Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Джонаса Риса и лабораторию Риса за совместное использование буферов изображений для обработки изображений SMLM. Мы также благодарим Юми Ким за штамм C. elegans, используемый в этом протоколе, и Эбби Ф. Дернбург за антитело против курицы против HTP-3. Мы благодарим Марко Лампе и Стефана Терюнга из Advanced Light Microscopy Facility в EMBL Heidelberg за их поддержку в использовании конфокального микроскопа Olympus iXplore SPIN SR. Эта работа была поддержана Европейской лабораторией молекулярной биологии и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд - 452616889, Словакия). Мы признаем доступ и услуги, предоставляемые Центром визуализации в Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL IC), щедро поддерживаемые Фондом Берингера Ингельхайма.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Лестничная организация СК, необходимая для правильной рекомбинации и сегрегации гомологичных хромосом, впервые наблюдалась почти 70 лет назад в электронной микроскопии 3,4. В то время как общая организация КА легко решается в электронной микроскопии, локализация отдельных компонентов в этом комплексе требует более целенаправленного подхода. При ширине всего ~100 нм подструктура СК не может быть разрешена с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, микроскопия сверхвысокого разрешения стала основным драйвером для новых открытий о структуре и функции синаптонемального комплекса 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Для облегчения этого исследования мы продемонстрировали процедуру монтажа, которая позволяет изучить архитектуру SC в ткани гонады C. elegans с помощью микроскопии SMLM и STED.
Критическим шагом для оптимизации разрешения в SMLM-визуализации является непосредственное сшивание ткани зародышевой линии с покрытой поли-L-лизином покровом (шаг 4). Ковалентное прикрепление ткани к покровному листу имеет важное значение для уменьшения движений внутри образца, что приведет к большим дрейфам и сделает невозможным визуализацию в течение длительных периодов времени для SMLM. Кроме того, даже неоптимальное прикрепление, которое оставляет ядра, содержащие SCs, на расстоянии от покровного листа, приводит к значительному падению достижимого разрешения в результате сферических аберраций (рисунок 4). В качестве альтернативы ковалентному прикреплению, используемому здесь, окрашенная ткань зародышевой линии также может быть иммобилизована между двумя герметичными покровами в небольшой капле буфера визуализации19,30. Однако этот метод иммобилизации значительно уменьшает объем буфера визуализации в образце с 1 мл, используемого в оптимизированном протоколе здесь, до всего нескольких мкл, что приведет к подкислению буфера визуализации и значительно сократит время, в течение которого образец может быть изображен 38,53,54.
Длительные сроки сбора как для SMLM, так и для STED-микроскопии ограничивают использование этих методов для визуализации химически фиксированных образцов. Здесь фиксация параформальдегида гарантирует, что структура SC сохраняется во время подготовки образцов и визуализации. Однако, несмотря на меры предосторожности, принятые здесь для изображения СК в неповрежденной ткани, результирующая структура СК после фиксации не обязательно идентична структуре в ее родном состоянии в живом организме. Более того, поскольку одно изображение фиксированного СК представляет собой единый «снимок» биологической структуры, такой подход остается слепым к динамике нативной структуры in vivo.
Однако информацию о динамике и изменчивости макромолекулярных структур можно получить и путем получения не одного, а множества «снимков». Хотя этот подход может разрешить изменения в структуре SC во время пахитена19, существует несколько факторов, которые ограничивают количество изображений, которые могут быть получены из одного образца, подготовленного с использованием этого протокола. Во-первых, высокие мощности лазера, используемые при получении изображения, приводят к постоянному отбеливанию флуорофоров и исключают визуализацию соседних областей, представляющих интерес, или нескольких z-плоскостей, тем самым значительно уменьшая количество изображений, которые могут быть получены из одного образца. Во-вторых, плотность образца/ткани на покровном листе, подготовленном этим методом, низкая, что значительно ограничивает количество изображений, которые могут быть получены из одного обтекателя. Низкая плотность выборки также запрещает использование автоматизированных конвейеров сбора изображений, которые помогли пролить свет на другие биологические вопросы 34,55,56,57,58,59. Однако плотность выборки может быть немного увеличена опытным пользователем.
Протокол, представленный здесь, оптимизирован для получения высокой плотности маркировки, необходимой для достижения оптимального разрешения в SMLM35. В то время как предыдущие протоколы ковалентно прикрепляли ткань к покровному листу перед иммуноокрашиванием16, этот новый протокол сшивает ткань с покровным листом только после того, как образцы были окрашены в раствор. Эта модификация позволяет антителам, используемым для иммуномаркировки, свободно получать доступ к ткани со всех сторон, в то время как ковалентное прикрепление ткани к покровному листу может ограничивать антитела от достижения ядер, ближайших к покровному листу, тем самым уменьшая степень маркировки. Вместе описанные здесь модификации улучшают разрешение с 40-50 нм (разрешение FRC)16 до 30-40 нм (этот протокол).
Важно отметить, что, хотя высокая плотность маркировки и высокая концентрация антител необходимы для SMLM, мы обнаружили, что лучшие микроскопические изображения STED получаются с использованием более низких концентраций антител (этап 3). При разрешении в десятки нанометров размер молекул, используемых для маркировки интересующего белка, становится все более важным. Поэтому мы использовали фрагменты F(ab')2, которые вдвое меньше полноразмерных антител. Улучшение локальной контрастности за счет меньшего источника сигнала и, следовательно, разрешения, полученного этой модификацией по сравнению с использованием полноразмерных вторичных антител, позволило разрешить два C-конца SYP-5 в центральной области TauSTED, которые не разрешаются обычным ЗППП с использованием полноразмерных антител (16 и данные не показаны). Мы ожидаем, что этот оптимизированный протокол для визуализации СК в интактных зародышевых линиях C. eleganоблегчит исследование структурно-функциональной взаимосвязи SC во время мейоза.

Сокращение числа хромосом вдвое во время мейоза является ключом к созданию здорового потомства у организмов, размножающихся половым путем. Чтобы добиться этого уменьшения числа хромосом, гомологичные хромосомы должны спариваться и разделяться во время мейоза I. Чтобы обеспечить точное разделение гомологичных хромосом, половые клетки подвергаются расширенной профазе I, во время которой гомологичные хромосомы соединяются, синапс и рекомбинируют для создания физических связей между гомологами1. СК стал центральной структурой, которая является ключевой в регулировании правильной прогрессии через мейотическую профазу2.
SC представляет собой комплекс, общая структура которого эволюционно сохранена, хотя между его белковыми компонентами мало гомологии. СК был впервые идентифицирован на электронных микроснимках как трехсторонняя, лестничная структура, состоящая из двух боковых элементов или осей, центральной области, образованной поперечными нитями, и центрального элемента 3,4. Определение организации отдельных компонентов в комплексе является ключом к углублению нашего понимания роли СК во время мейотической профазы.
Модельный организм C. elegans идеально подходит для изучения структуры и функции СК, поскольку его зародышевые линии содержат большое количество мейотических ядер с полностью собранными СК5. Генетические и биохимические исследования показали, что оси хромосом образованы тремя различными когезин-комплексами 6,7 и четырьмя белками домена HORMA, называемыми HTP-1/2/3 и HIM-3 7,8,9,10,11 у C. elegans. В центральной области СК на сегодняшний день идентифицировано шесть белков, содержащих спиральные домены 12,13,14,15,16,17. Чтобы преодолеть расстояние между двумя осями, SYP-1, -5 и -6 димеризируются лицом к лицу (рисунок 1), в то время как три дополнительных белка стабилизируют свое взаимодействие в центральном элементе 16,17,18,19.
Получение подробного представления об организации этих белков имеет важное значение для понимания многих функций SC во время мейоза. Поскольку ширина центральной области КА составляет всего ~100 нм, ее подструктура не может быть разрешена дифракционно-ограниченной флуоресцентной микроскопией. Тем не менее, визуализация компонентов в структуре такого размера легко достижима с помощью микроскопии со сверхвысоким разрешением. Действительно, структурированная микроскопия освещения (SIM), расширительная микроскопия20, микроскопия с инстимулированным истощением (STED)21 и микроскопия локализации одной молекулы (SMLM)22,23 стали важными инструментами для изучения молекулярной архитектуры SC у видов 16,24,25,26,27,28,29, 30 см.
Чтобы преодолеть предел разрешения, микроскопия STED полагается на наложение дифракционного ограниченного пятна излучающего света пучком в форме пончика от лазера STED, который теоретически сужает функцию распространенияточек до молекулярных размеров 31,32. Однако разрешение, которое практически достижимо с помощью STED в биологических образцах, остается в диапазоне нескольких десятков нанометров в xy33.
Еще более высокое разрешение в биологических образцах может быть получено с помощью методов SMLM. SMLM использует мигающие свойства специфических флуорофоров для разрешения объектов на субдифракционном уровне путем разделения пространственно перекрывающихся флуорофоров во времени. Затем образец многократно визуализируется для захвата различных подмножеств флуорофоров. Положение флуорофоров внутри образца затем определяют путем подгонки функции точечного распространения (PSF) к полученным сигналам на всех изображениях, которая может разрешать структуры до 15 нм23,34.
Взятые вместе, локализованные изображения кодируют положения всех флуорофоров. Разрешение SMLM определяется плотностью маркировки и характеристиками моргания флуорофора. Согласно критерию Найквиста-Шеннона, невозможно надежно разрешить объекты, которые менее чем в два раза превышают среднее расстояние от метки до метки. Таким образом, высокая плотность маркировки необходима для визуализации с высоким разрешением. Для SC у C. elegans высокая плотность маркировки может быть достигнута с помощью эпитопных меток, прикрепленных к конкретным участкам эндогенных белков с помощью редактирования генома. Эпитопные метки затем могут быть окрашены с высокой плотностью с использованием специфических моноклональных антител с высоким сродством19,30. В то же время цикл отдельных флуорофоров должен быть достаточно коротким, чтобы гарантировать, что пространственно перекрывающиеся флуорофоры не захватываются одновременно35.
Из-за этих двух требований разрешение структуры больших макромолекулярных комплексов, таких как SC, требует визуализации достаточно большого количества изображений и, таким образом, может занять несколько часов. Подводный камень длительного времени визуализации заключается в том, что образцы имеют тенденцию дрейфовать из-за движения ступени или небольших токов в буфере образца; даже небольшие движения порядка 10 нм вредны при нм разрешении и должны быть исправлены. Однако обычно используемые методы коррекции дрейфа недостаточно надежны, чтобы точно накладывать изображения двух каналов, изображенных последовательно36. Это проблематично, потому что биологические вопросы часто требуют точного обнаружения и локализации нескольких целей в одном образце. Чтобы обойти эти проблемы, были разработаны такие методы, как ратиометрическая визуализация. Ратиометрическая визуализация позволяет одновременно визуализировать несколько флуорофоров с перекрывающимися спектрами возбуждения и излучения с последующим присвоением каждого обнаруженного сигнала соответствующему флуорофору на основе соотношения интенсивностей в спектрально отчетливых каналах37,38.
Кроме того, изучение организации высокомолекулярных комплексов, таких как SC, требует трехмерной (3D) информации. Для достижения сверхразрешения в трех измерениях (3D-SMLM) цилиндрическая линза включена в оптический путь излучаемого света, который искажает форму PSF флуорофора в зависимости от его расстояния от фокальной плоскости. Следовательно, точное положение флуорофора в z-плоскости может быть экстраполировано путем анализа формы его эмиссионного сигнала35,39. Объединение этих достижений в SMLM позволяет получать изображения 3D-организации макромолекулярных комплексов, включая SC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Во время мейоза гомологичные хромосомы должны распознавать и прилипать друг к другу, чтобы обеспечить их правильную сегрегацию. Одним из ключевых событий, обеспечивающих взаимодействие гомологичных хромосом, является сборка синаптонемного комплекса (СК) в мейотической профазе I. Несмотря на то, что существует небольшая гомология последовательности между белковыми компонентами в пределах SC среди различных видов, общая структура SC была сильно сохранена в ходе эволюции. На электронных микроснимках SC выглядит как трехсторонняя, лестничная структура, состоящая из боковых элементов или осей, поперечных нитей и центрального элемента. 
Однако точная идентификация локализации отдельных компонентов в комплексе с помощью электронной микроскопии для определения молекулярной структуры КА остается сложной задачей. Напротив, флуоресцентная микроскопия позволяет идентифицировать отдельные белковые компоненты в комплексе. Однако, поскольку ширина SC составляет всего ~ 100 нм, его подструктура не может быть разрешена с помощью дифракционно-ограниченной обычной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, определение молекулярной архитектуры SC требует методов световой микроскопии со сверхвысоким разрешением, таких как структурированная микроскопия освещения (SIM), микроскопия с истощением стимулированного излучения (STED) или одномолекулярная локализационная микроскопия (SMLM). 
Для поддержания структуры и взаимодействия отдельных компонентов внутри СК важно наблюдать комплекс в среде, близкой к его родной среде в половых клетках. Таким образом, мы демонстрируем протокол иммуногистохимии и визуализации, который позволяет изучать субструктуру SC в интактной, экструдированной ткани зародышевой линии Caenorhabditis elegans с помощью микроскопии SMLM и STED. Непосредственное закрепление ткани на покровном листе уменьшает движение образцов во время визуализации и сводит к минимуму аберрации в образце для достижения высокого разрешения, необходимого для визуализации подструктуры SC в его биологическом контексте.

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Микроскопия сверхвысокого разрешения может дать подробное представление об организации компонентов в синаптонемальном комплексе при мейозе. Здесь мы демонстрируем протокол для разрешения отдельных белков синаптонемального комплекса Caenorhabditis elegans .

Микроскопия со сверхвысоким разрешением синаптонемального комплекса в зародышевой линии Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Синаптонемальный комплекс является ключевым компонентом мейоза. Чтобы изучить его функцию, мы должны также понять его структуру, для которой микроскопия сверхвысокого разрешения оказалась невероятно полезной. Мы оптимизировали наш протокол для стабильного прикрепления иммуноокрашенной гонады C.elegans к крышке, которая помогает улучшить разрешение до 30 нанометров в неповрежденных тканях.Проектирование экспериментов по микроскопии локализации одной молекулы, последующий анализ, а также интерпретация данных могут быть довольно сложными и должны быть лучше всего настроены вместе с экспертом. Демонстрировать процедуру будет Ивана Кавка, докторант лаборатории. Получение микроскопических изображений локализации одной молекулы также будет показано Рори Пауэром, инженером-оптиком из Центра визуализации MBL.Начните с сбора соответствующих возрасту червей Caenorhabditis elegans из агаровых пластин NGM. Переведите червей в 30-микролитровую каплю EBTT на крышке. Промыть червей дополнительными 30 микролитрами EBTT.Удалите 30 микролитров раствора, оставив 30 микролитров капли с червями на крышке. Используйте лезвие скальпеля, чтобы отрезать головы червей и / или хвосты, чтобы выдавить гонаду. При успешном рассечении ткань гонады будет полностью экструдирована вне тела червя.Пипетка 30 микролитров фиксирующего раствора в каплю рассеченных червей. Перемешайте путем пипетки и оставьте образцы для фиксации на одну минуту. Остановите фиксацию ровно через одну минуту, перенеся червей с помощью 20-микролитровой пипетки на ПЦР-трубку, заполненную TBST.Затем выполните промывку, вращая рассеченные образцы на мини-настольной центрифуге. Как только супернатант удален, повторно суспендируйте червей в 200 микролитрах свежего TBST. После окончательной промывки повторно суспендируйте червей в 200 микролитров ПБСТ и поместите трубку ПЦР на лед.Раскрутите рассеченные образцы на мини-настольной центрифуге и удалите супернатант. Добавьте от 50 до 100 микролитров холодного метанола, перемешайте путем пипетки и оставьте образцы в метаноле на 30-60 секунд на льду. Дважды промыть образцы 200 микролитрами ПБСТ.После вращения образцов и удаления супернатанта добавьте блокирующий раствор к образцам и держите его при комнатной температуре в течение 45-60 минут. Разводят первичные антитела к рабочим растворам в блокирующем буфере. Раскрутите образцы на мини-настольной центрифуге, удалив блокирующий раствор, и добавьте от 30 до 50 микролитров раствора первичного антитела.Насиживают на ночь при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации промыть образцы три раза в ПБСТ. Разбавьте меченые Fab простые два фрагмента до рабочих растворов в блокирующем буфере.После третьей промывки раскрутите образцы вниз, удалите супернатант и добавьте от 30 до 50 микролитров раствора вторичных антител. Поместите образец в темную камеру и инкубируйте в течение 30 минут до двух часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем промывайте образцы три раза ПБСТ в течение пяти-15 минут.Раскрутите окрашенные образцы и удалите супернатант. Добавьте 50 микролитров PBST и переложите окрашенных червей на крышку. Пипетка от 5,7 до 6,3 микролитров постфиксативного раствора на поли-l-лициновую крышку.Пипетки снимают рассеченных червей в том же объеме и переносят в каплю фиксатора на поли-l-лизиновой крышке. Накройте образец небольшим чехлом. Удалите лишнюю жидкость с помощью небольшого кусочка фильтровальной бумаги и зафиксируйте образец на три-пять минут в темной камере.Заморозьте образцы, поместив их на алюминиевый блок в сухой лед. По крайней мере, через 20 минут удалите меньшую крышку с помощью бритвы. Окуните крышку в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую ледяной PBS или метанол, охлажденный при минус 20 градусах Цельсия, в течение примерно 10 секунд.Поместите крышку в колодец из шестилуночной пластины, заполненной буфером PBST. Извлеките ПБСТ из колодца, добавьте свежий ПБСТ и оставьте образец на пять минут. После промывки PBST еще раз оставьте образцы при четырех градусах Цельсия до получения изображения.Перед визуализацией оцените качество крепления образца под стереомикроскопом. При использовании изготовленного на заказ держателя образца, показанного здесь, оберните магнитное кольцо парапленкой, а затем подготовьте один миллилитр буфера визуализации. Возьмите крышку с шестилуночной пластины.Поместите его в изготовленный на заказ держатель и закрепите крышку в держателе с помощью магнитного кольца, обернутого парапленкой. Аккуратно пипеткуйте буфер визуализации в камере, созданный магнитным кольцом поверх образца, и герметизируйте камеру с помощью парапленки. Чтобы смонтировать образец, добавьте одну каплю погружного масла в объектив чистого масла.Не вводя воздуха в погружное масло, аккуратно поместите держатель образца с установленным образцом на ступень микроскопа. Используя окно плагина EMU в MicroManager 2, перемещайте пьезо-стадию до тех пор, пока сигнал от лазера блокировки фокусировки не будет обнаружен на квадрантном фотодиоде. Получение изображения задней фокальной плоскости с меньшей мощностью с помощью лазера при возбуждении 640 нанометров для подтверждения отсутствия пузырьков воздуха в погружном масле.Локализуйте ткань гонады с помощью яркого освещения. Используя освещение низкой интенсивности в 640 нанометров, сосредоточьтесь на участке ткани, содержащем множество синаптонемальных комплексов. Приступайте к экспонированию образца при высоком излучении с освещением на 640 нанометров в течение примерно 30 секунд до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая скорость моргания.Получайте 200 000 кадров со временем экспозиции 20 миллисекунд с помощью многомерного инструмента сбора в MicroManager 2. Между тем, настройте УФ-активацию, используя опцию активации плагина EMU для поддержания желаемой скорости мигания. Самая нижняя плоскость мейотических ядер, содержащих синаптонемальные комплексы, была визуализирована в гонаде Caenorhabditis elegans с использованием окрашивания HTP-3 и SYP-5.Оси хромосом в С-конце SYP-5 HA были хорошо разрешены во всех трех измерениях в синаптонемальных комплексах, расположенных близко к покровному листу. Однако разрешение ухудшается в синаптонемальных комплексах, расположенных на расстоянии пяти микрометров от покровного листа из-за рассеяния света и сферических аберраций. Изображения, полученные на разных пьезодальностях от покровного листа, показали, что изображенная ткань не должна находиться дальше двух микрометров от покровного листа.Протокол пробоподготовки также может быть использован с микроскопией TauSTED. При оптимизированной пробоподготовке HTP-3 в оси хромосом и C-термины SYP-5 в центральной области были разрешены в лобовом обзоре и слегка наклоненном виде. Чтобы получить наилучшее разрешение, гонады должны быть плотно сшиты с крышкой, чтобы гарантировать, что синаптонемальные комплексы находятся не дальше двух микрометров от крышки.Мы используем этот протокол не только для микроскопии локализации одной молекулы, но и для микроскопии замедленного истощения эмиссии. Это также может быть полезно для других методов микроскопии со сверхвысоким разрешением.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Супер-Resolution Imaging из Cytokinetic Z Кольцо в живых бактерий Использование быстрого 3D-Structured Illumination микроскопии (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Применение высокоскоростных суперразрешением скорость микроскопии в прямом первичной ресничку

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...