Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

हम एसएमएलएम इमेजिंग के लिए इमेजिंग बफर साझा करने के लिए जोनास रीस और रीस लैब को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सी एलिगेंस स्ट्रेन के लिए युमी किम और चिकन-एंटी-एचटीपी -3 एंटीबॉडी के लिए एबी एफ डर्नबर्ग को भी धन्यवाद देते हैं। हम ओलंपस आईएक्सप्लोर स्पिन एसआर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में उनके समर्थन के लिए ईएमबीएल हीडलबर्ग में उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा से मार्को लैम्पे और स्टीफन टेरजुंग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला और ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन - 452616889, एसके) द्वारा समर्थित किया गया था। हम यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला (ईएमबीएल आईसी) में इमेजिंग सेंटर द्वारा प्रदान की गई पहुंच और सेवाओं को स्वीकार करते हैं, जो उदारतापूर्वक बोहरिंगर इंगेलहेम फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

एससी का सीढ़ी जैसा संगठन, जो सही पुनर्संयोजन और समरूप गुणसूत्रों के अलगाव के लिए आवश्यक है, पहली बार लगभग 70 साल पहले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3,4 में देखा गया था। जबकि एससी के समग्र संगठन को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में आसानी से हल किया जाता है, इस परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के स्थानीयकरण के लिए अधिक लक्षित दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। केवल ~ 100 एनएम की चौड़ाई के साथ, एससी की उपसंरचना को पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी सिनैप्टोनमल कॉम्प्लेक्स 16,19,24,25,26,27,28,29,30 की संरचना और कार्य पर नई खोजों के लिए एक प्रमुख चालक बन गया है। इस शोध को सुविधाजनक बनाने के लिए, हमने एक बढ़ती प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है जो एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के साथ सी एलिगेंस गोनैड ऊतक के भीतर एससी की वास्तुकला का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
एसएमएलएम इमेजिंग में रिज़ॉल्यूशन को अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम सीधे जर्मलाइन ऊतक को पॉली-एल-लाइसिन लेपित कवरस्लिप (चरण 4) से क्रॉस-लिंक करना है। कवरस्लिप के लिए ऊतक का सहसंयोजक लगाव नमूने के भीतर आंदोलनों को कम करने के लिए आवश्यक है जिसके परिणामस्वरूप बड़े बहाव होंगे और एसएमएलएम के लिए लंबे समय तक इमेजिंग असंभव हो जाएगी। इसके अतिरिक्त, यहां तक कि एक उप-मानक लगाव जो एससी युक्त नाभिक को कवरस्लिप से दूरी पर छोड़ देता है, गोलाकार विपथन के परिणामस्वरूप प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन में एक महत्वपूर्ण गिरावट की ओर जाता है (चित्रा 4)। वैकल्पिक रूप से यहां उपयोग किए जाने वाले सहसंयोजक लगाव के लिए, सना हुआ जर्मलाइन ऊतक इमेजिंग बफर19,30 की एक छोटी बूंद में दो सील कवरलिप्स के बीच भी स्थिर किया जा सकता है। हालांकि, यह स्थिरीकरण विधि यहां अनुकूलित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 1 एमएल से नमूने में इमेजिंग बफर की मात्रा को केवल कुछ μL तक गंभीर रूप से कम कर देती है, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग बफर का अम्लीकरण होगा और उस समय को गंभीर रूप से कम कर देगा जिसके लिए नमूने को38,53,54 इमेज किया जा सकता है।
एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए लंबे अधिग्रहण समय रासायनिक रूप से निश्चित नमूनों की इमेजिंग के लिए इन विधियों के उपयोग को सीमित करते हैं। यहां, पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण यह सुनिश्चित करता है कि नमूना तैयार करने और इमेजिंग के दौरान एससी की संरचना संरक्षित है। हालांकि, बरकरार ऊतक के भीतर एससी की छवि बनाने के लिए यहां बरती गई सावधानियों के बावजूद, निर्धारण के बाद एससी की परिणामी संरचना आवश्यक रूप से एक जीवित जीव के भीतर अपनी मूल स्थिति में संरचना के समान नहीं है। इसके अलावा, चूंकि निश्चित एससी की एक एकल छवि जैविक संरचना के एकल "स्नैपशॉट" का प्रतिनिधित्व करती है, इसलिए यह दृष्टिकोण विवो में मूल संरचना की गतिशीलता के लिए अंधा रहता है।
हालांकि, मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं की गतिशीलता और परिवर्तनशीलता पर जानकारी न केवल एक बल्कि कई "स्नैपशॉट" प्राप्त करके भी प्राप्त की जा सकती है। हालांकि यह दृष्टिकोण पचीटेन19 के दौरान एससी की संरचना में परिवर्तन को हल कर सकता है, ऐसे कई कारक हैं जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए एकल नमूने से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या को सीमित करते हैं। सबसे पहले, छवि अधिग्रहण के दौरान उपयोग की जाने वाली उच्च लेजर शक्तियां फ्लोरोफोरेस के स्थायी विरंजन का कारण बनती हैं और रुचि के आसन्न क्षेत्रों या कई जेड-विमानों की इमेजिंग को रोकती हैं, जिससे एक नमूने से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या में काफी कमी आती है। दूसरा, इस विधि द्वारा तैयार कवरस्लिप पर नमूना / ऊतक घनत्व कम है, जो एकल कवरस्लिप से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या को काफी सीमित करता है। कम नमूना घनत्व स्वचालित छवि अधिग्रहण पाइपलाइनों के उपयोग को भी प्रतिबंधित करता है जो अन्य जैविक प्रश्नों 34,55,56,57,58,59 पर प्रकाश डालने में मदद करता है। हालांकि, नमूना घनत्व को एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा थोड़ा बढ़ाया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को एक उच्च लेबलिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो एसएमएलएम35 में इष्टतम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। जबकि पिछले प्रोटोकॉल सहसंयोजक रूप से इम्यूनोस्टेनिंग16 से पहले ऊतक को कवरस्लिप से जोड़ते हैं, यह नया प्रोटोकॉल ऊतक को कवरस्लिप से केवल तभी जोड़ता है जब नमूने समाधान में दाग होते हैं। यह संशोधन इम्यूनोलेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को सभी तरफ से ऊतक तक स्वतंत्र रूप से पहुंचने की अनुमति देता है, जबकि कवरस्लिप के लिए ऊतक का सहसंयोजक लगाव एंटीबॉडी को कवरस्लिप के निकटतम नाभिक तक पहुंचने से रोक सकता है, जिससे लेबलिंग की डिग्री कम हो जाती है। साथ में, यहां वर्णित संशोधन 40-50 एनएम (एफआरसी रिज़ॉल्यूशन) 16 से 30-40 एनएम (इस प्रोटोकॉल) तक रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं।
महत्वपूर्ण रूप से, जबकि एसएमएलएम के लिए एक उच्च लेबलिंग घनत्व और एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता आवश्यक है, हमने पाया कि कम एंटीबॉडी सांद्रता (चरण 3) का उपयोग करके बेहतर एसटीईडी माइक्रोस्कोपी छवियां प्राप्त की जाती हैं। दसियों नैनोमीटर के संकल्प पर, रुचि के प्रोटीन को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अणुओं का आकार तेजी से महत्वपूर्ण हो जाता है। इसलिए हमने एफ (एबी') 2 टुकड़ों को नियोजित किया जो पूर्ण लंबाई वाले एंटीबॉडी के आकार के आधे हैं। एक छोटे सिग्नल स्रोत के कारण स्थानीय कंट्रास्ट में सुधार, और इसलिए पूर्ण लंबाई वाले द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने की तुलना में इस संशोधन द्वारा प्राप्त संकल्प ने ताऊएसटीईडी द्वारा मध्य क्षेत्र के भीतर एसवाईपी -5 के दो सी-टर्मिनी के समाधान की अनुमति दी, जो पारंपरिक एसटीईडी द्वारा पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी (16 और डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके हल नहीं किए जाते हैं। एलिगेंसजर्मलाइन में इमेजिंग एससी के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान एससी के संरचना-कार्य संबंध की जांच की सुविधा प्रदान करेगा।

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्रों की संख्या को आधा करना यौन प्रजनन करने वाले जीवों में स्वस्थ संतान पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्रोमोसोम संख्या में इस कमी को प्राप्त करने के लिए, होमोलोगस क्रोमोसोम को अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान जोड़ा और अलग करना चाहिए। समरूप गुणसूत्रों के सटीक अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए, रोगाणु कोशिकाएं एक विस्तारित प्रोफ़ेज़ I से गुजरती हैं, जिसके दौरान होमोलोग्स1 के बीच भौतिक लिंक उत्पन्न करने के लिए समरूप गुणसूत्र जोड़ी, सिनैप्स और पुनर्संयोजन करते हैं। एससी केंद्रीय संरचना के रूप में उभरा है जो मियोटिक प्रोफ़ेज़2 के माध्यम से सही प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है।
एससी एक जटिल है जिसकी सामान्य संरचना विकासवादी रूप से संरक्षित है, भले ही इसके प्रोटीन घटकों के बीच बहुत कम होमोलॉजी हो। एससी को पहली बार इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में एक त्रिपक्षीय, सीढ़ी जैसी संरचना के रूप में पहचाना गया था जिसमें दो पार्श्व तत्व या अक्ष, अनुप्रस्थ फिलामेंट्स द्वारा गठित एक केंद्रीय क्षेत्र और एक केंद्रीय तत्व 3,4 शामिल थे। परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के संगठन का निर्धारण करना मियोटिक प्रोफ़ेज़ के दौरान एससी की भूमिका की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।
एलिगेंस एससी की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है क्योंकि इसके रोगाणुओं में पूरी तरह से इकट्ठे एससी5 के साथ बड़ी संख्या में मियोटिक नाभिक होते हैं। आनुवंशिक और जैव रासायनिक अध्ययनों से पता चला है कि क्रोमोसोम अक्षों का निर्माण तीन अलग-अलग कोहेसिन कॉम्प्लेक्स 6,7 और चार एचओआरएमए डोमेन प्रोटीन द्वारा किया जाता है जिन्हें एचटीपी -1/2/3 और एचआईएम -3 7,8,9,10,11 सी एलिगेंस में कहा जाता है। एससी के मध्य क्षेत्र में, कुंडलित-कॉइल डोमेन युक्त छह प्रोटीनों की पहचान अब तक 12,13,14,15,16,17 की गई है। दो अक्षों के बीच की दूरी को पाटने के लिए, एसवाईपी -1, -5, और -6 सिर-से-सिर तरीके से डिमराइज करते हैं (चित्रा 1), जबकि तीन अतिरिक्त प्रोटीन केंद्रीय तत्व16,17,18,19 में अपनी बातचीत को स्थिर करते हैं।
अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान एससी के कई कार्यों को समझने में इन प्रोटीनों के संगठन में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्राप्त करना आवश्यक है। चूंकि एससी के केंद्रीय क्षेत्र की चौड़ाई केवल ~ 100 एनएम है, इसलिए इसकी उपसंरचना को विवर्तन-सीमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, इस आकार की संरचना के भीतर घटकों की कल्पना करना सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। दरअसल, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), विस्तार माइक्रोस्कोपी20, उत्तेजित-उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी 21, और एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) 22,23 प्रजातियों में एससी की आणविक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण के रूप में उभरे हैं। 30.
रिज़ॉल्यूशन सीमा को दूर करने के लिए, एसटीईडी माइक्रोस्कोपी एसटीईडी लेजर से डोनट के आकार के बीम के साथ उत्सर्जन प्रकाश के विवर्तन-सीमित स्थान को ओवरले करने पर निर्भर करता है, जो सैद्धांतिक रूप से आणविक आयाम31,32 तक पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन को संकुचित करता है। हालांकि, जैविक नमूनों के भीतर एसटीईडी द्वारा व्यावहारिक रूप से प्राप्त संकल्प xy33 में कुछ दसियों नैनोमीटर की सीमा में रहता है।
जैविक नमूनों में भी उच्च रिज़ॉल्यूशन एसएमएलएम तकनीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। एसएमएलएम समय में स्थानिक रूप से अतिव्यापी फ्लोरोफोरे को अलग करके उप-विवर्तन स्तर पर वस्तुओं को हल करने के लिए विशिष्ट फ्लोरोफोरे के ब्लिंकिंग गुणों का उपयोग करता है। फिर फ्लोरोफोरे के विभिन्न उप-समूहों को पकड़ने के लिए नमूना को बार-बार चित्रित किया जाता है। नमूने के भीतर फ्लोरोफोरेस की स्थिति तब सभी छवियों में प्राप्त संकेतों के लिए पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) को फिट करके निर्धारित की जाती है, जो 15 एनएम23,34 तक संरचनाओं को हल कर सकती है।
एक साथ लिया गया, स्थानीयकृत छवियां सभी फ्लोरोफोरे की स्थिति को एन्कोड करती हैं। एसएमएलएम का संकल्प लेबलिंग घनत्व और फ्लोरोफोरे की ब्लिंकिंग विशेषताओं द्वारा निर्धारित किया जाता है। Nyquist-शैनन मानदंड के अनुसार, उन वस्तुओं को मज़बूती से हल करना असंभव है जो औसत लेबल-टू-लेबल दूरी से दोगुने से कम हैं। इस प्रकार, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक उच्च लेबलिंग घनत्व की आवश्यकता होती है। एलिगेंस में एससी के लिए, जीनोम संपादन का उपयोग करके अंतर्जात प्रोटीन की विशिष्ट साइटों से जुड़े एपिटोप टैग का उपयोग करके एक उच्च लेबलिंग घनत्व प्राप्त किया जा सकता है। एपिटोप टैग को तब उच्च समानताओं19,30 के साथ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके उच्च घनत्व पर दाग दिया जा सकता है। इसी समय, अलग-अलग फ्लोरोफोरे का ऑन-साइकिल इतना छोटा होना चाहिए कि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्थानिक रूप से अतिव्यापी फ्लोरोफोरे को एक ही समय में कैप्चर नहीं किया जाताहै।
इन दो आवश्यकताओं के कारण, एससी जैसे बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में छवियों की इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार कई घंटे लग सकते हैं। लंबे इमेजिंग समय का दोष यह है कि नमूने चरण के आंदोलन या नमूना बफर के भीतर छोटी धाराओं के कारण बह जाते हैं; यहां तक कि 10 एनएम के क्रम में छोटे आंदोलन एनएम रिज़ॉल्यूशन पर हानिकारक हैं और इसके लिए ठीक किया जाना चाहिए। हालांकि, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बहाव सुधार विधियांक्रमिक रूप से चित्रित दो चैनलों की छवियों को सटीक रूप से ओवरले करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं हैं। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि जैविक प्रश्न अक्सर एक ही नमूने के भीतर कई लक्ष्यों का सटीक पता लगाने और स्थानीयकरण के लिए पूछते हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, अनुपातमीट्रिक इमेजिंग जैसे तरीके विकसित किए गए हैं। रेशियोमेट्रिक इमेजिंग अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ कई फ्लोरोफोरे की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देता है, जिसमें वर्णक्रमीय रूप सेअलग-अलग चैनलों में तीव्रता के अनुपात के आधार पर प्रत्येक पता लगाए गए सिग्नल को उसके संबंधित फ्लोरोफोरे में बाद में असाइनमेंट किया जाता है।
इसके अतिरिक्त, एससी जैसे मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के संगठन का अध्ययन करने से त्रि-आयामी (3 डी) जानकारी की आवश्यकता होती है। तीन आयामों (3 डी-एसएमएलएम) में सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, उत्सर्जित प्रकाश के ऑप्टिकल पथ में एक बेलनाकार लेंस शामिल किया जाता है जो फोकल प्लेन से इसकी दूरी के आधार पर फ्लोरोफोरे के पीएसएफ के आकार को विकृत करता है। इसलिए, जेड-प्लेन में फ्लोरोफोरे की सटीक स्थिति को इसके उत्सर्जन संकेत35,39 के आकार का विश्लेषण करके विस्तारित किया जा सकता है। एसएमएलएम में इन प्रगति के संयोजन से एससी सहित मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी संगठन की इमेजिंग की अनुमति मिलती है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, समरूप गुणसूत्रों को अपने सही अलगाव की अनुमति देने के लिए एक दूसरे को पहचानना और पालन करना चाहिए। होमोलोगस क्रोमोसोम की बातचीत को सुरक्षित करने वाली प्रमुख घटनाओं में से एक मियोटिक प्रोफ़ेज़ I में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स (एससी) की असेंबली है। भले ही विभिन्न प्रजातियों के बीच एससी के भीतर प्रोटीन घटकों के बीच बहुत कम अनुक्रम होमोलॉजी है, लेकिन एससी की सामान्य संरचना को विकास के दौरान अत्यधिक संरक्षित किया गया है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में, एससी एक त्रिपक्षीय, सीढ़ी जैसी संरचना के रूप में दिखाई देता है जो पार्श्व तत्वों या अक्षों, अनुप्रस्थ फिलामेंट्स और एक केंद्रीय तत्व से बना होता है। 
हालांकि, एससी की आणविक संरचना को निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के स्थानीयकरण की सटीक पहचान करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परिसर के भीतर व्यक्तिगत प्रोटीन घटकों की पहचान के लिए अनुमति देती है। हालांकि, चूंकि एससी केवल ~ 100 एनएम चौड़ा है, इसलिए इसकी उपसंरचना को विवर्तन-सीमित पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, एससी के आणविक वास्तुकला का निर्धारण करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों जैसे संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), उत्तेजित-उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी, या एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) की आवश्यकता होती है। 
एससी के भीतर व्यक्तिगत घटकों की संरचना और बातचीत को बनाए रखने के लिए, एक ऐसे वातावरण में परिसर का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है जो रोगाणु कोशिकाओं में अपने मूल वातावरण के करीब है। इसलिए, हम एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं जो एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के साथ बरकरार, एक्सट्रूडेड केनोरहाब्डिस एलिगेंस जर्मलाइन ऊतक में एससी की उप-संरचना के अध्ययन को सक्षम बनाता है। ऊतक को सीधे कवरस्लिप में ठीक करने से इमेजिंग के दौरान नमूनों की गति कम हो जाती है और इसके जैविक संदर्भ में एससी की उपसंरचना की कल्पना करने के लिए आवश्यक उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए नमूने में विचलन को कम किया जाता है।

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Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी अर्धसूत्रीविभाजन में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के भीतर घटकों के संगठन में एक विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। यहां, हम केनोरहाब्डिस एलिगेंस सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के व्यक्तिगत प्रोटीन को हल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं।

केनोरहाब्डिस एलिगेंस जर्मलाइन के भीतर सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स की सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

सिनेप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स अर्धसूत्रीविभाजन के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है। इसके कार्य का अध्ययन करने के लिए, हमें इसकी संरचना को भी समझना चाहिए जिसके लिए सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी अविश्वसनीय रूप से उपयोगी साबित हुई है। हमने इम्यूनोस्टेन्ड सी.एलिगेंस गोनाड को एक कवरस्लिप में स्थिर रूप से संलग्न करने के लिए अपने प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है जो बरकरार ऊतकों में 30 नैनोमीटर तक रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने में मदद करता है।एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का डिजाइन, बाद का विश्लेषण, और डेटा की व्याख्या भी काफी चुनौतीपूर्ण हो सकती है और इसे एक विशेषज्ञ के साथ मिलकर स्थापित किया जाना चाहिए। प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रयोगशाला में एक पूर्व-डॉक्टरेट साथी इवाना कैवका होगा। एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी छवियों का अधिग्रहण एमबीएल इमेजिंग सेंटर में एक ऑप्टिकल इंजीनियर रोरी पावर द्वारा भी दिखाया जाएगा।एनजीएम एगर प्लेटों से उम्र से मेल खाने वाले केनोरहाब्डिस एलिगेंस कीड़े चुनकर शुरू करें। कीड़े को कवरस्लिप पर ईबीटीटी की 30 माइक्रोलीटर बूंद में स्थानांतरित करें। कीड़े को ईबीटीटी के अतिरिक्त 30 माइक्रोलीटर के साथ धोएं।कवरस्लिप पर कीड़े के साथ 30 माइक्रोलीटर की बूंद छोड़कर घोल के 30 माइक्रोलीटर निकालें। गोनैड को बाहर निकालने के लिए कीड़े के सिर और / या पूंछ को काटने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। एक सफल विच्छेदन में, गोनैड ऊतक को कृमि शरीर के बाहर पूरी तरह से बाहर निकाल दिया जाएगा।विच्छेदित कीड़े की बूंद में फिक्सेटिव समाधान के 30 माइक्रोलीटर पिपेट। पाइपिंग द्वारा मिलाएं और नमूने को एक मिनट के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दें। टीबीएसटी से भरे पीसीआर ट्यूब पर 20 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके कीड़े को स्थानांतरित करके एक मिनट के बाद निर्धारण बंद कर दें।फिर एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज पर विच्छेदित नमूनों को घुमाकर एक धोने का प्रदर्शन करें। एक बार जब सतह पर तैरने वाला हटा दिया जाता है, तो ताजा टीबीएसटी के 200 माइक्रोलीटर में कीड़े को फिर से निलंबित कर देता है। अंतिम धोने के बाद, पीबीएसटी के 200 माइक्रोलीटर में कीड़े को फिर से निलंबित करें और पीसीआर ट्यूब को बर्फ पर रखें।विच्छेदित नमूनों को एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को हटा दें। ठंडे मेथनॉल के 50 से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, पाइपिंग द्वारा मिलाएं, और नमूनों को बर्फ पर 30 से 60 सेकंड के लिए मेथनॉल में छोड़ दें। नमूने को पीबीएसटी के 200 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं।नमूनों को घुमाने और सुपरनैटेंट को हटाने के बाद, नमूनों में ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें और इसे 45 से 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। ब्लॉकिंग बफर में काम करने वाले समाधानों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। नमूनों को एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज पर घुमाएं, ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 30 से 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएसटी में नमूने को तीन बार धोएं। ब्लॉकिंग बफर में काम करने वाले समाधानों के लिए लेबल किए गए फैब प्राइम दो टुकड़ों को पतला करें।तीसरे धोने के बाद, नमूनों को नीचे घुमाएं, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 30 से 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूने को एक अंधेरे कक्ष में रखें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट से दो घंटे या रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर नमूने को पांच से 15 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ तीन बार धोएं।दाग वाले नमूनों को नीचे घुमाएं और सुपरनैटेंट को हटा दें। पीबीएसटी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और दाग वाले कीड़े को कवरस्लिप पर स्थानांतरित करें। पॉली-एल-लाइसिन कवरस्लिप पर पोस्ट-फिक्सेटिव समाधान के पिपेट 5.7 से 6.3 माइक्रोलीटर।पिपेट ने समान मात्रा में विच्छेदित कीड़े को हटा दिया और पॉली-एल-लाइसिन कवरस्लिप पर फिक्सेटिव की बूंद में स्थानांतरित कर दिया। नमूने को एक छोटे कवरस्लिप के साथ कवर करें। फिल्टर पेपर के एक छोटे टुकड़े का उपयोग करके अतिरिक्त तरल को हटा दें और एक अंधेरे कक्ष में तीन से पांच मिनट के लिए नमूना ठीक करें।नमूनों को सूखी बर्फ में एल्यूमीनियम ब्लॉक पर रखकर फ्रीज करें। कम से कम 20 मिनट के बाद, रेजर का उपयोग करके छोटे कवरस्लिप को हटा दें। कवरस्लिप को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डुबोएं जिसमें बर्फ ठंडा पीबीएस या मेथनॉल होता है जो लगभग 10 सेकंड के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस कम तापमान पर ठंडा होता है।कवरस्लिप को पीबीएसटी बफर से भरे छह-वेल प्लेट के कुएं में रखें। पीबीएसटी को कुएं से निकालें, ताजा पीबीएसटी जोड़ें और नमूने को पांच मिनट के लिए छोड़ दें। एक बार फिर पीबीएसटी से धोने के बाद, नमूनों को इमेजिंग तक चार डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।इमेजिंग से पहले, स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत बढ़ते नमूने की गुणवत्ता का आकलन करें। यदि यहां दिखाए गए कस्टम-निर्मित नमूना धारक का उपयोग करके, पैराफिल्म के साथ चुंबकीय अंगूठी लपेटें, फिर एक मिलीलीटर इमेजिंग बफर तैयार करें। छह-वेल प्लेट से एक कवरस्लिप लें।इसे कस्टम-निर्मित धारक में रखें और पैराफिल्म-लपेटे चुंबकीय अंगूठी के साथ धारक में कवरस्लिप को ठीक करें। नमूने के शीर्ष पर चुंबकीय अंगूठी द्वारा बनाए गए कक्ष में इमेजिंग बफर को धीरे से पिपेट करें और पैराफिल्म का उपयोग करके कक्ष को सील करें। नमूने को माउंट करने के लिए, स्वच्छ तेल उद्देश्य में विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें।विसर्जन तेल में किसी भी हवा को पेश किए बिना, धीरे से माइक्रोस्कोप चरण पर माउंटेड नमूने के साथ नमूना धारक रखें। माइक्रोमैनेजर 2 के भीतर ईएमयू प्लग-इन विंडो का उपयोग करके, पीजो चरण को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि क्वाड्रंट फोटोडायोड पर फोकस लॉक लेजर से सिग्नल का पता नहीं चल जाता। विसर्जन तेल में हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए 640 नैनोमीटर उत्तेजना पर लेजर के साथ कम शक्ति पर एक बैक फोकल प्लेन छवि प्राप्त करें।ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग करके गोनैड ऊतक का स्थानीयकरण करें। 640 नैनोमीटर पर कम तीव्रता वाली रोशनी का उपयोग करते हुए, कई सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स वाले ऊतक अनुभाग पर ध्यान केंद्रित करें। लगभग 30 सेकंड के लिए 640 नैनोमीटर पर रोशनी के साथ उच्च विकिरण पर नमूने को उजागर करने के लिए आगे बढ़ें जब तक कि उचित ब्लिंकिंग दर हासिल न हो जाए।माइक्रोमैनेजर 2 में बहु-आयामी अधिग्रहण उपकरण का उपयोग करके 20 मिलीसेकंड के एक्सपोजर समय के साथ 200,000 फ्रेम प्राप्त करें। इस बीच, वांछित ब्लिंकिंग दर को बनाए रखने के लिए ईएमयू प्लगइन के सक्रियण विकल्प का उपयोग करके यूवी सक्रियण सेट करें। सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स युक्त मियोटिक नाभिक के सबसे निचले तल को एचटीपी -3 और एसवाईपी -5 धुंधला का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस गोनाड के भीतर देखा गया था।एसवाईपी -5 एचए के सी-टर्मिनस में क्रोमोसोम अक्षों को कवरस्लिप के करीब स्थित सिनैप्टोनेमल परिसरों में सभी तीन आयामों में अच्छी तरह से हल किया गया था। हालांकि, प्रकाश प्रकीर्णन और गोलाकार विपथन के कारण कवरस्लिप से पांच माइक्रोमीटर की दूरी पर स्थित सिनैप्टोनेमल परिसरों में रिज़ॉल्यूशन बिगड़ जाता है। कवरस्लिप से अलग-अलग पीजो दूरी पर प्राप्त छवियों से पता चला कि छवि ऊतक कवरस्लिप से दो माइक्रोमीटर से आगे नहीं होना चाहिए।नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग TauSTED माइक्रोस्कोपी के साथ भी किया जा सकता है। अनुकूलित नमूना तैयारी के साथ, क्रोमोसोम अक्षों में एचटीपी -3 और मध्य क्षेत्र में एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनी को फ्रंटल दृश्य और थोड़ा झुका हुआ दृश्य में हल किया गया था। सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, गोनैड्स को कवरस्लिप से कसकर जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स कवरस्लिप से दो माइक्रोमीटर से आगे नहीं हैं।हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के लिए करते हैं, बल्कि उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए भी करते हैं। यह अन्य सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए भी उपयोगी हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

माप Caenorhabditis एलिगेंस 96 खैर microtiter प्लेट्स में लाइफ स्पैन

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

समय चूक प्रारंभिक Embryogenesis में माइक्रोस्कोपी Caenorhabditis एलिगेंस

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

बैक्टीरियल डिवीजन मशीनरी की सुपर संकल्प इमेजिंग

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

अनुकूलन तूफान सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए परीक्षण के नमूने

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

फास्ट 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवित बैक्टीरिया में Cytokinetic जेड अंगूठी के सुपर संकल्प इमेजिंग (f3D सिम)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

तीन आयामी सुपर Interferometric Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा एफ actin फिलामेंट्स के संकल्प माइक्रोस्कोपी (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

की खेती<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</emप्रयोगशाला में तीन आयामों में&gt;

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper के साथ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए ओपन-सोर्स एकल कण विश्लेषण

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

लाइव प्राथमिक पपनी में उच्च गति सुपर संकल्प गति माइक्रोस्कोपी के आवेदन

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...