניתן להעריך בקלות את איכות הרכבה של הדגימה תחת מיקרוסקופ סטריאו מכיוון שגונדות מחוברות היטב אינן מראות כל תנועה בתמיסה (שלב 4.2.6). עם זאת, בשל הסטוכסטיות של תהליך ההרכבה, רקמת הגונד לא בהכרח תהיה מונחת שטוחה לחלוטין על הכיסוי. לכן, המישור התחתון של הגרעינים המכילים SCs עשוי להימצא במרחקים משתנים ביחס לכיסוי בתוך אותה גונדה.
כדי להמחיש כיצד הרזולוציה משתנה בהתאם להצמדת הרקמה לכיסוי, רכשנו תמונות במרחקי piezo שונים לכיסוי. כדי להעריך את האיכות של תמונה בודדת, חושבו עקומות המתאם של טבעת פורייה (FRC)50,51 והרזולוציה נקבעה באמצעות תוסף FRCResolution בתוכנת SMAP 48. שני גרעינים מייצגים שחולצו משתי תמונות נפרדות של 3D-SMLM שצולמו במרחקים שונים לכיסוי מוצגים באיור 4. ב-SCs הממוקמים קרוב לכיסוי, צירי הכרומוזומים וסיומת C של SYP-5::HA נפתרים היטב בכל שלושת הממדים (איור 4A, 0.8 מיקרומטר מהכיסוי). כדי לפתור שני מבנים המופרדים על ידי מרחק נתון, רזולוציית FRC שהושגה חייבת בדרך כלל להיות קטנה ממחצית המרחק הזה ברזולוציה הצירית.
כדי להפריד את אותם מבנים לרוחב, יש להשיג אפילו ערכי רזולוציית FRC קטנים יותר. ואכן, בדגימות הממוקמות בסמיכות לכיסוי, רזולוציית ה- FRC היא 38 ננומטר עבור ערוץ AlexaFluor 647 ו- 34 ננומטר עבור ערוץ CF680, ולכן הרבה מתחת למרחק הצפוי של 84 ננומטר בין ה- C-termini של SYP-516. לפיכך, רזולוציה זו פותרת בקלות את הארגון של ה-SC לא רק בראייה פרונטלית אלא גם בראייה רוחבית (איור 4B i,ii). לעומת זאת, הרזולוציה מתדרדרת ב-SCs הממוקמים במרחק של 5 מיקרומטר מהכיסוי עקב פיזור אור וסטיות כדוריות (איור 4B). רזולוציות ה-FRC במרחק זה יורדות ל-47 ננומטר (AlexaFluor 647) ו-41 ננומטר (CF680), מה שלא יכול לפתור באופן מלא את ה-C-termini של SYP-5. מאחר שהסטיות האופטיות פוגעות ברזולוציה הצידית בצורה חמורה יותר מאשר הרזולוציה הצירית, רצועות HTP-3 ו-SYP-5 אינן נפתרות עוד בבירור בחתך הרוחב של התצוגה הצידית בדגימות הממוקמות במרחק של 5 מיקרומטר מהכיסוי (איור 4B ii). השוואת רזולוציית ה-FRC של תמונות שנרכשו במרחקי piezo שונים מהכיסוי גילתה שהרקמה המצולמת צריכה להיות במרחק של לא יותר מ-2 מיקרומטר מהכיסוי (איור 5). תוצאה זו מדגישה את החשיבות של ביצוע נכון של שלב postfixation, שבמהלכו יש להצליב את הרקמה בהצלחה לציפוי הפולי-L-ליזין של הכיסוי.
כדי להדגים את הרזולוציה הניתנת להשגה באמצעות טכניקה אחרת של רזולוציית-על, דמיינו גם SCs ברקמת נבט שלמה קבועה עם מיקרוסקופיית TauSTED. איור 6A מציג תמונות TauSTED עם הרזולוציה הגבוהה והנמוכה ביותר שהושגה במחקר זה, כפי שהוערך מפרופילי קווים של ה-SC במבט חזיתי (איור 6B). בשני הגרעינים, יכולנו לפתור את שני פסי הלוקליזציה של HTP-3 בצירי הכרומוזומים ושל C-termini של SYP-5 באזור המרכז, ולהוכיח כי הרזולוציה שניתן להשיג ב- TauSTED באמצעות פרוטוקול ממוטב זה היא מתחת ל-84 ננומטר. בתנאים אופטימליים (איור 6A, למעלה), יכולנו לפתור את ה-C-termini בתצוגות מוטות מעט של ה-SC שהופרדו ב-50 ננומטר בלבד (איור 6A, מלבן צהוב ו-6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של ארגון הקומפלקס הסינפטונמלי ב-Caenorhabditis elegans. הקריקטורה מציגה מבנה פשוט של ה-SC ב-C. elegans המגשר בין שני כרומוזומים הומולוגיים (אפור). המבנה מוצג בתצוגות חזיתיות, לרוחב וחתך. צירי הכרומוזומים מוצגים כפסים אדומים ואילו חוטים רוחביים מוצגים בציאן. חלבוני נימה רוחביים (SYP-1, 5, 6 ב- C. elegans) מכוונים באופן ראש בראש (גרפיקת מקל כדור ציאן) באזור המרכז כדי לגשר על המרחק בין שני הצירים. המרחקים הצפויים בין הצירים לבין C-termini של חוטים רוחביים מסומנים. קיצור: SC = קומפלקס סינפטונמלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> איור 2: המחשה של הכנת המדגם ששימשה במחקר . (A) בוגרים צעירים מסוג C. elegans מנותחים בראשם או בזנבו (קווים ירוקים ומקווקווים) ומעובדים כמתואר בפרוטוקול. (B) שלבים בודדים של השיטה מסומנים בגרפיקה המחוברת בחצים אפורים. קיצורים: STED = דלדול פליטה מגורה; SMLM = מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת; PBS = מלח חצוב פוספט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> איור 3: מיקום מקטע הרקמה שניתן לצפות בו על-ידי מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת. MIP של תמונה קונפוקלית של דיסק מסתובב של גונד הר שלם C. elegans. הרקמה הוכתמה עבור HTP-3 ו- C-terminus של SYP-5 (SYP-5::HA), והאות המשולב מוצג באפור. תמונות קונפוקליות בודדות נתפרו באמצעות תוסף פיג'י52 לתפירת גריד/אוסף כדי ליצור תמונה של הגונד כולו. הכניסה מציגה תצוגת xy של מישור z התחתון ביותר המכיל את ה- SCs. הלוקליזציה של מישור זה מוצגת בתצוגות אורתוגונליות של קטע הרקמה המצוין על ידי מלבן בתמונת MIP של הגונד (קווים צהובים). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: MIP = הטלת עוצמה מקסימלית; SCs = קומפלקסים סינפטונמליים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> איור 4: מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת של HTP-3 וה-C-termini של ה-SYP-5. (A,B) משמאל: תמונות SMLM המציגות גרעיני פכיטן מוכתמים עבור HTP-3 (אדום) ואת C-terminus של SYP-5 (SYP-5::HA, ציאן) (סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר). מרכז: תמונות מוגדלות של אזורי עניין המצוינים ב- A וב- B עם תצוגות חתך תואמות המוצגות מתחת לכל תמונה (i, ii; סרגל קנה מידה = 100 ננומטר). המתיחות של ה-SC בתוך תמונות מוגדלות מסובבות כדי לכוון את צירי הכרומוזומים במקביל לציר ה-y. ימין: ייצוג גרפי של לוקליזציה של החלבונים בעלי העניין בתוך ה-SC המתאר את הכיוון של ה-SC באזורים המוגדלים המוצגים במרכז האיור. קיצורים: SMLM = מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת; SC = קומפלקס סינפטונמלי. נתונים גולמיים לשחזור תמונות SMLM זמינים דרך מסד הנתונים BioStudies60 (מזהה גישה: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> איור 5: רזולוציית המתאם של טבעת פורייה של תמונות מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת תלויה במרחק של מישור z המצולם ממישור הכיסוי. קווים צבעוניים מציגים עקומות FRC של תמונות שנרכשו במרחקים שונים (כפי שמתואר בסרגל הצבע) מהכיסוי. סף 1/7 המשמש לקביעת רזולוציית FRC מסומן על ידי קו אופקי שחור. כניסות מראות את התלות של רזולוציית FRC במרחק הפיאזו מהכיסוי. העלילה בוצעה על ידי סקריפט R שנכתב בהתאמה אישית (גרסה 4.1.2, קובץ משלים 1) שבו העקומות המקוריות הוחלקו עם פונקציות מחבילת "ggplot2". קיצורים: FRC = מתאם טבעת פורייה; SMLM = מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת; SC = קומפלקס סינפטונמלי. נתונים עבור עקומות FRC ונתוני SMLM זמינים דרך מסד הנתונים BioStudies60 (מזהה גישה: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> איור 6: מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה המשופרת על-ידי מידע פלואורסצנטי מבוסס אורך חיים (TauSTED) פותרת שני תחומי לוקליזציה הן עבור HTP-3 והן עבור C-terminus של SYP-5. (A) שתי תמונות מייצגות של TauSTED מראות גרעיני פכיטן מוכתמים עבור HTP-3 (אדום) ו-C-terminus של SYP-5 (SYP-5::HA, ציאן) עם הגדרה מבנית גבוהה יותר (עליונה) ותחתונה (למטה) (סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר). המלבנים מסמנים אזורים עם C-termini פתור של SYP-5 בחזית (לבן) ותצוגה מוטה מעט (צהוב) של SC. (B,C) התפלגות של HTP-3 (אדום) ו- C-terminus של SYP-5 (ציאן) אות שנפתר על ידי TauSTED. פרופילי קו של אזורי עניין המכילים את ה- SC בתצוגות חזיתיות (B) או מוטות מעט (C) מוצגים כקווים מלאים עם עוצמה מנורמלת לערך המרבי. פרופילי קו נוצרו באמצעות פיג'י ImageJ. קווים מקווקווים ב-B מציגים את הנתונים הממוצעים של כל חלבון. קו הציאן העבה ב- C מתאים לפרופיל הקו עם המרחק הקצר ביותר בין ה- C-termini של SYP-5 . כדי לקבוע את המרחקים בין הנוגדנים המכוונים לחלבונים ספציפיים, פרופילי הקו (n = 9 (B), n = 7 (C)) הותאמו לגאוס כפול באמצעות סקריפט R שנכתב בהתאמה אישית (גרסה 4.1.2, קובץ משלים 1). המרחק הממוצע ± סטיית התקן (B) והטווח עם הערך המינימלי המודגש בהדגשה (C) מסומנים מעל כל תרשים, בהתאמה. קיצורים: STED = מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה; SC = קומפלקס סינפטונמלי. תמונות מוצגות ונקודות נתונים של פרופילי קו משורטטים זמינות דרך מסד הנתונים BioStudies60 (מזהה גישה: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: הרכב המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
סרטון משלים 1: רכישת מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת. סרטון המציג פלואורופורים מהבהבים בקצב המתאים (מוצגות 50 פריימים, סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר, 20 אלפיות השנייה למסגרת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>
קובץ משלים 1: סקריפט ניתוח נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

קומפלקס סינפטונמלי הוא מרכיב מפתח למיוזה. כדי ללמוד את תפקידו, עלינו גם להבין את המבנה שלה אשר מיקרוסקופיה ברזולוציית סופר התברר להיות שימושי להפליא. ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול שלנו כדי להצמיד ביציבות גונד C.elegans חסר חיסון לכיסוי המסייע לשפר את הרזולוציה עד 30 ננומטר ברקמות שלמות.התכנון של ניסויי מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת, הניתוח שלאחר מכן, וגם הפרשנות של הנתונים יכולים להיות מאתגרים למדי ויש להגדיר אותם בצורה הטובה ביותר יחד עם מומחה. מי שתדגים את ההליך תהיה איוונה קבקה, עמיתת קדם-דוקטורט במעבדה. רכישת תמונות המיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת תוצג גם על ידי רורי פאוור, מהנדס אופטיקה במרכז ההדמיה MBL.התחילו בקטיף תולעי Caenorhabditis elegans תואמות גיל מצלחות אגר NGM. מעבירים את התולעים לטיפה של 30 מיקרוליטר של EBTT על גבי כיסוי. לשטוף את התולעים עם 30 microliters נוספים של EBTT.הסר 30 microliters של הפתרון משאיר טיפה 30 microliter עם התולעים על הכיסוי. השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך את ראשי התולעים ו / או את הזנבות כדי לבלוט את הגונדה. בדיסקציה מוצלחת, רקמת הגונד תובלט במלואה מחוץ לגוף התולעת.פיפטה 30 מיקרוליטר של הפתרון המקובע לתוך טיפת התולעים המנותקות. מערבבים על ידי פיפטינג ומשאירים את הדוגמאות לתיקון למשך דקה אחת. עצור את הקיבוע בדיוק לאחר דקה אחת על ידי העברת התולעים באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר על צינור PCR מלא ב- TBST.לאחר מכן בצע שטיפה על ידי סיבוב הדגימות המנותקות על צנטריפוגה מיני ספסל. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשעות את התולעים ב-200 מיקרוליטרים של TBST טרי. לאחר הכביסה הסופית, להשעות את התולעים ב 200 microliters של PBST ולהניח את צינור PCR על קרח.סובבו את הדגימות המנותחות על צנטריפוגה מיני ספסל והסירו את הסופר-נטנט. הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטרים של מתנול קר, ערבבו בפיפטציה והשאירו את הדגימות במתנול למשך 30 עד 60 שניות על הקרח. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 200 microliters של PBST.לאחר סיבוב הדגימות והסרת הסופרנטנט, הוסיפו את תמיסת החסימה לדגימות ושמרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות. לדלל את הנוגדנים העיקריים לפתרונות העבודה במאגר החסימה. סובבו את הדגימות על צנטריפוגה קטנה, הסירו את תמיסת החסימה, והוסיפו 30 עד 50 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים העיקרית.לדגור לילה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBST. דלל את שני השברים המסומנים Fab prime לפתרונות העבודה במאגר החסימה.לאחר השטיפה השלישית, סובבו את הדגימות, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו 30 עד 50 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית. מניחים את הדגימה בחדר חשוך ודוגרים במשך 30 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש עד 15 דקות.סובבו את הדגימות המוכתמות והסירו את הסופר-נטנט. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של PBST ומעבירים את התולעים המוכתמות לכיסוי. פיפטה 5.7 עד 6.3 מיקרוליטר של התמיסה הפוסט-קיבוצית על כיסוי פולי-ל-ליצין.מפרקים את התולעים המנותקות באותו נפח ומעבירים לטיפת הקיבוע על כיסוי הפולי-ל-ליזין. מכסים את הדגימה בכיסוי קטן. הסר את עודפי הנוזלים באמצעות פיסת נייר סינון קטנה ותקן את הדגימה במשך שלוש עד חמש דקות בחדר חשוך.הקפיאו את הדגימות על ידי הנחתן על גוש אלומיניום בקרח יבש. לאחר 20 דקות לפחות, יש להסיר את הכיסוי הקטן יותר באמצעות סכין גילוח. טבלו את הכיסוי בצינור חרוטי בקוטר 50 מיליליטר המכיל PBS קר כקרח או מתנול מקורר במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ-10 שניות.מניחים את הכיסוי לתוך באר של צלחת בת שש בארות מלאה במאגר PBST. מוציאים את ה-PBST מהבאר, מוסיפים PBST טרי ומשאירים את הדגימה למשך חמש דקות. לאחר שטיפה עם PBST שוב, להשאיר את הדגימות על ארבע מעלות צלזיוס עד הדמיה.לפני ההדמיה, הערך את איכות הדגימה המורכבת תחת מיקרוסקופ סטריאו. אם אתה משתמש במחזיק הדגימה המותאם אישית המוצג כאן, עטוף את הטבעת המגנטית בפרפילם, ולאחר מכן הכן מיליליטר אחד של מאגר הדמיה. קח כיסוי מצלחת שש הבארות.הניחו אותו במחזיק המותאם אישית וקבעו את הכיסוי במחזיק באמצעות הטבעת המגנטית העטופה בפארפילם. פיפטה עדינה של חיץ ההדמיה בתא שנוצר על ידי הטבעת המגנטית על גבי הדגימה ואטמו את התא באמצעות פרפילם. כדי להרכיב את הדגימה, הוסיפו טיפה אחת של שמן טבילה למטרת השמן הנקי.מבלי להכניס אוויר לשמן הטבילה, הניחו בעדינות את מחזיק הדגימה עם הדגימה המותקנת על במת המיקרוסקופ. באמצעות חלון תוסף EMU בתוך MicroManager 2, הזז את שלב piezo עד שהאות מלייזר נעילת המיקוד מזוהה בפוטודיודה הרביע. קבל תמונת מישור מוקד אחורי בעוצמה נמוכה יותר עם לייזר בעירור של 640 ננומטר כדי לאשר את היעדר בועות האוויר בשמן הטבילה.לוקליזציה של רקמת הגונד באמצעות תאורת השדה הבהיר. באמצעות תאורה בעוצמה נמוכה של 640 ננומטר, התמקדו בקטע הרקמה המכיל קומפלקסים סינפטונמליים רבים. המשך לחשוף את הדגימה בהקרנה גבוהה עם תאורה של 640 ננומטר למשך כ-30 שניות עד להשגת קצב מצמוץ מתאים.רכוש 200, 000 מסגרות עם זמן חשיפה של 20 אלפיות השנייה באמצעות כלי הרכישה הרב-ממדי ב- MicroManager 2. בינתיים, הגדר את הפעלת ה- UV באמצעות אפשרות ההפעלה של תוסף EMU כדי לשמור על קצב המצמוץ הרצוי. המישור התחתון ביותר של גרעינים מיוטיים המכילים קומפלקסים סינפטונמליים הודגם בתוך גונד Caenorhabditis elegans באמצעות מכתים HTP-3 ו- SYP-5.צירי הכרומוזומים בסיומת C של SYP-5 HA נפתרו היטב בכל שלושת הממדים בקומפלקסים סינפטונמליים הממוקמים קרוב לכיסוי. עם זאת, הרזולוציה מתדרדרת במתחמים סינפטונמליים הממוקמים במרחק של חמישה מיקרומטרים מהכיסוי עקב פיזור אור וסטיות כדוריות. תמונות שנרכשו במרחקים שונים של piezo מהכיסוי גילו כי הרקמה המצולמת לא צריכה להיות רחוקה יותר משני מיקרומטרים מהכיסוי.פרוטוקול הכנת הדגימה יכול לשמש גם עם מיקרוסקופיה TauSTED. עם הכנת הדגימה הממוטבת, HTP-3 בצירי הכרומוזומים וה- C-termini של SYP-5 באזור המרכז נפתרו במבט חזיתי ובתצוגה מוטה מעט. כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר, הגונדות חייבות להיות מקושרות בחוזקה לכיסוי כדי להבטיח שמתחמי הסינפטונמליים יהיו במרחק של לא יותר משני מיקרומטרים מהכיסוי.אנו משתמשים בפרוטוקול זה לא רק למיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולות בודדות, אלא גם למיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה. זה עשוי להיות שימושי גם עבור טכניקות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...