Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Vi takker Jonas Ries og Ries-laboratoriet for deling av bildebuffere for SMLM-bildebehandling. Vi takker også Yumi Kim for C. elegans stammen som brukes i denne protokollen og Abby F. Dernburg for kylling-anti-HTP-3 antistoff. Vi takker Marko Lampe og Stefan Terjung fra Advanced Light Microscopy Facility ved EMBL Heidelberg for deres støtte i bruk av Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av European Molecular Biology Laboratory og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). Vi anerkjenner tilgangen og tjenestene som tilbys av Imaging Centre ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), sjenerøst støttet av Boehringer Ingelheim Foundation.

1. Fremstilling av løsninger og deksler
MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle materialer og reagenser og tabell 1 for sammensetning av løsninger som brukes i denne protokollen.
<ol><li>Poly-L-lysinbelagte deksler<ol><li>Klargjør 0,01 % (w/v) poly-L-lysin (se tabell 1).</li>
		<li>Vask et presisjonsdeksel (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) i etanol i 10-30 minutter. Skyll dekselet med ddH2O for å fjerne etanol, og la dekselet tørke ved romtemperatur.</li>
		<li>Plasma rengjør dekselet med en plasmarenser. MERK: Plasmarengjøring øker hydrofiliteten til dekselet og letter følgende trinn. Hvis en plasmarenser ikke er tilgjengelig, kan dette trinnet hoppes over, selv om dette kan kreve justering av volumet og / eller konsentrasjonen av poly-L-lysinoppløsningen. Denne modifikasjonen er ikke testet.</li>
		<li>Plasser en dråpe (120 μL) på 0,01% (w / v) poly-L-lysin på dekselet. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Etter inkubering, skyll dekselet i ddH2O og tørk ved romtemperatur. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.</li>
	</ol></li>
	<li>F(ab')2 fragmenter konjugert med fluorescerende organiske fargestoffer<ol><li>Legg i følgende rekkefølge til et PCR-rør: 10 μL 0,6-0,7 mg / ml F (ab')2 fragment i PBS, 1 μL 0,1 M NaHCO 3 (pH8,3 ) og 1 μL av 1 mM succinimidyl (NHS) ester reaktiv fluorophore i DMSO (molar forhold på F (ab') 2: fargestoff er ~ 1: 17). Bland godt ved pipettering opp og ned.</li>
		<li>Inkuber i 1 time ved romtemperatur.</li>
		<li>Skill F(ab')2-fragmentet fra det gjenværende frie reaktive fargestoffet ved hjelp av en avsaltingskolonne (7K MWCO) etter produsentens spesifikasjoner. Bruk 1x PBS for likevekt av kolonnen og eluering av det merkede F(ab')2-fragmentet.</li>
		<li>Oppbevar det merkede F(ab')2-fragmentet ved 4 °C i opptil 3 måneder. MERK: Lagringstider på mer enn 3 måneder er ikke testet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Disseksjon og fiksering
MERK: Disseksjons- og fikseringsprosedyrene er modifisert fra tidligere anbefalte prosedyrer16,40 for å oppnå optimale prøver for superoppløsningsmikroskopi.
<ol><li>Disseksjon<ol><li>Plukk aldersmatchede C. elegans-ormer (dyrket ved 20 ° C for denne studien) til en 30 μL dråpe EBTT (1x Eggbuffer41 med 0,2% ikke-ionisk vaskemiddel, tabell 1) på en deksel (22 mm x 22 mm, nr. 1). Plasser dekselet på et glassglass lysbilde for enklere manipulering. Vask med 30 μL EBTT ved pipettering opp og ned flere ganger. Fjern 30 μL av oppløsningen for å etterlate et fall på 30 μL på dekselet. MERK: Små mengder ikke-ionisk vaskemiddel må tilsettes alle løsninger der ormer pipetteres for å forhindre at ormene fester seg til plastspissene.</li>
		<li>Bruk et skalpellblad til å kutte av hodene og/eller halene på ormene for å ekstrudere gonaden (figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fiksering<ol><li>Pipet 30 μL fikseringsmiddel (tabell 1) i dråpen av dissekerte ormer og pipet opp og ned for å blande. MERK: Pipetting opp og ned et par ganger kan bidra til å frigjøre flere gonader.</li>
		<li>Fest i nøyaktig 1 min etter at du har lagt til fikseringsløsningen.</li>
		<li>Stopp fikseringen ved å overføre ormene til et PCR-rør fylt med TBST (tabell 1). Overfør ormene i så lite volum som mulig (~ 15 μL).</li>
		<li>Spinn ned PCR-røret på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s). Fjern supernatanten og vask 2x med 200 μL TBST hver.</li>
		<li>Vask med 200 μL PBST (tabell 1) i 5-10 min. Gjenta trinn 2.1.1 til 2.2.5 for opptil fire prøver mens du holder de dissekerte prøvene på is. MERK: Hvis du behandler mer enn fire prøver, fortsetter du med trinn 2.2.6 til 2.2.7 etter hver fjerde prøve for å sikre at prøvefiksering forblir konsistent på tvers av alle prøver.</li>
		<li>Spinn de dissekerte prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsett 50-100 μL kald metanol (-20 ° C). FORSIKTIG: Metanol er giftig. Bruk verneutstyr og unngå innånding.</li>
		<li>Bland ved pipettering opp og ned og la prøvene ligge i metanol i 30-60 s. Vask prøvene 2x i 200 μL PBST. MERK: Hvis du behandler mer enn fire prøver, fortsett med disseksjonen av de resterende prøvene (trinn 2.1.1 til 2.2.7).</li>
		<li>Vask prøvene en tredje gang med 200 μL PBST.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Antistoff inkubasjoner
<ol><li>Blokkerer<ol><li>Blokker prøvene i 1x blokkeringsløsning (tabell 1) i 45-60 minutter ved romtemperatur. MERK: Inkubasjonstiden kan variere fra 30 minutter ved romtemperatur til flere dager ved 4 °C (testing ble gjort opptil 3 dager).</li>
	</ol></li>
	<li>Primær antistoff løsning<ol><li>Fortynn anti-HTP-3 (kylling42) og anti-HA (mus) antistoffer (eller antistoffene du velger) til arbeidsløsningene (1:250 for SMLM og 1:1,000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x blokkeringsløsning. MERK: Antistoffer som brukes til å merke SMLM-prøver er mer konsentrerte enn for STED-prøver, siden en høyere merketetthet anbefales for SMLM-mikroskopi.</li>
		<li>Spinn prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern blokkeringsbufferen og tilsett 30-50 μL av den primære antistoffløsningen. Inkuber over natten ved 4 °C (foretrukket) eller i 1-2 timer ved romtemperatur.</li>
		<li>Etter inkubering, vask 3 x 5-15 min med PBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Arbeidsløsning av F (ab') 2 fragmenter konjugert til fluorescerende fargestoff<ol><li>Fortynn de merkede F(ab')2-fragmentene (trinn 1.2.4) til arbeidsløsningene (1:100 for SMLM og 1:1 000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x-blokkeringsløsning. MERK: For begge superoppløsningsteknikkene ble tidligere rapporterte fluoroforpar brukt, nemlig AlexaFluor647 / CF680 for SMLM og AlexaFluor594 / Abberior STAR635P for STED. AlexaFluor647 og STAR645P ble brukt til å merke anti-mus (Fab') 2 fragmenter for å målrette C-terminalen til SYP-5, og CF680 / AlexaFluor594-merket anti-kylling (Fab') 2 fragmenter for å målrette HTP-3.</li>
		<li>Spinn prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsett 30-50 μL sekundær antistoffløsning. Inkuber i 30 minutter til 2 timer ved romtemperatur (foretrukket) eller over natten ved 4 °C. Vask 3 x 5-15 min med PBST.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montering av prøver på en coverslip
<ol><li>Postfiksering MERK: Behandle prøver individuelt gjennom trinn 4.1.1-4.2.1.<ol><li>Spinn ned de flekkete prøvene og fjern supernatanten. Tilsett 50 μL PBST0,2 og overfør de flekkete ormene til en 22 mm x 22 mm nr. 1 deksel. MERK: Bruk ferskt PBST 0,2 med0,2 % ikke-ionisk vaskemiddel (tabell 1) for dette trinnet for å forhindre at ormene fester seg til dekselet.</li>
		<li>Pipet 5,7-6,3 μL postfiksativ løsning på en poly-L-lysin coverslip. MERK: Poly-L-lysin deksler lagret ved 4 ° C bør bringes til romtemperatur først.</li>
		<li>Pipet av de dissekerte ormene i samme volum (5,7-6,3 μL) og overfør til fikseringsmiddeldråpen på poly-L-lysindekselet (figur 2B). MERK: I dette og følgende trinn er det svært viktig å beholde det dissekerte vevet i midten av poly-L-lysinbelagt deksel. Dette er spesielt viktig hvis du monterer prøvene i en tilpasset holder for å passe til det spesialbygde SMLM-mikroskopet som brukes her (se trinn 5.1, figur 2B).</li>
		<li>Dekk prøven med et lite deksel (12 mm diameter, figur 2B). Fjern overflødig væske med et lite stykke filterpapir (figur 2B). Fest i 3-5 minutter i et mørkt kammer.</li>
	</ol></li>
	<li>"Fryse-sprekker"<ol><li>Frys prøvene ved å plassere dem på en aluminiumsblokk i tørris (figur 2B). MERK: Aluminiumsblokken må være godt avkjølt i tørrisen før prøvene legges på den. Fortsett med postfiksering av de resterende prøvene (trinn 4.1.1 til 4.2.1). Prøven må være på tørris i minst 20 minutter eller opptil 1 time før neste trinn (4.2.2).</li>
		<li>Fjern den mindre dekslene med en barberhøvel (figur 2B). MERK: For STED går du videre til trinn 5.2.1. For SMLM fortsetter du med trinn 4.2.3.</li>
		<li>Dypp dekselet i et 50 ml konisk rør som inneholder iskald PBS (foretrukket) eller -20 ° C metanol i ca. 10 s. MERK: Temperatur er en svært viktig faktor for dette trinnet. Bruk derfor PBS som er nytint eller oppbevart i et is / etanolbad.</li>
		<li>Plasser dekselet i en brønn på en seksbrønnsplate fylt med PBST-buffer. Fjern PBST fra brønnene og tilsett fersk PBS. La prøvene stå i PBS i 5 min. MERK: Pipet PBS på siden av brønnen for å unngå å skade og løsne prøvene.</li>
		<li>Vask med fersk PBS og la prøvene stå på 4 °C til avbildning. MERK: Prøvene er stabile i opptil 2 uker, men de beste resultatene oppnås hvis prøvene er avbildet innen 2 dager.</li>
		<li>Før avbildning, vurder kvaliteten på prøvemonteringen under et stereomikroskop. MERK: Vellykket monterte germlines er stabilt festet uten merkbar bevegelse i forhold til coverslip. Dårlig festede kimlinjer vil klaffe i bufferløsningen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bildebehandling
<ol><li>Lokaliseringsmikroskopi for enkeltmolekyler MERK: Bilder ble anskaffet på EMBL Imaging Center ved hjelp av et spesialbygd enkeltmolekyllokaliseringsmikroskop som ble konstruert rundt en tilpasset kropp, som tidligere rapportert38,43, med de unike funksjonene som er angitt i Tabell over materialer; Se https://www.embl.org/about/info/imaging-centre<ol><li>Anskaffelse av 3D-perlekalibrering<ol><li>Forbered en presisjonsdeksel (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) med tilhørende 100 nm fluorescerende perler som beskrevet tidligere38,44.</li>
			<li>Plasser kalibreringsprøven fra trinn 5.1.1.1 på en prøveholder.</li>
			<li>Tilsett en dråpe nedsenkningsolje på det rene 100x/1,5 oljemålet og monter kalibreringsprøven på mikroskopet.</li>
			<li>Innenfor MicroManager 2 45,46, spesifiser15-20 posisjoner i kalibreringsprøven.</li>
			<li>I EMU-plugin-vinduet47 setter du opp anskaffelsen av et z-stack-bilde for hver av posisjonene fra trinn 5.1.1.5. MERK: Her gir en sammensatt sylindrisk linse astigmatismen som kreves for 3D-bildebehandling, og 201 z-skiver ble anskaffet for hver posisjon som spenner over området mellom -1 μm til 1 μm, med en økning på 10 nm. En 2 kW/cm2 640 nm laserbelysning ble brukt til 25 ms for hver z-skive.</li>
			<li>Skaff z-stack-bildene av de 100 nm lysrørende perlene gjennom en identisk optisk bane som skal brukes til å hente eksempelbilder i trinn 5.1.11.</li>
			<li>Ved hjelp av superoppløsningsmikroskopianalyseplattformen (SMAP48) genererer du en cspline-modell av den eksperimentelle punktspredningsfunksjonen (PSF) som vil bli brukt til å passe til 3D-SMLM-dataene i trinn 5.1.13.</li>
		</ol></li>
		<li>Klargjør prøveholderen. For den spesialbygde holderen som brukes her som bruker en magnetisk ring for å lage bildekammeret (figur 2B), pakk magnetringen med parafilm. MERK: Alternativt kan et mikroskop lysbilde med en konkav depresjon hulrom brukes til å montere prøver for mikroskoper med lysbilde holdere.</li>
		<li>Klargjør 1 ml bildebuffer44 (tabell 1).</li>
		<li>Ta en coverslip fra trinn 4.2.6 og plasser den i den skreddersydde holderen. Fest dekselet i holderen med den parafilminnpakkede magnetringen (trinn 5.1.2).</li>
		<li>Pipet bildebufferen (trinn 5.1.3) forsiktig i kammeret som er opprettet av magnetringen på toppen av prøven (figur 2B). Forsegl kammeret med et stykke parafilm.</li>
		<li>For å montere prøven, tilsett en dråpe nedsenkningsolje på det rene 100x / 1,5 oljemålet. Uten å føre luft inn i nedsenkningsoljen, plasser prøveholderen forsiktig med den monterte prøven (trinn 5.1.5) på mikroskoptrinnet. MERK: Før du legger prøven på mikroskopet, rengjør bunnen av dekselet med vev og 70% etanol.</li>
		<li>Bruk EMU-plugin-vinduet47 i MicroManager 245,46, flytt piezo-scenen til signalet fra fokuslåslaseren oppdages ved kvadrantfotodioden (QPD). MERK: For å opprettholde et fast fokus over bildetiden, oppnås fokuslåsing ved total intern refleksjon av en nær-infrarød fiberkoblet laser fra dekselet og påfølgende høydefølsom deteksjon på en kvadrantfotodiode (QPD). QPD-signalet ga lukket sløyfekontroll av objektivlinsens piezo-montering.</li>
		<li>Få et bakre fokalplanbilde med en 640 nm eksitasjonslaser med lav effekt (dvs. 1-5%) for å bekrefte fraværet av luftbobler i nedsenkningsoljen. MERK: Fjern prøven fra scenen hvis det oppdages en luftboble. Rengjør bunnen av dekselet og målet, og gjenta trinn 5.1.6-5.1.8. Ellers fortsett å låse fokuset i EMU-programvaren47.</li>
		<li>Lokaliser gonadvevet ved hjelp av brightfield-belysningen. Bruk en lav intensitet 640 nm belysning, fokuser på den delen av vevet som inneholder mange SC-strekker. MERK: Ikke fokuser på strukturer som er mer enn 2 μm fra dekselet. Ikke bruk høyere lasereffekt for å lokalisere prøven, da dette kan gjøre noen fluoroforer til en blinkende tilstand for tidlig. Her ble 1 kW/cm2 brukt i stigende modus med en puls satt til 1000.</li>
		<li>Fortsett å eksponere prøven med 640 nm belysning ved høy bestråling (27 kW/cm2) i ~30 s til en passende blinkehastighet er oppnådd (supplerende video 1).</li>
		<li>Skaff deg 200 000 bilder med en eksponeringstid på 20 ms ved hjelp av det flerdimensjonale innsamlingsverktøyet i MicroManager 245,46.</li>
		<li>I mellomtiden konfigurerer du UV-aktiveringen ved hjelp av aktiveringsalternativet til EMU-plugin38,47 for å opprettholde ønsket blinkefrekvens. MERK: Bruk UV-laseren ved en 3 kW/cm2 bestråling i stigende modus med maksimal pulslengde satt til 10 000.</li>
		<li>Utfør SMLM-bilderekonstruksjon og etterbehandling. MERK: Hvis du vil rekonstruere bilder fra rå SMLM-data, kan du se publiserte metoder. Dataene som presenteres her ble behandlet ved hjelp av programvaren SMAP48,49. Superoppløst bilderekonstruksjon, kanaltildeling, driftkorreksjon og filtrering av lokaliseringer med dårlig lokaliseringspresisjon og et filter med maksimal sannsynlighet ble utført i SMAP48-programvaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi MERK: Bilder ble tatt på det integrerte mikroskopiske systemet STED utstyrt med en hvit lyslaser, en 775 nm pulserende STED-laser og FALCON Fluorescence Lifetime IM-aldringsmodul (Table of Materials) ved EMBL Imaging Centre (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).<ol><li>Plasser en 20 μL dråpe monteringsmedium (materialtabell) på et mikroskopglass. Ta en deksel fra trinn 4.2.2 og plasser prøven forsiktig på lysbildet som vender mot monteringsmediet (figur 2B). MERK: Unngå å innføre luftlommer i monteringsmediet.</li>
		<li>La monteringsmediet herde over natten. MERK: Avbilde prøvene påfølgende dag eller hold dem ved 4 °C til de er avbildning.</li>
		<li>For å montere prøven, tilsett en dråpe nedsenkningsolje på dekselet til prøven fra trinn 5.2.2. Plasser prøven forsiktig på mikroskopstadiet ved hjelp av et 100x / 1,40 oljemål.</li>
		<li>Fokuser på prøven og finn germlinevevet ved hjelp av lysfeltbelysningen.</li>
		<li>Bruk mikroskopprogramvaren til å angi interesseområdet som TauSTED-bildet skal anskaffes for.</li>
		<li>Velg eksitasjonslasere og deres passende kraft som brukes til å opphisse fluoroforene som brukes i prøven. MERK: Her ble 580 nm-laseren med 4% effekt brukt til å avbilde AlexaFluor 594-konjugerte F(ab')2 sekundære antistofffragmenter, og 635 nm ved 3% effekt for å avbilde STAR 635P-konjugerte F(ab')2-fragmenter.</li>
		<li>Bruk mikroskopprogramvaren til å velge en passende STED-uttømmingslasereffekt og sette opp bildedeteksjonen. MERK: Her ble 775 nm STED-uttømmingslasereffekten satt til 40 %. Detektoren ble brukt i tellemodus med en forsterkningsverdi på 10 for fotondeteksjon, med en skannehastighet på 100 Hz og ved en pikselstørrelse på 17 nm. Fire-linjers akkumulering ble brukt til TauSTED-oppkjøp.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfattere oppgir ingen interessekonflikter.

Den stigelignende organisasjonen av SC, som er avgjørende for riktig rekombinasjon og segregering av homologe kromosomer, ble først observert for nesten 70 år siden i elektronmikroskopi 3,4. Mens den overordnede organisasjonen av SC lett løses i elektronmikroskopi, krever lokalisering av individuelle komponenter i dette komplekset en mer målrettet tilnærming. Med sin bredde på bare ~ 100 nm, kan understrukturen til SC ikke løses ved konvensjonell fluorescensmikroskopi. Imidlertid har superoppløsningsmikroskopi blitt en viktig driver for nye funn om strukturen og funksjonen til det synaptonemale komplekset 16,19,24,25,26,27,28,29,30. For å lette denne forskningen har vi demonstrert en monteringsprosedyre som gjør det mulig å studere arkitekturen til SC i C. elegans gonadvev med SMLM og STED-mikroskopi.
Et kritisk skritt for å optimalisere oppløsningen i SMLM-avbildning er direkte kryssbinding av germlinevevet til en poly-L-lysinbelagt deksel (trinn 4). Den kovalente festingen av vevet til dekselet er viktig for å redusere bevegelser i prøven som vil resultere i store drifter og gjøre avbildning over lange perioder for SMLM umulig. I tillegg fører selv et suboptimalt vedlegg som etterlater kjernene som inneholder SCs i avstand fra dekselet, til et betydelig fall i den oppnåelige oppløsningen som følge av sfæriske avvik (figur 4). Alternativt til det kovalente vedlegget som brukes her, kan farget kimlinjevev også immobiliseres mellom to forseglede deksler i en liten dråpe bildebuffer19,30. Imidlertid reduserer denne immobiliseringsmetoden volumet av bildebuffer i prøven sterkt fra 1 ml som brukes i den optimaliserte protokollen her til bare noen få μL, noe som vil resultere i en forsuring av bildebufferen og redusere tiden som prøven kan avbildes 38,53,54 for alvorlig.
Lang innsamlingstid for både SMLM- og STED-mikroskopi begrenser bruken av disse metodene til avbildning av kjemisk faste prøver. Her sikrer paraformaldehydfiksering at strukturen til SC blir bevart under prøvepreparering og avbildning. Til tross for forholdsreglene som er tatt her for å avbilde SC i intakt vev, er den resulterende strukturen til SC etter fiksering ikke nødvendigvis identisk med strukturen i sin opprinnelige tilstand i en levende organisme. Videre, siden et enkelt bilde av den faste SC representerer et enkelt "øyeblikksbilde" av den biologiske strukturen, forblir denne tilnærmingen blind for dynamikken i den opprinnelige strukturen in vivo.
Imidlertid kan informasjon om dynamikken og variabiliteten til makromolekylære strukturer også oppnås ved å skaffe seg ikke bare en enkelt, men mange "øyeblikksbilder". Selv om denne tilnærmingen kan løse endringer i strukturen til SC under pachyten19, er det flere faktorer som begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve utarbeidet ved hjelp av denne protokollen. For det første fører de høye laserkreftene som brukes under bildeoppkjøp til permanent bleking av fluoroforene og utelukker avbildning av tilstøtende områder av interesse eller flere z-plan, og reduserer dermed antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve. For det andre er prøven / vevstettheten på dekselet fremstilt ved denne metoden lav, noe som betydelig begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt coverslip. Den lave prøvetettheten forbyr også bruk av automatiserte bildeinnsamlingsrørledninger som bidro til å kaste lys over andre biologiske spørsmål 34,55,56,57,58,59. Prøvetettheten kan imidlertid økes litt av en erfaren bruker.
Protokollen som presenteres her er optimalisert for å oppnå en høy merketetthet som er nødvendig for å oppnå optimal oppløsning i SMLM35. Mens tidligere protokoller kovalent fester vevet til dekselet før immunostaining16, kryssbinder denne nye protokollen vevet til dekselet først etter at prøvene ble farget i oppløsning. Denne modifikasjonen gjør at antistoffene som brukes til immunmerking, fritt kan få tilgang til vevet fra alle sider, mens den kovalente festingen av vevet til dekselet kan begrense antistoffer fra å nå kjernene nærmest dekselet, og dermed redusere graden av merking. Sammen forbedrer modifikasjonene beskrevet her oppløsningen fra 40-50 nm (FRC-oppløsning) 16 til 30-40 nm (denne protokollen).
Det er viktig at mens en høy merketetthet og en høy konsentrasjon av antistoffer er avgjørende for SMLM, fant vi at bedre STED-mikroskopibilder oppnås ved bruk av lavere antistoffkonsentrasjoner (trinn 3). Ved en oppløsning på titalls nanometer blir størrelsen på molekylene som brukes til å merke proteinet av interesse stadig viktigere. Vi benyttet derfor F(ab')2-fragmenter som er halvparten så store som antistoffer i full lengde. Forbedringen i lokal kontrast på grunn av en mindre signalkilde, og derfor oppløsning oppnådd ved denne modifikasjonen sammenlignet med bruk av sekundære antistoffer i full lengde, tillot oppløsning av de to C-termini av SYP-5 i den sentrale regionen av TauSTED, som ikke løses ved konvensjonell STED ved bruk av fulllengde antistoffer (16 og data ikke vist). Vi forventer at denne optimaliserte protokollen for avbildning av SC-er i intakte C. eleganskimlinjer vil gjøre det lettere å undersøke struktur-funksjonsforholdet mellom SC under meiose.

Å redusere antall kromosomer med halvparten under meiose er nøkkelen til å generere sunne avkom i seksuelt reproduserende organismer. For å oppnå denne reduksjonen i kromosomantall, må homologe kromosomer parre og segregere under meiose I. For å sikre nøyaktig segregering av homologe kromosomer, gjennomgår kimceller en utvidet profase I, hvor homologe kromosomer parrer, synapser og rekombinerer for å generere fysiske koblinger mellom homologer1. SC har dukket opp som den sentrale strukturen som er nøkkelen til å regulere riktig progresjon gjennom meiotisk profase2.
SC er et kompleks hvis generelle struktur er evolusjonært bevart, selv om det er lite homologi mellom proteinkomponentene. SC ble først identifisert i elektronmikrografier som en tredelt, stigelignende struktur bestående av to laterale elementer eller akser, en sentral region dannet av tverrgående filamenter og et sentralt element 3,4. Å bestemme organisasjonen av individuelle komponenter i komplekset er nøkkelen til å fremme vår forståelse av SCs rolle under meiotisk profase.
Modellorganismen C. elegans er ideell til å studere strukturen og funksjonen til SC siden dens kimlinjer inneholder et stort antall meiotiske kjerner med fullt montert SCs5. Genetiske og biokjemiske studier har vist at kromosomaksene dannes av tre forskjellige kohesinkomplekser6,7 og fire HORMA-domeneproteiner kalt HTP-1/2/3 og HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den sentrale regionen av SC har seks proteiner som inneholder spoledomener blitt identifisert til dags dato 12,13,14,15,16,17. For å bygge bro over avstanden mellom de to aksene, dimeriserer SYP-1, -5 og -6 på en head-to-head måte (figur 1), mens tre ekstra proteiner stabiliserer samspillet i det sentrale elementet16,17,18,19.
Å få detaljert innsikt i organiseringen av disse proteinene er avgjørende for å forstå SCs mange funksjoner under meiose. Siden bredden på den sentrale regionen av SC er bare ~ 100 nm, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset fluorescensmikroskopi. Imidlertid er visualisering av komponenter i en struktur av denne størrelsen lett oppnåelig ved superoppløsningsmikroskopi. Faktisk har strukturert belysningsmikroskopi (SIM), ekspansjonsmikroskopi 20, STIMUTTØMMING (STED) mikroskopi 21 og enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 dukket opp som viktige verktøy for å studere den molekylære arkitekturen til SC på tvers av arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.
For å overvinne oppløsningsgrensen er STED-mikroskopi avhengig av å overlegge det diffraksjonsbegrensede stedet for utslippslyset med en smultringformet stråle fra STED-laseren, som teoretisk innsnevrer punktspredningsfunksjonen ned til molekylære dimensjoner31,32. Imidlertid forblir oppløsningen som praktisk kan oppnås av STED innen biologiske prøver i området noen få titalls nanometer i xy33.
Enda høyere oppløsning i biologiske prøver kan oppnås med SMLM-teknikker. SMLM utnytter de blinkende egenskapene til spesifikke fluoroforer for å løse objekter på subdiffraksjonsnivå ved å separere romlig overlappende fluoroforer i tide. Prøven blir deretter avbildet gjentatte ganger for å fange forskjellige undergrupper av fluoroforer. Plasseringen av fluoroforene i prøven bestemmes deretter ved å tilpasse punktspredningsfunksjonen (PSF) til de oppnådde signalene på tvers av alle bilder, som kan løse strukturer ned til 15 nm23,34.
Samlet koder de lokaliserte bildene posisjonene til alle fluoroforene. Oppløsningen til SMLM bestemmes av merketettheten og de blinkende egenskapene til fluoroforen. I henhold til Nyquist-Shannon-kriteriet er det umulig å løse objekter som er mindre enn dobbelt så mange som gjennomsnittlig etikett-til-etikett-avstand. Dermed er det nødvendig med en høy merketetthet for høyoppløselig bildebehandling. For SC i C. elegans kan en høy merkingstetthet oppnås ved å bruke epitopkoder festet til bestemte steder av endogene proteiner ved hjelp av genomredigering. Epitopmerkene kan deretter farges med høy tetthet ved bruk av spesifikke monoklonale antistoffer med høy affinitet19,30. Samtidig må syklusen til individuelle fluoroforer være kort nok til å sikre at romlig overlappende fluoroforer ikke fanges opp samtidig35.
På grunn av disse to kravene krever løsning av strukturen til store makromolekylære komplekser som SC å avbilde et tilstrekkelig stort antall bilder, og kan dermed ta flere timer. Fallgruven med lange bildetider er at prøver har en tendens til å drive på grunn av bevegelse av scenen eller små strømmer i prøvebufferen; Selv små bevegelser i størrelsesorden 10 nm er skadelige ved NM-oppløsning og må korrigeres for. Avdriftskorreksjonsmetodene som vanligvis brukes, er imidlertid ikke robuste nok til å nøyaktig legge over bilder av to kanaler som er avbildet sekvensielt36. Dette er problematisk fordi biologiske spørsmål ofte ber om presis deteksjon og lokalisering av flere mål innenfor samme prøve. For å omgå disse problemene har metoder som ratiometrisk avbildning blitt utviklet. Ratiometrisk avbildning muliggjør samtidig avbildning av flere fluoroforer med overlappende eksitasjons- og emisjonsspektra, med en påfølgende tildeling av hvert detektert signal til dets respektive fluorofor basert på forholdet mellom intensiteter i spektralt distinkte kanaler37,38.
I tillegg krever studier av organisering av makromolekylære komplekser som SC tredimensjonal (3D) informasjon. For å oppnå superoppløsning i tre dimensjoner (3D-SMLM), er en sylindrisk linse innlemmet i den optiske banen til det utstrålede lyset som forvrenger formen på PSF av en fluorofor, avhengig av avstanden fra fokalplanet. Derfor kan den nøyaktige posisjonen til en fluorofor i z-planet ekstrapoleres ved å analysere formen på utslippssignalet35,39. Kombinere disse fremskrittene i SMLM muliggjør avbildning av 3D-organisasjonen av makromolekylære komplekser, inkludert SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Under meiose må homologe kromosomer gjenkjenne og holde seg til hverandre for å tillate riktig segregering. En av de viktigste hendelsene som sikrer samspillet mellom homologe kromosomer er samlingen av det synaptonemale komplekset (SC) i meiotisk profase I. Selv om det er lite sekvens homologi mellom proteinkomponenter i SC blant forskjellige arter, har den generelle strukturen til SC blitt svært bevart under evolusjonen. I elektronmikrografier fremstår SC som en tredelt, stigelignende struktur sammensatt av laterale elementer eller akser, tverrgående filamenter og et sentralt element. 
Imidlertid er det fortsatt utfordrende å nøyaktig identifisere lokaliseringen av individuelle komponenter i komplekset ved elektronmikroskopi for å bestemme molekylstrukturen til SC. I motsetning til dette tillater fluorescensmikroskopi identifisering av individuelle proteinkomponenter i komplekset. Men siden SC bare er ~ 100 nm bred, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset konvensjonell fluorescensmikroskopi. Bestemmelse av den molekylære arkitekturen til SC krever således superoppløsningslysmikroskopiteknikker som strukturert belysningsmikroskopi (SIM), STIMULERT utslippsuttømming (STED) mikroskopi eller enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM). 
For å opprettholde strukturen og samspillet mellom individuelle komponenter i SC, er det viktig å observere komplekset i et miljø som er nær sitt opprinnelige miljø i kimcellene. Derfor demonstrerer vi en immunhistokjemi- og avbildningsprotokoll som gjør det mulig å studere substrukturen til SC i intakt, ekstrudert Caenorhabditis elegans germline vev med SMLM og STED-mikroskopi. Direkte festing av vevet til dekselet reduserer bevegelsen av prøvene under avbildning og minimerer avvik i prøven for å oppnå den høye oppløsningen som er nødvendig for å visualisere understrukturen til SC i sin biologiske sammenheng.

For å avbilde SC i C. elegans germline vev av SMLM, har vi ansatt 2-fargeforholdmetrisk 3D-SMLM for å lokalisere HTP-3, en komponent i kromosomaksene, og C-terminalen til det tverrgående filamentet SYP-5 endogent merket med en hemagglutinin (HA) tag. Plasseringen av begge proteinene i SC av C. elegans ble tidligere bestemt av andre studier16,30.
For å minimere lysspredning og optiske avvik som er forbundet med tykke biologiske prøver, avbildet vi den nederste delen av meiotiske kjerner som inneholder SCs (figur 3, gule linjer). For hvert ervervet bilde ble piezo-sceneposisjonen til bildeplanet markert i forhold til piezo-sceneposisjonen når målet var fokusert på dekselet. Dette tillot beregning av piezoavstanden fra dekselet. Vellykket monterte prøver er stabilt festet nær dekselet og beholder gonadformen (dvs. vevet knuses ikke mellom de to dekselene under postfikseringstrinnet). Kvaliteten på prøvemonteringen kan lett vurderes under et stereomikroskop siden godt festede gonader ikke viser noen bevegelse i løsning (trinn 4.2.6). Likevel, på grunn av stokastisiteten til monteringsprosessen, vil gonadvevet ikke nødvendigvis bli lagt helt flatt på dekselet. Derfor kan bunnplanet til kjernene som inneholder SCs bli funnet i varierende avstander i forhold til dekselet i samme gonade.
For å illustrere hvordan oppløsningen endres avhengig av at vevet festes til omslaget, tok vi bilder på forskjellige piezoavstander til omslaget. For å vurdere kvaliteten på et individuelt bilde ble Fourier-ringkorrelasjonskurver (FRC)50,51 beregnet, og oppløsningen ble bestemt ved hjelp av FRCResolution-plugin i SMAP-programvaren48. To representative kjerner hentet fra to separate 3D-SMLM-bilder tatt i forskjellige avstander til dekselet vises i figur 4. I SC-er som ligger nær dekselet, er kromosomaksene og C-terminalen til SYP-5::HA godt løst i alle tre dimensjonene (figur 4A, 0,8 μm fra dekselet). For å løse to strukturer atskilt med en gitt avstand, må den oppnådde FRC-oppløsningen generelt være mindre enn halvparten av denne avstanden i aksialoppløsningen.
For å skille de samme strukturene sideveis, må enda mindre FRC-oppløsningsverdier oppnås. Faktisk, i prøver som ligger i nærheten av dekselet, er FRC-oppløsningen 38 nm for AlexaFluor 647-kanalen og 34 nm for CF680-kanalen, og dermed godt under forventet avstand på 84 nm mellom C-termini på SYP-516. Denne resolusjonen løser derfor lett organiseringen av SC ikke bare i frontal, men også i lateral visning (figur 4B i, ii). Derimot forverres oppløsningen i SCs plassert i en 5 μm avstand fra dekselet på grunn av lysspredning og sfæriske avvik (figur 4B). FRC-oppløsningene på denne avstanden faller til 47 nm (AlexaFluor 647) og 41 nm (CF680), som ikke fullt ut kan løse C-termini av SYP-5. Siden de optiske avvikene svekker sideoppløsningen mer alvorlig enn den aksiale oppløsningen, er HTP-3- og SYP-5-båndene ikke lenger klart løst i tverrsnittet av sidevisningen i prøver som ligger i en 5 μm avstand fra dekselet (figur 4B ii). Sammenligning av FRC-oppløsningen til bilder tatt på forskjellige piezoavstander fra dekselet viste at det avbildede vevet ikke skulle være lenger enn 2 μm fra dekselet (figur 5). Dette resultatet fremhever viktigheten av korrekt utførelse av postfikseringstrinnet, hvor vevet må være vellykket tverrbundet til poly-L-lysinbelegget på dekselet.
For å demonstrere den oppnåelige oppløsningen med en annen superoppløsningsteknikk, avbildet vi også SCs i fast intakt germline vev med TauSTED-mikroskopi. Figur 6A viser TauSTED-bilder med høyest og lavest oppløsning oppnådd i denne studien, beregnet ut fra linjeprofilene til SC i frontal visning (figur 6B). I begge kjernene kunne vi løse de to lokaliseringsbåndene av HTP-3 i kromosomaksene og C-termini av SYP-5 i det sentrale området, og demonstrere at oppløsningen som kan oppnås i TauSTED ved hjelp av denne optimaliserte protokollen er under 84 nm. Under optimale forhold (figur 6A, øverst) kunne vi løse C-termini i svakt skråstilte visninger av SC som var atskilt med bare 50 nm (figur 6A, gult rektangel og 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk for organiseringen av det synaptonemale komplekset i Caenorhabditis elegans. Tegneserien viser en forenklet struktur av SC i C. elegans som bygger bro mellom to homologe kromosomer (grå). Strukturen vises i frontale, laterale og tverrsnittsvisninger. Kromosomakser vises som røde søyler mens tverrgående filamenter vises i cyan. Tverrgående filamentproteiner (SYP-1, 5, 6 i C. elegans) er orientert på en head-to-head måte (cyan ball-stick grafikk) i det sentrale området for å bygge bro over avstanden mellom de to aksene. De forventede avstandene mellom akser og C-termini for tverrgående filamenter er angitt. Forkortelse: SC = synaptonemal kompleks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> Figur 2: Illustrasjon av prøvepreparering brukt i studien . (A) Unge C. elegans voksne blir dissekert på hodet eller halen (grønne, stiplede linjer) og behandlet som beskrevet i protokollen. (B) Individuelle trinn i metoden er indikert med grafikk som er forbundet med grå piler. Forkortelser: STED = uttømming av stimulert utslipp; SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; PBS = fosfatbufret saltvann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> Figur 3: Plassering av vevsdelen som kan observeres ved lokalisering av enkeltmolekyler. MIP av en spinnende disk konfokal bilde av en hel mount C. elegans gonad. Vevet ble farget for HTP-3 og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA), og det kombinerte signalet vises i grått. Individuelle konfokale bilder ble sydd ved hjelp av Grid / Collection stitching Fiji plugin52 for å lage et bilde av hele gonaden. Innfellingen viser en xy-visning av det nederste z-planet som inneholder SC-ene. Lokaliseringen av dette planet er vist i ortogonale visninger av vevsseksjonen indikert med et rektangel i MIP-bildet av gonaden (gule linjer). Skala barer = 10 μm. Forkortelser: MIP = maksimal intensitetsprojeksjon; SCs = synaptonemale komplekser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> Figur 4: Enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi av HTP-3 og C-termini av SYP-5. (A,B) Venstre: SMLM-bilder som viser pachytenkjerner farget for HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) (skalalinje = 1 μm). Sentrum: Innzoomede bilder av interesseområder som er angitt i A og B med tilsvarende tverrsnittsvisninger vist under hvert bilde (i, ii; skalalinje = 100 nm). SC-strekningene i innzoomede bilder roteres for å orientere kromosomaksene parallelt med y-aksen. Høyre: Grafisk fremstilling av lokaliseringen av proteiner av interesse i SC som skildrer retningen til SC i de zoomede områdene som vises i midten av figuren. Forkortelser: SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Rådata for å rekonstruere SMLM-bilder er tilgjengelige gjennom BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> Figur 5: Fourier-ringkorrelasjonsoppløsningen av enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopibilder avhenger av avstanden til det avbildede z-planet fra dekselets plan. Fargede linjer viser FRC-kurver med bilder som er anskaffet på forskjellige avstander (som vist på fargelinjen) fra omslagsbildet. 1/7-terskelen som brukes til å bestemme FRC-oppløsningen, indikeres av en svart horisontal linje. Innfelt viser avhengigheten av FRC-oppløsningen på piezo-avstanden fra dekselet. Plotting ble utført av et spesialskrevet R-skript (versjon 4.1.2, Supplementary File 1) der originale kurver ble glattet med funksjoner fra "ggplot2" -pakken. Forkortelser: FRC = Fourier ring korrelasjon; SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Data for FRC-kurver og SMLM-data er tilgjengelige gjennom BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> Figur 6: Stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi forsterket av fluorescens levetidsbasert informasjon (TauSTED) løser to lokaliseringsbånd for både HTP-3 og C-terminalen til SYP-5. (A) To representative TauSTED-bilder viser pachytenkjerner farget for HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) med høyere (øverst) og lavere (nederst) strukturell definisjon (skalalinje = 1 μm). Rektanglene markerer regioner med den oppløste C-termini av SYP-5 i frontal (hvit) og en svakt skråstilt visning (gul) av SC. (B, C) Distribusjon av HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (cyan) signal løst av TauSTED. Linjeprofiler for interesseområder som inneholder SC i frontvisning (B) eller svakt skråstilt (C), vises som hele linjer med intensitet normalisert til maksimumsverdien. Linjeprofiler ble generert ved hjelp av Fiji ImageJ. Stiplede linjer i B viser gjennomsnittlige data for hvert protein. Den tykke cyanlinjen i C tilsvarer linjeprofilen med kortest oppløst avstand mellom C-terminalen til SYP-5. For å bestemme avstandene mellom antistoffene rettet mot spesifikke proteiner, ble linjeprofilene (n = 9 (B), n = 7 (C)) utstyrt med doble gaussere ved hjelp av et spesialskrevet R-skript (versjon 4.1.2, tilleggsfil 1). Gjennomsnittlig avstand ± standardavvik (B) og området med minimumsverdi uthevet i fet skrift (C) er angitt på toppen av hver graf, henholdsvis. Forkortelser: STED = stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Viste bilder og datapunkter av plottede linjeprofiler er tilgjengelige via BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: Sammensetning av buffere og løsninger som brukes i denne protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende video 1: Oppkjøp av lokaliseringsmikroskopi for enkeltmolekyler. Video som viser fluoroforer som blinker med riktig hastighet (50 bilder vises, skaleringslinje = 5 μm, 20 ms/bilde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Tilleggsfil 1: Dataanalyseskript. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superoppløsningsmikroskopi kan gi et detaljert innblikk i organiseringen av komponenter i det synaptonemale komplekset i meiose. Her demonstrerer vi en protokoll for å løse individuelle proteiner i Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleks.

Superoppløsningsmikroskopi av det synaptonemale komplekset i Caenorhabditis elegans germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Det synaptonemale komplekset er en nøkkelkomponent for meiose. For å studere funksjonen må vi også forstå strukturen som superoppløsningsmikroskopi har vist seg å være utrolig nyttig for. Vi har optimalisert protokollen vår for å stabilt feste immunostained C.elegans gonad til en coverslip som bidrar til å forbedre oppløsningen ned til 30 nanometer i intakt vev.Utformingen av enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopieksperimenter, den påfølgende analysen, og også tolkningen av dataene kan være ganske utfordrende og bør best settes opp sammen med en ekspert. Ivana Cavka, en predoktor i laboratoriet, demonstrerer prosedyren og vil være Ivana Cavka, en predoktor i laboratoriet. Oppkjøpet av enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopibildene vil også bli vist av Rory Power, en optisk ingeniør ved MBL Imaging Center.Begynn med å plukke aldersmatchede Caenorhabditis elegans ormer fra NGM agar plater. Overfør ormene til en 30 mikroliter dråpe EBTT på en coverslip. Vask ormene med ytterligere 30 mikroliter EBTT.Fjern 30 mikroliter av løsningen og la en 30 mikroliter dråpe med ormene på dekselet. Bruk et skalpellblad til å kutte av ormenes hoder og/eller halene for å ekstrudere gonaden. I en vellykket disseksjon vil gonadvev bli fullstendig ekstrudert utenfor ormlegemet.Pipette 30 mikroliter av fikseringsløsningen i dråpen av dissekerte ormer. Bland ved pipettering og la prøvene fikse i ett minutt. Stopp fikseringen nøyaktig etter ett minutt ved å overføre ormene ved hjelp av en 20 mikroliter pipette på et PCR-rør fylt med TBST.Utfør deretter en vask ved å spinne de dissekerte prøvene på en mini benchtop sentrifuge. Når supernatanten er fjernet, resuspender ormene i 200 mikroliter fersk TBST. Etter den endelige vasken, resuspender ormene i 200 mikroliter PBST og legg PCR-røret på is.Spinn de dissekerte prøvene på en mini benchtop sentrifuge og fjern supernatanten. Tilsett 50 til 100 mikroliter kald metanol, bland ved pipettering, og la prøvene ligge i metanol i 30 til 60 sekunder på is. Vask prøvene to ganger med 200 mikroliter PBST.Etter å ha snurret prøvene og fjernet supernatanten, tilsett blokkeringsløsningen til prøvene og hold den ved romtemperatur i 45 til 60 minutter. Fortynn de primære antistoffene mot arbeidsløsningene i blokkeringsbufferen. Spinn prøvene på en mini benchtop sentrifuge, fjern blokkeringsløsningen, og tilsett 30 til 50 mikroliter av den primære antistoffløsningen.Inkuber over natten ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask prøvene tre ganger i PBST. Fortynn de merkede Fab prime to fragmentene til arbeidsløsningene i blokkeringsbufferen.Etter den tredje vasken, spinn prøvene ned, fjern supernatanten og tilsett 30 til 50 mikroliter av den sekundære antistoffløsningen. Plasser prøven i et mørkt kammer og inkuber i 30 minutter til to timer ved romtemperatur eller over natten ved fire grader Celsius. Vask deretter prøvene tre ganger med PBST i fem til 15 minutter.Spinn ned de flekkete prøvene og fjern supernatanten. Tilsett 50 mikroliter PBST og overfør de flekkete ormene på en coverslip. Pipette 5,7 til 6,3 mikroliter av den postfiksative løsningen på en poly-l-lycin coverslip.Pipette av de dissekerte ormene i samme volum og overfør til dråpen av fikseringsmiddel på poly-l-lysindekselet. Dekk prøven med et lite deksel. Fjern overflødig væske ved hjelp av et lite stykke filterpapir og fest prøven i tre til fem minutter i et mørkt kammer.Frys prøvene ved å plassere dem på en aluminiumsblokk i tørris. Etter minst 20 minutter, fjern det mindre dekselet med en barberhøvel. Dypp dekselet i et 50 milliliter konisk rør som inneholder iskald PBS eller metanol kjølt ved minus 20 grader Celsius i omtrent 10 sekunder.Plasser dekselet i en brønn på en seksbrønnsplate fylt med PBST-buffer. Fjern PBST fra brønnen, tilsett fersk PBST og la prøven stå i fem minutter. Etter vask med PBST igjen, la prøvene stå ved fire grader Celsius til avbildning.Før avbildning, vurder kvaliteten på prøvemonteringen under et stereomikroskop. Hvis du bruker den skreddersydde prøveholderen som vises her, pakk magnetringen med parafilm, og klargjør deretter en milliliter bildebuffer. Ta en coverslip fra seks-brønnsplaten.Plasser den i den skreddersydde holderen og fest dekselet i holderen med den parafilminnpakkede magnetringen. Pipetter bildebufferen forsiktig i kammeret som er opprettet av magnetringen på toppen av prøven, og forsegle kammeret ved hjelp av parafilm. For å montere prøven, tilsett en dråpe nedsenkningsolje til målet for ren olje.Uten å føre luft inn i nedsenkningsoljen, plasser prøveholderen forsiktig med den monterte prøven på mikroskoptrinnet. Bruk EMU-plugin-vinduet i MicroManager 2, flytt piezo-trinnet til signalet fra fokuslåslaseren oppdages ved kvadrantfotodioden. Få et bakre fokalplanbilde med lavere effekt med en laser ved 640 nanometer eksitasjon for å bekrefte fraværet av luftbobler i nedsenkningsoljen.Lokaliser gonadvevet ved hjelp av brightfield-belysningen. Bruk en lav intensitetsbelysning på 640 nanometer, fokuser på vevsseksjonen som inneholder mange synaptonemale komplekser. Fortsett å eksponere prøven ved høy bestråling med belysning ved 640 nanometer i omtrent 30 sekunder til en passende blinkehastighet oppnås.Skaff 200 000 bilder med en eksponeringstid på 20 millisekunder ved hjelp av det flerdimensjonale oppkjøpsverktøyet i MicroManager 2. I mellomtiden konfigurerer du UV-aktiveringen ved hjelp av aktiveringsalternativet til EMU-pluginet for å opprettholde ønsket blinkefrekvens. Det nederste planet av meiotiske kjerner som inneholder synaptonemale komplekser ble visualisert i en Caenorhabditis elegans gonad ved hjelp av HTP-3 og SYP-5 farging.Kromosomaksene i C-enden av SYP-5 HA var godt løst i alle tre dimensjoner i synaptonemale komplekser plassert nær dekselet. Oppløsningen forverres imidlertid i synaptonemale komplekser som ligger i en avstand på fem mikrometer fra dekselet på grunn av lysspredning og sfæriske avvik. Bilder tatt på forskjellige piezoavstander fra dekselet avslørte at det avbildede vevet ikke skulle være lenger enn to mikrometer fra dekselet.Prøveprepareringsprotokollen kan også brukes med TauSTED-mikroskopi. Med den optimaliserte prøveprepareringen ble HTP-3 i kromosomaksene og C-termini av SYP-5 i det sentrale området løst i frontal visning og litt vippet visning. For å oppnå best mulig oppløsning, må gonadene krysskobles tett til dekselet for å sikre at de synaptonemale kompleksene ikke er lenger enn to mikrometer fra dekselet.Vi bruker denne protokollen ikke bare for enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi, men også for stimulert utslippsdeplesjonsmikroskopi. Det kan også være nyttig for andre superoppløsningsmikroskopiteknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-oppløsning Imaging av Bakteriell divisjon Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prøver for Optimalisere STORM Super-oppløsning Mikros

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging av Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Bruke Fast 3D-Strukturert Illumination Mikros (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensjonal Super Resolution Mikroskopi av F-aktin filamenter av Interferometric PhotoActivated Lokalisering Mikroskopi (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Anvendelse av høyhastighets super-oppløsning hastighet mikroskopi i Live primære Flimmerhår

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...