Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Jonas Ries e il laboratorio Ries per aver condiviso i buffer di imaging per l'imaging SMLM. Ringraziamo anche Yumi Kim per il ceppo C. elegans utilizzato in questo protocollo e Abby F. Dernburg per l'anticorpo pollo-anti-HTP-3. Ringraziamo Marko Lampe e Stefan Terjung dell'Advanced Light Microscopy Facility di EMBL Heidelberg per il loro supporto nell'utilizzo del microscopio confocale Olympus iXplore SPIN SR. Questo lavoro è stato sostenuto dal Laboratorio europeo di biologia molecolare e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). Riconosciamo l'accesso e i servizi forniti dal Centro di Imaging presso il Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL IC), generosamente sostenuto dalla Fondazione Boehringer Ingelheim.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

L'organizzazione a scala della SC, che è essenziale per la corretta ricombinazione e segregazione dei cromosomi omologhi, è stata osservata per la prima volta quasi 70 anni fa nella microscopia elettronica 3,4. Mentre l'organizzazione complessiva della SC è facilmente risolvibile al microscopio elettronico, la localizzazione dei singoli componenti all'interno di questo complesso richiede un approccio più mirato. Con la sua larghezza di soli ~ 100 nm, la sottostruttura della SC non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale. Tuttavia, la microscopia a super-risoluzione è diventata un importante motore per nuove scoperte sulla struttura e la funzione del complesso sinaptonemale 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Per facilitare questa ricerca, abbiamo dimostrato una procedura di montaggio che consente di studiare l'architettura della SC all'interno del tessuto gonadico di C. elegans con microscopia SMLM e STED.
Un passo fondamentale per ottimizzare la risoluzione nell'imaging SMLM è la reticolazione diretta del tessuto germinale a un coprivetrino rivestito di poli-L-lisina (fase 4). L'attacco covalente del tessuto al vetrino di copertura è essenziale per ridurre i movimenti all'interno del campione che si tradurrebbero in grandi derive e renderebbero impossibile l'imaging per lunghi periodi di tempo per SMLM. Inoltre, anche un attacco non ottimale che lascia i nuclei contenenti SC a una certa distanza dal vetrino di copertura porta ad un calo significativo della risoluzione ottenibile derivante da aberrazioni sferiche (Figura 4). In alternativa all'attacco covalente qui utilizzato, il tessuto germinale colorato può anche essere immobilizzato tra due vetrini sigillati in una piccola goccia di tampone di imaging19,30. Tuttavia, questo metodo di immobilizzazione riduce notevolmente il volume del tampone di imaging nel campione da 1 mL utilizzato nel protocollo ottimizzato qui a pochi μL, il che comporterà un'acidificazione del tampone di imaging e ridurrà gravemente il tempo per il quale il campione può essere ripreso 38,53,54.
I lunghi tempi di acquisizione sia per la microscopia SMLM che per la microscopia STED limitano l'uso di questi metodi all'imaging di campioni fissati chimicamente. Qui, la fissazione della paraformaldeide assicura che la struttura del SC sia preservata durante la preparazione del campione e l'imaging. Tuttavia, nonostante le precauzioni prese qui per visualizzare il SC all'interno di tessuto intatto, la struttura risultante della SC dopo la fissazione non è necessariamente identica alla struttura nel suo stato nativo all'interno di un organismo vivente. Inoltre, poiché una singola immagine del SC fisso rappresenta una singola "istantanea" della struttura biologica, questo approccio rimane cieco alla dinamica della struttura nativa in vivo.
Tuttavia, le informazioni sulla dinamica e la variabilità delle strutture macromolecolari possono essere ottenute anche acquisendo non una singola ma molte "istantanee". Mentre questo approccio può risolvere i cambiamenti nella struttura del SC durante il pachitene19, ci sono diversi fattori che limitano il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione preparato utilizzando questo protocollo. In primo luogo, le elevate potenze laser utilizzate durante l'acquisizione delle immagini portano allo sbiancamento permanente dei fluorofori e precludono l'imaging di regioni adiacenti di interesse o piani z multipli, riducendo così significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione. In secondo luogo, la densità del campione/tessuto sul vetrino preparato con questo metodo è bassa, il che limita significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo vetrino. La bassa densità del campione vieta anche l'uso di pipeline di acquisizione automatica delle immagini che hanno contribuito a far luce su altre questioni biologiche 34,55,56,57,58,59. Tuttavia, la densità del campione può essere leggermente aumentata da un utente esperto.
Il protocollo qui presentato è ottimizzato per ottenere un'elevata densità di etichettatura necessaria per ottenere una risoluzione ottimale in SMLM35. Mentre i protocolli precedenti attaccano covalentemente il tessuto al vetrino prima dell'immunocolorazione16, questo nuovo protocollo collega il tessuto al vetrino solo dopo che i campioni sono stati colorati in soluzione. Questa modifica consente agli anticorpi utilizzati per l'immunomarcatura di accedere liberamente al tessuto da tutti i lati, mentre l'attaccamento covalente del tessuto al coprislip può impedire agli anticorpi di raggiungere i nuclei più vicini al vetrino, riducendo così il grado di etichettatura. Insieme, le modifiche qui descritte migliorano la risoluzione da 40-50 nm (risoluzione FRC)16 a 30-40 nm (questo protocollo).
È importante sottolineare che, mentre un'alta densità di etichettatura e un'alta concentrazione di anticorpi sono essenziali per SMLM, abbiamo scoperto che migliori immagini di microscopia STED sono ottenute utilizzando concentrazioni di anticorpi più basse (fase 3). Con una risoluzione di decine di nanometri, la dimensione delle molecole utilizzate per etichettare la proteina di interesse diventa sempre più importante. Abbiamo quindi impiegato frammenti F(ab')2 che sono la metà delle dimensioni degli anticorpi a lunghezza intera. Il miglioramento del contrasto locale dovuto ad una sorgente di segnale più piccola, e quindi la risoluzione ottenuta da questa modifica rispetto all'utilizzo di anticorpi secondari full-length, ha permesso la risoluzione dei due C-termini di SYP-5 all'interno della regione centrale da parte di TauSTED, che non sono risolti da STED convenzionali utilizzando anticorpi full-length (16 e dati non mostrati). Prevediamo che questo protocollo ottimizzato per l'imaging di SC in linee germinali intatte di C. eleganfaciliterà lo studio della relazione struttura-funzione della SC durante la meiosi.

Ridurre il numero di cromosomi della metà durante la meiosi è la chiave per generare una progenie sana negli organismi che si riproducono sessualmente. Per ottenere questa riduzione del numero di cromosomi, i cromosomi omologhi devono accoppiarsi e segregare durante la meiosi I. Per garantire l'accurata segregazione dei cromosomi omologhi, le cellule germinali subiscono una profase I estesa, durante la quale i cromosomi omologhi si accoppiano, sinapsi e si ricombinano per generare collegamenti fisici tra omologhi1. La SC è emersa come la struttura centrale che è la chiave per regolare la corretta progressione attraverso la profase meiotica2.
La SC è un complesso la cui struttura generale è evolutivamente conservata, anche se c'è poca omologia tra le sue componenti proteiche. La SC è stata identificata per la prima volta nelle micrografie elettroniche come una struttura tripartita, simile a una scala, costituita da due elementi laterali o assi, una regione centrale formata da filamenti trasversali e un elemento centrale 3,4. Determinare l'organizzazione dei singoli componenti all'interno del complesso è la chiave per far progredire la nostra comprensione del ruolo del SC durante la profase meiotica.
L'organismo modello C. elegans è ideale per studiare la struttura e la funzione della SC poiché le sue linee germinali contengono un gran numero di nuclei meiotici con SC 5 completamente assemblati. Studi genetici e biochimici hanno rivelato che gli assi cromosomici sono formati da tre distinti complessi di coesina6,7 e quattro proteine del dominio HORMA chiamate HTP-1/2/3 e HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans. Nella regione centrale del SC, sei proteine contenenti domini a spirale sono state identificate fino ad oggi 12,13,14,15,16,17. Per colmare la distanza tra i due assi, SYP-1, -5 e -6 dimerizzano in modo testa a testa (Figura 1), mentre tre proteine aggiuntive stabilizzano la loro interazione nell'elemento centrale16,17,18,19.
Ottenere informazioni dettagliate sull'organizzazione di queste proteine è essenziale per comprendere le molte funzioni della SC durante la meiosi. Poiché la larghezza della regione centrale del SC è solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta mediante microscopia a fluorescenza limitata dalla diffrazione. Tuttavia, la visualizzazione di componenti all'interno di una struttura di queste dimensioni è facilmente realizzabile con la microscopia a super-risoluzione. Infatti, la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia ad espansione 20, la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED)21 e la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM)22,23 sono emerse come strumenti essenziali per studiare l'architettura molecolare della SC tra le specie 16,24,25,26,27,28,29, 30.
Per superare il limite di risoluzione, la microscopia STED si basa sulla sovrapposizione del punto limitato dalla diffrazione della luce di emissione con un raggio a forma di ciambella dal laser STED, che teoricamente restringe la funzione di diffusione del punto fino alle dimensioni molecolari31,32. Tuttavia, la risoluzione che è praticamente raggiungibile da STED all'interno di campioni biologici rimane nell'intervallo di poche decine di nanometri in xy33.
Una risoluzione ancora più elevata nei campioni biologici può essere ottenuta con le tecniche SMLM. SMLM sfrutta le proprietà lampeggianti di specifici fluorofori per risolvere oggetti a livello di sub-diffrazione separando nel tempo i fluorofori spazialmente sovrapposti. Il campione viene quindi ripreso ripetutamente per catturare diversi sottoinsiemi di fluorofori. La posizione dei fluorofori all'interno del campione viene quindi determinata adattando la funzione di diffusione puntuale (PSF) ai segnali ottenuti in tutte le immagini, che possono risolvere strutture fino a 15 nm 23,34.
Nel loro insieme, le immagini localizzate codificano le posizioni di tutti i fluorofori. La risoluzione di SMLM è determinata dalla densità di etichettatura e dalle caratteristiche lampeggianti del fluoroforo. Secondo il criterio di Nyquist-Shannon, è impossibile risolvere in modo affidabile oggetti che sono meno del doppio della distanza media da etichetta a etichetta. Pertanto, è necessaria un'elevata densità di etichettatura per l'imaging ad alta risoluzione. Per la SC in C. elegans, un'alta densità di marcatura può essere ottenuta utilizzando tag epitopi attaccati a siti specifici di proteine endogene utilizzando l'editing del genoma. Le etichette epitopiche possono quindi essere colorate ad alta densità utilizzando anticorpi monoclonali specifici con alta affinità19,30. Allo stesso tempo, il ciclo di accensione dei singoli fluorofori deve essere abbastanza breve da garantire che i fluorofori spazialmente sovrapposti non vengano catturati contemporaneamente35.
A causa di questi due requisiti, risolvere la struttura di grandi complessi macromolecolari come la SC richiede l'imaging di un numero sufficientemente grande di immagini e può quindi richiedere diverse ore. La trappola dei lunghi tempi di imaging è che i campioni tendono ad andare alla deriva a causa del movimento dello stadio o di piccole correnti all'interno del buffer del campione; Anche piccoli movimenti dell'ordine di 10 nm sono dannosi alla risoluzione nm e devono essere corretti. Tuttavia, i metodi di correzione della deriva comunemente usati non sono abbastanza robusti da sovrapporre accuratamente le immagini di due canali ripresi in sequenza36. Questo è problematico perché le domande biologiche spesso richiedono una rilevazione precisa e la localizzazione di più bersagli all'interno dello stesso campione. Per aggirare questi problemi, sono stati sviluppati metodi come l'imaging raziometrico. L'imaging raziometrico consente l'imaging simultaneo di più fluorofori con spettri di eccitazione ed emissione sovrapposti, con una successiva assegnazione di ciascun segnale rilevato al rispettivo fluoroforo in base al rapporto di intensità in canali spettralmente distinti37,38.
Inoltre, lo studio dell'organizzazione di complessi macromolecolari come la SC richiede informazioni tridimensionali (3D). Per ottenere una super-risoluzione in tre dimensioni (3D-SMLM), una lente cilindrica è incorporata nel percorso ottico della luce emessa che distorce la forma della PSF di un fluoroforo a seconda della sua distanza dal piano focale. Quindi, la posizione precisa di un fluoroforo nel piano z può essere estrapolata analizzando la forma del suo segnale di emissione35,39. La combinazione di questi progressi in SMLM consente l'imaging dell'organizzazione 3D di complessi macromolecolari, incluso il SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Durante la meiosi, i cromosomi omologhi devono riconoscersi e aderire l'uno all'altro per consentire la loro corretta segregazione. Uno degli eventi chiave che assicura l'interazione dei cromosomi omologhi è l'assemblaggio del complesso sinaptonemale (SC) nella profase meiotica I. Anche se c'è poca omologia di sequenza tra i componenti proteici all'interno della SC tra le diverse specie, la struttura generale della SC è stata altamente conservata durante l'evoluzione. Nelle micrografie elettroniche, la SC appare come una struttura tripartita, simile a una scala, composta da elementi laterali o assi, filamenti trasversali e un elemento centrale. 
Tuttavia, identificare con precisione la localizzazione dei singoli componenti all'interno del complesso mediante microscopia elettronica per determinare la struttura molecolare della SC rimane difficile. Al contrario, la microscopia a fluorescenza consente l'identificazione di singoli componenti proteici all'interno del complesso. Tuttavia, poiché l'SC è largo solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale limitata dalla diffrazione. Pertanto, la determinazione dell'architettura molecolare della SC richiede tecniche di microscopia ottica a super-risoluzione come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED) o la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM). 
Per mantenere la struttura e le interazioni dei singoli componenti all'interno della SC, è importante osservare il complesso in un ambiente vicino al suo ambiente nativo nelle cellule germinali. Pertanto, dimostriamo un protocollo di immunoistochimica e imaging che consente lo studio della sottostruttura della SC in tessuto germinale intatto ed estruso di Caenorhabditis elegans con microscopia SMLM e STED. Il fissaggio diretto del tessuto al vetrino riduce il movimento dei campioni durante l'imaging e riduce al minimo le aberrazioni nel campione per ottenere l'alta risoluzione necessaria per visualizzare la sottostruttura del SC nel suo contesto biologico.

Per visualizzare la SC all'interno del tessuto germinale di C. elegans mediante SMLM, abbiamo impiegato 3D-SMLM raziometrico a 2 colori per localizzare HTP-3, un componente degli assi cromosomici, e il C-terminale del filamento trasversale SYP-5 etichettato endogenamente con un tag emoagglutinina (HA). La posizione di entrambe le proteine all'interno della SC di C. elegans è stata precedentemente determinata da altri studi16,30.
Per ridurre al minimo la diffusione della luce e le aberrazioni ottiche inerenti ai campioni biologici spessi, abbiamo ripreso la sezione z più in basso dei nuclei meiotici che contengono gli SC (Figura 3, linee gialle). Per ogni immagine acquisita, la posizione dello stadio piezoelettrico del piano di imaging è stata contrassegnata rispetto alla posizione dello stadio piezoelettrico quando l'obiettivo è stato focalizzato sulla vetrina. Ciò ha permesso il calcolo della distanza piezoelettrica dal coprifoglio. I campioni montati con successo sono fissati stabilmente vicino al vetrino di copertura e mantengono la forma gonade (cioè, il tessuto non viene schiacciato tra i due vetrini di copertura durante la fase di postfissazione). La qualità del montaggio del campione può essere facilmente valutata al microscopio stereoscopico poiché le gonadi ben fissate non mostrano alcun movimento in soluzione (punto 4.2.6). Tuttavia, a causa della stocasticità del processo di montaggio, il tessuto gonadico non sarà necessariamente disposto completamente piatto sul vetrino. Pertanto, il piano inferiore dei nuclei contenenti SC può essere trovato a distanze variabili rispetto al coprivetrino all'interno della stessa gonade.
Per illustrare come la risoluzione cambia a seconda dell'attacco del tessuto al vetrino, abbiamo acquisito immagini a diverse distanze piezoelettriche dal vetrino. Per valutare la qualità di una singola immagine, sono state calcolate le curve di correlazione dell'anello di Fourier (FRC)50,51 e la risoluzione è stata determinata utilizzando il plugin FRCResolution all'interno del software SMAP48. Due nuclei rappresentativi estratti da due immagini 3D-SMLM separate prese a distanze diverse dal coprivetrino sono mostrati nella Figura 4. Nelle SC situate vicino al coprivetrino, gli assi cromosomici e il C-terminale di SYP-5::HA sono ben risolti in tutte e tre le dimensioni (Figura 4A, 0,8 μm dal coprifoglio). Per risolvere due strutture separate da una data distanza, la risoluzione FRC ottenuta deve generalmente essere inferiore alla metà di questa distanza nella risoluzione assiale.
Per separare lateralmente le stesse strutture, è necessario ottenere valori di risoluzione FRC ancora più piccoli. Infatti, nei campioni che si trovano in prossimità del coverslip, la risoluzione FRC è di 38 nm per il canale AlexaFluor 647 e 34 nm per il canale CF680, e quindi ben al di sotto della distanza prevista di 84 nm tra i termini C di SYP-516. Questa risoluzione risolve quindi prontamente l'organizzazione del CS non solo in vista frontale ma anche laterale (Figura 4B i,ii). Al contrario, la risoluzione si deteriora negli SC situati a una distanza di 5 μm dal vetrino di copertura a causa della diffusione della luce e delle aberrazioni sferiche (Figura 4B). Le risoluzioni FRC a questa distanza scendono a 47 nm (AlexaFluor 647) e 41 nm (CF680), che non possono risolvere completamente il C-termini di SYP-5. Poiché le aberrazioni ottiche compromettono la risoluzione laterale in modo più grave rispetto alla risoluzione assiale, le bande HTP-3 e SYP-5 non sono più chiaramente risolte nella sezione trasversale della vista laterale nei campioni situati a una distanza di 5 μm dal vetrino di copertura (Figura 4B ii). Il confronto della risoluzione FRC delle immagini acquisite a diverse distanze piezoelettriche dal coprivetrino ha rivelato che il tessuto ripreso non deve trovarsi più di 2 μm dal coprivetrino (Figura 5). Questo risultato evidenzia l'importanza della corretta esecuzione della fase di postfissazione, durante la quale il tessuto deve essere reticolato con successo al rivestimento in poli-L-lisina del vetrino.
Per dimostrare la risoluzione ottenibile con un'altra tecnica di super-risoluzione, abbiamo anche ripreso SC in tessuto germinale intatto fisso con microscopia TauSTED. La Figura 6A mostra le immagini TauSTED con la risoluzione più alta e più bassa raggiunta nell'ambito di questo studio, come stimato dai profili lineari del SC in vista frontale (Figura 6B). In entrambi i nuclei, abbiamo potuto risolvere le due bande di localizzazione di HTP-3 negli assi cromosomici e i C-termini di SYP-5 nella regione centrale, dimostrando che la risoluzione ottenibile in TauSTED utilizzando questo protocollo ottimizzato è inferiore a 84 nm. In condizioni ottimali (Figura 6A, in alto), abbiamo potuto risolvere i C-termini in viste leggermente inclinate della SC che erano separate da soli 50 nm (Figura 6A, rettangolo giallo e 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> Figura 1: Schema dell'organizzazione del complesso sinaptonemale in Caenorhabditis elegans. Il fumetto mostra una struttura semplificata della SC in C. elegans che collega due cromosomi omologhi (grigio). La struttura è mostrata in viste frontali, laterali e trasversali. Gli assi cromosomici sono visualizzati come barre rosse mentre i filamenti trasversali sono mostrati in ciano. Le proteine del filamento trasversale (SYP-1, 5, 6 in C. elegans) sono orientate testa a testa (grafica ciano a sfera a bastone) nella regione centrale per colmare la distanza tra i due assi. Sono indicate le distanze previste tra gli assi e i termini C dei filamenti trasversali. Abbreviazione: SC = complesso sinaptonemale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> Figura 2: Illustrazione della preparazione del campione utilizzata nello studio . (A) I giovani adulti di C. elegans vengono sezionati alla testa o alla coda (linee tratteggiate verdi) e trattati come descritto nel protocollo. (B) I singoli passaggi del metodo sono indicati con grafici collegati a frecce grigie. Abbreviazioni: STED = esaurimento delle emissioni stimolate; SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> Figura 3: Posizione della sezione di tessuto che può essere osservata mediante microscopia di localizzazione di una singola molecola. MIP di un'immagine confocale del disco rotante di un'intera gonade di C. elegans. Il tessuto è stato colorato per HTP-3 e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA), e il segnale combinato è mostrato in grigio. Le singole immagini confocali sono state cucite utilizzando il plugin52 delle Fiji per creare un'immagine dell'intera gonade. L'inserto mostra una vista xy del piano z più in basso contenente gli SC. La localizzazione di questo piano è mostrata in viste ortogonali della sezione di tessuto indicate da un rettangolo nell'immagine MIP della gonade (linee gialle). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: MIP = proiezione di intensità massima; SCs = complessi sinaptonemali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> Figura 4: Microscopia di localizzazione a singola molecola di HTP-3 e C-termini di SYP-5. (A,B) A sinistra: immagini SMLM che mostrano nuclei di pachitene colorati per HTP-3 (rosso) e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA, ciano) (barra di scala = 1 μm). Centro: Immagini ingrandite delle regioni di interesse indicate in A e B con corrispondenti viste in sezione trasversale visualizzate sotto ogni immagine (i, ii; barra di scala = 100 nm). I tratti della SC all'interno delle immagini ingrandite vengono ruotati per orientare gli assi cromosomici parallelamente all'asse y. A destra: Rappresentazione grafica della localizzazione delle proteine di interesse all'interno del SC che rappresenta l'orientamento della SC nelle regioni ingrandite visualizzate al centro della figura. Abbreviazioni: SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; SC = complesso sinaptonemale. I dati grezzi per ricostruire le immagini SMLM sono disponibili attraverso il database BioStudies60 (ID adesione: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> Figura 5: La risoluzione di correlazione dell'anello di Fourier delle immagini al microscopio di localizzazione di singole molecole dipende dalla distanza del piano z ripreso dal piano del vetrino. Le linee colorate mostrano le curve FRC delle immagini acquisite a diverse distanze (come raffigurato dalla barra dei colori) dalla copertina. La soglia di 1/7 utilizzata per determinare la risoluzione FRC è indicata da una linea orizzontale nera. Gli inserti mostrano la dipendenza della risoluzione FRC dalla distanza piezoelettrica dal coprifoglio. Il plottaggio è stato eseguito da uno script R scritto su misura (versione 4.1.2, file supplementare 1) in cui le curve originali sono state smussate con funzioni del pacchetto "ggplot2". Abbreviazioni: FRC = correlazione dell'anello di Fourier; SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; SC = complesso sinaptonemale. I dati per le curve FRC e i dati SMLM sono disponibili attraverso il database BioStudies60 (ID adesione: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> Figura 6: La microscopia a deplezione ad emissione stimolata potenziata da informazioni basate sulla vita di fluorescenza (TauSTED) risolve due bande di localizzazione sia per HTP-3 che per il C-terminale di SYP-5. (A) Due immagini rappresentative di TauSTED mostrano nuclei di pachitene colorati per HTP-3 (rosso) e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA, ciano) con definizione strutturale superiore (superiore) e inferiore (inferiore) (barra di scala = 1 μm). I rettangoli segnano le regioni con i termini C risolti di SYP-5 in frontale (bianco) e una vista leggermente inclinata (giallo) del SC. (B,C) Distribuzione dell'HTP-3 (rosso) e del C-terminale del segnale SYP-5 (ciano) risolto da TauSTED. I profili delle linee delle regioni di interesse che contengono la SC nelle viste frontali (B) o leggermente inclinate (C) sono mostrati come linee complete con intensità normalizzata al valore massimo. I profili di linea sono stati generati utilizzando Fiji ImageJ. Le linee tratteggiate in B mostrano i dati medi per ciascuna proteina. La linea ciano spessa in C corrisponde al profilo della linea con la distanza risolta più breve tra i termini C di SYP-5. Per determinare le distanze tra gli anticorpi che colpiscono proteine specifiche, i profili di linea (n = 9 (B), n = 7 (C)) sono stati dotati di doppi gaussiani utilizzando uno script R scritto su misura (versione 4.1.2, file supplementare 1). La distanza media ± la deviazione standard (B) e l'intervallo con il valore minimo evidenziato in grassetto (C) sono indicati rispettivamente nella parte superiore di ciascun grafico. Abbreviazioni: STED = microscopia a deplezione ad emissione stimolata; SC = complesso sinaptonemale. Le immagini visualizzate e i punti dati dei profili delle linee tracciate sono disponibili attraverso il database BioStudies60 (ID adesione: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizione dei buffer e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Video supplementare 1: Acquisizione microscopica di localizzazione di singole molecole. Video che mostra fluorofori che lampeggiano a una velocità appropriata (vengono mostrati 50 fotogrammi, barra di scala = 5 μm, 20 ms / fotogramma). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
File supplementare 1: script di analisi dei dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

La microscopia a super-risoluzione può fornire una visione dettagliata dell'organizzazione dei componenti all'interno del complesso sinaptonemale nella meiosi. Qui, dimostriamo un protocollo per risolvere le singole proteine del complesso sinaptonemale Caenorhabditis elegans .

Microscopia a super-risoluzione del complesso sinaptonemale all'interno della linea germinale di Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Il complesso sinaptonemale è un componente chiave per la meiosi. Per studiare la sua funzione, dobbiamo anche capire la sua struttura per la quale la microscopia a super risoluzione si è rivelata incredibilmente utile. Abbiamo ottimizzato il nostro protocollo per attaccare stabilmente la gonade di C.elegans immunocolorata a un coprivetrino che aiuta a migliorare la risoluzione fino a 30 nanometri nei tessuti intatti.La progettazione di esperimenti di microscopia di localizzazione di singole molecole, la successiva analisi e anche l'interpretazione dei dati possono essere piuttosto impegnativi e dovrebbero essere meglio impostati insieme a un esperto. A dimostrare la procedura sarà Ivana Cavka, borsista pre-dottorato in laboratorio. L'acquisizione delle immagini al microscopio di localizzazione di singole molecole sarà mostrata anche da Rory Power, ingegnere ottico presso l'MBL Imaging Center.Inizia raccogliendo vermi Caenorhabditis elegans di pari età dalle piastre di agar NGM. Trasferire i vermi in una goccia da 30 microlitri di EBTT su un vetrino. Lavare i vermi con ulteriori 30 microlitri di EBTT.Rimuovere 30 microlitri della soluzione lasciando una goccia da 30 microlitri con i vermi sul vetrino. Utilizzare una lama di bisturi per tagliare le teste dei vermi e / o le code per estrudere la gonade. In una dissezione di successo, il tessuto gonade sarà completamente estruso al di fuori del corpo del verme.Pipettare 30 microlitri della soluzione fissativa nella goccia dei vermi sezionati. Mescolare mediante pipettaggio e lasciare fissare i campioni per un minuto. Interrompere la fissazione esattamente dopo un minuto trasferendo i vermi utilizzando una pipetta da 20 microlitri su una provetta PCR riempita con TBST.Quindi eseguire un lavaggio facendo girare i campioni sezionati su una mini centrifuga da banco. Una volta rimosso il surnatante risospendere i vermi in 200 microlitri di TBST fresco. Dopo il lavaggio finale, risospendere i vermi in 200 microlitri di PBST e posizionare il tubo PCR sul ghiaccio.Girare i campioni sezionati su una mini centrifuga da banco e rimuovere il surnatante. Aggiungere da 50 a 100 microlitri di metanolo freddo, mescolare mediante pipettaggio e lasciare i campioni in metanolo per 30-60 secondi sul ghiaccio. Lavare i campioni due volte con 200 microlitri di PBST.Dopo aver girato i campioni e rimosso il surnatante, aggiungere la soluzione bloccante ai campioni e tenerla a temperatura ambiente per 45-60 minuti. Diluire gli anticorpi primari alle soluzioni di lavoro nel tampone bloccante. Ruotare i campioni su una mini centrifuga da banco, rimuovendo la soluzione bloccante e aggiungere da 30 a 50 microlitri della soluzione anticorpale primaria.Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBST. Diluire i due frammenti Fab prime etichettati per le soluzioni di lavoro nel buffer di blocco.Dopo il terzo lavaggio, ruotare i campioni, rimuovere il surnatante e aggiungere da 30 a 50 microlitri della soluzione anticorpale secondaria. Posizionare il campione in una camera buia e incubare per 30 minuti a due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i campioni tre volte con PBST per cinque a 15 minuti.Ruotare i campioni macchiati e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 microlitri di PBST e trasferire i vermi macchiati su un vetrino. Pipettare da 5,7 a 6,3 microlitri della soluzione post-fissativa su un coprivetrino di poli-l-licina.Pipettare i vermi sezionati nello stesso volume e trasferire nella goccia di fissativo sul coprislip di poli-l-lisina. Coprire il campione con un piccolo vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta da filtro e fissare il campione per tre-cinque minuti in una camera buia.Congelare i campioni posizionandoli su un blocco di alluminio in ghiaccio secco. Dopo almeno 20 minuti, rimuovere il coprislip più piccolo usando un rasoio. Immergere il coperchio in un tubo conico da 50 millilitri contenente PBS ghiacciato o metanolo refrigerato a meno 20 gradi Celsius per circa 10 secondi.Posizionare il coprislip in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti riempita con tampone PBST. Rimuovere il PBST dal pozzetto, aggiungere PBST fresco e lasciare il campione per cinque minuti. Dopo il lavaggio con PBST ancora una volta, lasciare i campioni a quattro gradi Celsius fino all'imaging.Prima dell'imaging, valutare la qualità del montaggio del campione al microscopio stereo. Se si utilizza il portacampioni personalizzato mostrato qui, avvolgere l'anello magnetico con parafilm, quindi preparare un millilitro di tampone di imaging. Prendi un foglietto di copertura dalla piastra a sei pozzetti.Inserirlo nel supporto su misura e fissare il coprislip nel supporto con l'anello magnetico avvolto in parafilm. Pipettare delicatamente il tampone di imaging nella camera creato dall'anello magnetico sulla parte superiore del campione e sigillare la camera utilizzando il parafilm. Per montare il campione, aggiungere una goccia di olio ad immersione all'obiettivo dell'olio pulito.Senza introdurre aria nell'olio ad immersione, posizionare delicatamente il portacampioni con il campione montato sul palco del microscopio. Utilizzando la finestra del plug-in EMU all'interno di MicroManager 2, spostare lo stadio piezoelettrico fino a quando il segnale del laser di blocco della messa a fuoco non viene rilevato sul fotodiodo del quadrante. Acquisire un'immagine del piano focale posteriore a potenza inferiore con un laser a 640 nanometri di eccitazione per confermare l'assenza di bolle d'aria nell'olio di immersione.Localizzare il tessuto gonadico utilizzando l'illuminazione a campo chiaro. Utilizzando un'illuminazione a bassa intensità a 640 nanometri, concentrarsi sulla sezione di tessuto contenente molti complessi sinaptonemali. Procedere ad esporre il campione ad alta irradianza con illuminazione a 640 nanometri per circa 30 secondi fino a raggiungere una velocità di lampeggio appropriata.Acquisite 200.000 fotogrammi con un tempo di esposizione di 20 millisecondi utilizzando lo strumento di acquisizione multidimensionale di MicroManager 2. Nel frattempo, imposta l'attivazione UV utilizzando l'opzione di attivazione del plug-in EMU per mantenere la velocità di lampeggio desiderata. Il piano più basso dei nuclei meiotici contenenti complessi sinaptonemali è stato visualizzato all'interno di una gonade di Caenorhabditis elegans utilizzando la colorazione HTP-3 e SYP-5.Gli assi cromosomici nel C-terminale di SYP-5 HA erano ben risolti in tutte e tre le dimensioni in complessi sinaptonemali situati vicino al coprifoglio. Tuttavia, la risoluzione si deteriora nei complessi sinaptonemali situati a una distanza di cinque micrometri dal vetrino di copertura a causa della diffusione della luce e delle aberrazioni sferiche. Le immagini acquisite a diverse distanze piezoelettriche dal vetrino hanno rivelato che il tessuto ripreso non deve trovarsi a più di due micrometri dal vetrino.Il protocollo di preparazione del campione può essere utilizzato anche con la microscopia TauSTED. Con la preparazione ottimizzata del campione, HTP-3 negli assi cromosomici e i C-termini di SYP-5 nella regione centrale sono stati risolti in vista frontale e vista leggermente inclinata. Per ottenere la migliore risoluzione, le gonadi devono essere strettamente reticolate al coprivetrino per garantire che i complessi sinaptonemali non distano più di due micrometri dal coprivetrino.Utilizziamo questo protocollo non solo per la microscopia di localizzazione di singole molecole, ma anche per la microscopia a deplezione ad emissione stimolata. Può anche essere utile per altre tecniche di microscopia a super risoluzione.

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JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

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