Name: super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Jonas Ries'e ve Ries laboratuvarına SMLM görüntüleme için görüntüleme tamponlarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca bu protokolde kullanılan C. elegans suşu için Yumi Kim'e ve tavuk-anti-HTP-3 antikoru için Abby F. Dernburg'a teşekkür ederiz. EMBL Heidelberg'deki Gelişmiş Işık Mikroskobu Tesisi'nden Marko Lampe ve Stefan Terjung'a Olympus iXplore SPIN SR konfokal mikroskopu kullanımındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı - 452616889, SK) tarafından desteklenmiştir. Boehringer Ingelheim Vakfı tarafından cömertçe desteklenen Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL IC) Görüntüleme Merkezi tarafından sağlanan erişim ve hizmetleri kabul ediyoruz.

1. Çözeltilerin ve kapakların hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna ve bu protokolde kullanılan çözeltilerin bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
<ol><li>Poli-L-lizin kaplı kapak kapakları<ol><li>% 0.01 (w / v) poli-L-lizin hazırlayın (bakınız Tablo 1).</li>
		<li>Hassas bir kapak kapağını (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) etanol içinde 10-30 dakika boyunca yıkayın. Etanol çıkarmak için kapak kaymasını ddH2O ile durulayın ve kapak kaymasını oda sıcaklığında kurumaya bırakın.</li>
		<li>Plazma, bir plazma temizleyici kullanarak kapak kapağını temizler. NOT: Plazma temizliği, kapak kaymasının hidrofilikliğini arttırır ve aşağıdaki adımları kolaylaştırır. Bir plazma temizleyici mevcut değilse, bu adım atlanabilir, ancak bu, poli-L-lizin çözeltisinin hacminin ve / veya konsantrasyonunun ayarlanmasını gerektirebilir. Bu değişiklik test edilmemiştir.</li>
		<li>Kapak kapağına %0,01 (w/v) poli-L-lizinden bir damla (120 μL) yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, kapak kaymasını ddH2O'da durulayın ve oda sıcaklığında kurutun. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>F(ab')2 parçaları floresan organik boyalarla konjuge edilmiş<ol><li>Bir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla ekleyin: PBS'de 10 μL 0.6-0.7 mg / mL F (ab')2 fragmanı, 1 μL 0.1 M NaHCO 3 (pH8.3 ) ve DMSO'da 1 mM süksinimidil (NHS) ester reaktif floroforun 1 μL (F (ab')2: boyanın molar oranı ~ 1: 17'dir). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>F(ab')2 parçasını, üreticinin spesifikasyonlarına uygun olarak bir tuz giderme sütunu (7K MWCO) kullanarak kalan serbest reaktif boyadan ayırın. Kolonun dengelenmesi ve etiketli F(ab')2 parçasının elüsyonu için 1x PBS kullanın.</li>
		<li>Etiketli F(ab')2 parçasını 4 °C'de 3 aya kadar saklayın. NOT: 3 aydan uzun depolama süreleri test edilmemiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diseksiyon ve fiksasyon
NOT: Diseksiyon ve fiksasyon prosedürleri, süper çözünürlüklü mikroskopi için en uygun örnekleri elde etmek için daha önce önerilen prosedürler 16,40'tan değiştirilmiştir.
<ol><li>Diseksiyonu<ol><li>Yaşa uygun C. elegans solucanlarını (bu çalışma için 20 ° C'de yetiştirilen) bir kapak kayması (22 mm x 22 mm, No. 1) üzerinde 30 μL'lik bir EBTT damlasına (% 0.2 iyonik olmayan deterjanla 1x Yumurta tamponu41) seçin. Daha kolay manipülasyon için kapak kaymasını cam bir kızağın üzerine yerleştirin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek 30 μL EBTT ile yıkayın. Kapak kayması üzerinde 30 μL'lik bir damla bırakmak için çözeltinin 30 μL'sini çıkarın. NOT: Solucanların plastik uçlara yapışmasını önlemek için solucanların pipetlendiği tüm çözeltilere az miktarda iyonik olmayan deterjan eklenmelidir.</li>
		<li>Gonadı ekstrüzyon yapmak için solucanların kafalarını ve / veya kuyruklarını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın (Şekil 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fiksasyon<ol><li>Pipet 30 μL fiksatif çözelti (Tablo 1) içine disseke solucanlar damla ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için. NOT: Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlemek daha fazla gonadın serbest bırakılmasına yardımcı olabilir.</li>
		<li>Fiksatif çözeltiyi ekledikten sonra tam olarak 1 dakika boyunca düzeltin.</li>
		<li>Solucanları TBST ile doldurulmuş bir PCR tüpüne aktararak fiksasyonu durdurun (Tablo 1). Solucanları mümkün olduğunca az hacimde (~ 15 μL) aktarın.</li>
		<li>PCR tüpünü mini tezgah üstü santrifüjde (2.000 × g, 10 sn) döndürün. Süpernatantı çıkarın ve her biri 200 μL TBST ile 2 kat yıkayın.</li>
		<li>5-10 dakika boyunca 200 μL PBST (Tablo 1) ile yıkayın. Disseke edilmiş numuneleri buz üzerinde tutarken en fazla dört numune için 2.1.1 ile 2.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın. NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, numune fiksasyonunun tüm numunelerde tutarlı kalmasını sağlamak için her dört numuneden sonra 2.2.6 ila 2.2.7 arasındaki adımlarla devam edin.</li>
		<li>Disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 sn) üzerinde döndürün, PBST'yi çıkarın ve 50-100 μL soğuk metanol (-20 ° C) ekleyin. DİKKAT: Metanol toksiktir. Koruyucu ekipman giyin ve solunmasından kaçının.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetleyerek, numuneleri metanol içinde 30-60 sn bekletin. Numuneleri 200 μL PBST'de 2 kat yıkayın. NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, kalan numunelerin diseksiyonuna devam edin (adım 2.1.1 ila 2.2.7).</li>
		<li>Numuneleri 200 μL PBST ile üçüncü kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Antikor inkübasyonları
<ol><li>Engelleme<ol><li>Numuneleri oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca 1x Blokaj Çözeltisinde (Tablo 1) bloke edin. NOT: Kuluçka süresi oda sıcaklığında 30 dakikadan 4 ° C'de birkaç güne kadar değişebilir (test 3 güne kadar yapılmıştır).</li>
	</ol></li>
	<li>Birincil antikor çözeltisi<ol><li>Anti-HTP-3 (tavuk42) ve anti-HA (fare) antikorlarını (veya tercih edilen antikorları) çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:250 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) 1x Bloke Çözeltisinde seyreltin. NOT: SMLM örneklerini etiketlemek için kullanılan antikorlar, SMLM mikroskopisi için daha yüksek bir etiketleme yoğunluğu önerildiğinden, STED örneklerinden daha konsantredir.</li>
		<li>Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerinde döndürün, bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisinden 30-50 μL ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de (tercih edilen) veya oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan boyaya konjuge edilmiş F(ab')2 parçalarının çalışma çözeltisi<ol><li>Etiketli F(ab')2 parçalarını (adım 1.2.4) 1x Bloke Çözeltisinde çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:100 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) seyreltin. NOT: Her iki süper çözünürlük tekniği için, daha önce bildirilen florofor çiftleri, yani SMLM için AlexaFluor647 / CF680 ve STED için AlexaFluor594 / Abberior STAR635P kullanılmıştır. AlexaFluor647 ve STAR645P, SYP-5'in C-terminusunu hedeflemek için fare karşıtı (Fab')2 parçalarını ve HTP-3'ü hedeflemek için CF680 / AlexaFluor594 etiketli anti-tavuk (Fab')2 parçalarını etiketlemek için kullanıldı.</li>
		<li>Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerine döndürün, PBST'yi çıkarın ve 30-50 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında (tercih edilen) 30 dakika ila 2 saat veya 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Numunelerin bir kapak fişi üzerine monte edilmesi
<ol><li>Postfixasyon NOT: Numuneleri 4.1.1-4.2.1 numaralı adımlarla tek tek işleyin.<ol><li>Lekeli örnekleri döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 μL PBST0,2 ekleyin ve lekeli solucanları 22 mm x 22 mm No. 1 kapak kayması üzerine aktarın. NOT: Solucanların kapak kaymasına yapışmasını önlemek için bu adım için tazePBST 0.2 ile %0,2 iyonik olmayan deterjan (Tablo 1) kullanın.</li>
		<li>Pipet 5.7-6.3 μL postfiksatif çözelti bir poli-L-lizin kapak kayması üzerine. NOT: 4 °C'de saklanan poli-L-lizin kapaklar öncelikle oda sıcaklığına getirilmelidir.</li>
		<li>Pipet, disseke edilmiş solucanları aynı hacimde (5.7-6.3 μL) çıkarır ve poli-L-lizin kapak kayması üzerindeki fiksatif damlasına aktarılır (Şekil 2B). NOT: Bu ve sonraki adımda, disseke edilmiş dokunun poli-L-lizin kaplı kapak kaymasının merkezinde tutulması çok önemlidir. Bu, özellikle numunelerin burada kullanılan özel yapım SMLM mikroskobuna uyacak şekilde özel bir tutucuya monte edilmesi durumunda önemlidir (bkz. adım 5.1, Şekil 2B).</li>
		<li>Numuneyi küçük bir kapak kapağıyla örtün (12 mm çap, Şekil 2B). Küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak fazla sıvıyı çıkarın (Şekil 2B). Karanlık bir odada 3-5 dakika boyunca sabitleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>"Donma-çatlama"<ol><li>Numuneleri kuru buzda alüminyum bir blok üzerine yerleştirerek dondurun (Şekil 2B). NOT: Alüminyum blok, numuneleri üzerine yerleştirmeden önce kuru buzda iyice soğutulmalıdır. Kalan örneklerin postfiksasyonuna devam edin (adım 4.1.1 ila 4.2.1). Numunenin bir sonraki adımdan önce en az 20 dakika veya 1 saate kadar kuru buz üzerinde olması gerekir (4.2.2).</li>
		<li>Küçük kapak kapağını tıraş bıçağı kullanarak çıkarın (Şekil 2B). NOT: STED için adım 5.2.1'e geçin. SMLM için adım 4.2.3 ile devam edin.</li>
		<li>Kapak kapağını buz gibi soğuk PBS (tercih edilen) veya -20 °C metanol içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yaklaşık 10 s batırın. NOT: Sıcaklık bu adım için çok önemli bir faktördür. Bu nedenle, taze çözülmüş veya bir buz / etanol banyosunda tutulan PBS kullanın.</li>
		<li>Kapak kapağını PBST tamponuyla doldurulmuş altı delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. PBST'yi kuyucuklardan çıkarın ve taze PBS ekleyin. Örnekleri PBS'de 5 dakika bekletin. NOT: Numunelerin zarar görmesini ve sökülmesini önlemek için PBS'yi kuyunun kenarına pipetin.</li>
		<li>Taze PBS ile yıkayın ve görüntülemeye kadar numuneleri 4 °C'de bırakın. NOT: Numuneler 2 haftaya kadar stabildir, ancak numuneler 2 gün içinde görüntülendiğinde en iyi sonuçlar elde edilir.</li>
		<li>Görüntülemeden önce, numune montajının kalitesini stereo mikroskop altında değerlendirin. NOT: Başarıyla monte edilmiş germ hatları, kapak kaymasına göre fark edilebilir bir hareket olmadan sabit bir şekilde tutturulmuştur. Kötü bağlanmış germ çizgileri tampon çözeltisinde çırpınacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Görüntüleme
<ol><li>Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu NOT: Görüntüler, daha önce bildirildiği gibi, özel bir cisim etrafında inşa edilmiş özel yapım tek moleküllü bir lokalizasyon mikroskobu kullanılarak EMBL Görüntüleme Merkezi'nde elde edilmiştir.38,43, 'de belirtilen benzersiz özelliklere sahip Malzeme Tablosu; https://www.embl.org/about/info/imaging-centre'ye bakınız<ol><li>3D boncuk kalibrasyonu edinme<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi yapışkan 100 nm floresan boncuklarla hassas bir kapak kayması (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) hazırlayın38,44.</li>
			<li>Adım 5.1.1.1'den itibaren kalibrasyon numunesini bir numune tutucuya yerleştirin.</li>
			<li>Temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin ve kalibrasyon numunesini mikroskopa monte edin.</li>
			<li>MicroManager 2 45,46 içinde, kalibrasyon numunesinde15-20 konum belirtin.</li>
			<li>EMU eklentisi penceresi47'de, adım 5.1.1.5'teki pozisyonların her biri için bir z-stack görüntüsünün alınmasını ayarlayın. NOT: Burada, bileşik silindirik bir lens, 3D görüntüleme için gereken astigmatizmayı sağlar ve 10 nm'lik bir artışla -1 μm ila 1 μm arasındaki aralığı kapsayan her bir pozisyon için 201 z-dilimi elde edilmiştir. Her z-dilimi için25 ms için 2 kW/cm2 640 nm lazer aydınlatma kullanılmıştır.</li>
			<li>Adım 5.1.11'de örnek görüntüler elde etmek için kullanılacak aynı optik yoldan 100 nm floresan boncukların z-stack görüntülerini elde edin.</li>
			<li>Süper çözünürlüklü mikroskopi analiz platformunu (SMAP48) kullanarak, adım 5.1.13'teki 3D-SMLM verilerine uymak için kullanılacak deneysel nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) bir cspline modelini oluşturun.</li>
		</ol></li>
		<li>Numune tutucuyu hazırlayın. Burada kullanılan, görüntüleme odasını oluşturmak için manyetik bir halka kullanan özel yapım tutucu için (Şekil 2B), manyetik halkayı parafilm ile sarın. NOT: Alternatif olarak, içbükey çöküntü boşluğuna sahip bir mikroskop slaydı, slayt tutuculu mikroskoplar için numuneleri monte etmek için kullanılabilir.</li>
		<li>1 mL görüntüleme tamponu44 hazırlayın (Tablo 1).</li>
		<li>Adım 4.2.6'dan bir kapak kapağı alın ve ısmarlama tutucuya yerleştirin. Tutucudaki kapak kaymasını parafilm sarılı manyetik halka ile sabitleyin (adım 5.1.2).</li>
		<li>Numunenin üstündeki manyetik halka tarafından oluşturulan hazneye görüntüleme tamponunu (adım 5.1.3) nazikçe pipetleyin (Şekil 2B). Odayı bir parça parafilm ile kapatın.</li>
		<li>Numuneyi monte etmek için, temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin. Daldırma yağına herhangi bir hava sokmadan, numune tutucuyu monte edilmiş numuneyle (adım 5.1.5) mikroskop aşamasına yavaşça yerleştirin. NOT: Numuneyi mikroskopa yerleştirmeden önce, kapak kapağının tabanını doku ve% 70 etanol ile temizleyin.</li>
		<li>MicroManager 245,46 içindeki EMU eklenti penceresi47'yi kullanarak, kadran fotodiyotunda (QPD) odak kilidi lazerinden gelen sinyal algılanana kadar piezo aşamasını hareket ettirin. NOT: Görüntüleme süresi boyunca sabit bir odağı korumak için, odak kilitleme, yakın kızılötesi fiber bağlantılı bir lazerin kapak kaymasından toplam dahili yansıması ve ardından bir kadran fotodiyot (QPD) üzerinde yüksekliğe duyarlı algılama ile elde edilir. QPD sinyali, objektif lens piezo yuvasının kapalı döngü kontrolünü sağladı.</li>
		<li>Daldırma yağında hava kabarcıklarının olmadığını doğrulamak için düşük güçte (yani% 1-5) 640 nm uyarma lazeri ile bir arka odak düzlemi görüntüsü elde edin. NOT: Bir hava kabarcığı algılanırsa numuneyi sahne alanından çıkarın. Kapak fişinin alt kısmını ve hedefi temizleyin ve 5.1.6-5.1.8 adımlarını tekrarlayın. Aksi takdirde, DAÜ yazılımı47'deki odağı kilitlemeye devam edin.</li>
		<li>Parlak alan aydınlatmasını kullanarak gonad dokusunu lokalize edin. Düşük yoğunluklu 640 nm aydınlatma kullanarak, dokunun birçok SC gerilmesini içeren bölümüne odaklanın. NOT: Kapak kaymasından 2 μm'den daha uzak olan yapılara odaklanmayın. Numuneyi bulmak için daha yüksek bir lazer gücü kullanmayın, çünkü bu bazı floroforları erken yanıp sönen bir duruma dönüştürebilir. Burada, 1.000'e ayarlanmış bir darbe ile yükselen modda 1 kW /cm2 kullanıldı.</li>
		<li>Uygun bir yanıp sönme hızı elde edilene kadar numuneyi ~30 s boyunca yüksek ışımada (27 kW /cm2) 640 nm aydınlatma ile pozlamaya devam edin (Ek Video 1).</li>
		<li>MicroManager 245,46'daki çok boyutlu alma aracını kullanarak 20 ms pozlama süresiyle 200.000 kare elde edin.</li>
		<li>Bu arada, istenen yanıp sönme hızını korumak için EMU eklentisi 38,47'nin etkinleştirme seçeneğini kullanarak UV aktivasyonunu ayarlayın. NOT: UV lazeri, maksimum darbe uzunluğu 10.000 olarak ayarlanmış şekilde yükselen modda 3 kW/cm2 parlaklıkta kullanın.</li>
		<li>SMLM görüntü rekonstrüksiyonu ve postprocessing gerçekleştirin. NOT: Ham SMLM verilerinden görüntüleri yeniden oluşturmak için, yayımlanmış yöntemlere bakın. Burada sunulan veriler SMAP48,49 yazılımı kullanılarak işlenmiştir. SMAP48 yazılımında süper çözümlenmiş görüntü yeniden yapılandırma, kanal atama, sapma düzeltme ve yerelleştirmelerin zayıf yerelleştirme hassasiyeti ve maksimum olasılık filtresiyle filtrelenmesi gerçekleştirildi.</li>
	</ol></li>
	<li>Uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu NOT: Görüntüler, beyaz ışık lazeri, 775 nm darbeli STED lazer ve EMBL Görüntüleme Merkezi'ndeki (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre) FALCON Fluorescence Lifetime IMyaşlanma modülü (Malzeme Tablosu) ile donatılmış entegre STED mikroskobik sistemde elde edilmiştir.<ol><li>Bir mikroskop slaytına 20 μL'lik bir damla montaj ortamı (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Adım 4.2.2'den bir kapak kayması alın ve numuneyi montaj ortamına bakan kızağa yavaşça yerleştirin (Şekil 2B). NOT: Montaj ortamının içine hava cepleri sokmaktan kaçının.</li>
		<li>Montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin. NOT: Numuneleri ertesi gün görüntüleyin veya görüntülemeye kadar 4 °C'de tutun.</li>
		<li>Numuneyi monte etmek için, 5.2.2 adımından numunenin kapak kapağına bir damla daldırma yağı ekleyin. 100x/1.40 yağ hedefi kullanarak numuneyi yavaşça mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
		<li>Numuneye odaklanın ve parlak alan aydınlatmasını kullanarak germline dokusunu bulun.</li>
		<li>Mikroskop yazılımını kullanarak, TauSTED görüntüsünün elde edileceği ilgi alanını belirtin.</li>
		<li>Numunede kullanılan floroforları uyarmak için kullanılan uyarma lazerlerini ve uygun güçlerini seçin. NOT: Burada, AlexaFluor 594-konjuge F(ab')2 sekonder antikor fragmanlarını ve STAR 635P-konjuge F(ab')2 parçalarını görüntülemek için %3 güçte 635 nm %4 güçte 580 nm lazer kullanılmıştır.</li>
		<li>Mikroskop yazılımını kullanarak, uygun bir STED tükenme lazer gücü seçin ve görüntü algılamayı ayarlayın. NOT: Burada, 775 nm STED tükenme lazer gücü% 40 olarak ayarlanmıştır. Dedektör, foton algılama için 10 kazanç değerine sahip, 100 Hz tarama hızıyla ve 17 nm piksel boyutunda sayım modunda kullanıldı. TauSTED edinimi için dört satırlı birikim kullanılmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Homolog kromozomların doğru rekombinasyonu ve ayrışması için gerekli olan SC'nin merdiven benzeri organizasyonu, ilk olarak yaklaşık 70 yıl önce elektron mikroskobu 3,4'te gözlemlenmiştir. SC'nin genel organizasyonu elektron mikroskobunda kolayca çözülürken, bu kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonu daha hedefli bir yaklaşım gerektirir. Sadece ~ 100 nm genişliğiyle, SC'nin alt yapısı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü mikroskopi, sinaptonemal kompleksin yapısı ve işlevi üzerine yeni keşifler için önemli bir itici güç haline gelmiştir 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Bu araştırmayı kolaylaştırmak için, SMLM ve STED mikroskobu ile C. elegans gonad dokusu içindeki SC'nin mimarisini incelemeye izin veren bir montaj prosedürü gösterdik.
SMLM görüntülemede çözünürlüğü optimize etmek için kritik bir adım, germ hattı dokusunu poli-L-lizin kaplı bir kapak kaymasına doğrudan çapraz bağlamaktır (adım 4). Dokunun kapak kaymasına kovalent olarak bağlanması, numune içindeki hareketleri azaltmak ve SMLM için uzun süre görüntülemeyi imkansız hale getirecek şekilde büyük sapmalara neden olacak şekilde gereklidir. Ek olarak, SC'leri içeren çekirdekleri kapak kaymasından uzakta bırakan optimal olmayan bir bağlantı bile, küresel sapmalardan kaynaklanan ulaşılabilir çözünürlükte önemli bir düşüşe yol açar (Şekil 4). Burada kullanılan kovalent ataşmana alternatif olarak, lekeli germline dokusu, küçük bir görüntüleme tamponu19,30 damlasında iki kapalı kapak kapağı arasında hareketsiz hale getirilebilir. Bununla birlikte, bu immobilizasyon yöntemi, numunedeki görüntüleme tamponunun hacmini, burada optimize edilmiş protokolde kullanılan 1 mL'den sadece birkaç μL'ye düşürür, bu da görüntüleme tamponunun asitlenmesine neden olur ve numunenin görüntülenebileceği süreyi ciddi şekilde azaltır 38,53,54.
Hem SMLM hem de STED mikroskopisi için uzun elde etme süreleri, bu yöntemlerin kullanımını kimyasal olarak sabitlenmiş numunelerin görüntülenmesiyle sınırlar. Burada, paraformaldehit fiksasyonu, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında SC'nin yapısının korunmasını sağlar. Bununla birlikte, SC'yi sağlam doku içinde görüntülemek için burada alınan önlemlere rağmen, fiksasyondan sonra SC'nin ortaya çıkan yapısı, canlı bir organizma içindeki doğal durumundaki yapıyla aynı olmak zorunda değildir. Dahası, sabit SC'nin tek bir görüntüsü biyolojik yapının tek bir "anlık görüntüsünü" temsil ettiğinden, bu yaklaşım in vivo olarak doğal yapının dinamiklerine kör kalır.
Bununla birlikte, makromoleküler yapıların dinamikleri ve değişkenliği hakkında bilgi, sadece tek bir değil, birçok "anlık görüntü" elde edilerek de elde edilebilir. Bu yaklaşım, pachytene19 sırasında SC'nin yapısındaki değişiklikleri çözebilirken, bu protokol kullanılarak hazırlanan tek bir örneklemden elde edilebilecek görüntü sayısını sınırlayan birkaç faktör vardır. İlk olarak, görüntü elde etme sırasında kullanılan yüksek lazer güçleri, floroforların kalıcı olarak ağartılmasına yol açar ve bitişik ilgi alanlarının veya çoklu z-düzlemlerinin görüntülenmesini engeller, böylece tek bir numuneden elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde azaltır. İkincisi, bu yöntemle hazırlanan kapak kayması üzerindeki numune/doku yoğunluğu düşüktür, bu da tek bir kapak kaymasından elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde sınırlar. Düşük numune yoğunluğu,diğer biyolojik sorulara ışık tutmaya yardımcı olan otomatik görüntü toplama boru hatlarının kullanımını da yasaklar 34,55,56,57,58,59. Bununla birlikte, numune yoğunluğu deneyimli bir kullanıcı tarafından biraz arttırılabilir.
Burada sunulan protokol, SMLM35'te optimum çözünürlük elde etmek için gerekli olan yüksek etiketleme yoğunluğunu elde etmek için optimize edilmiştir. Önceki protokoller, immün boyama16'dan önce dokuyu kovalent olarak kapak kaymasına bağlarken, bu yeni protokol, dokuyu yalnızca numuneler çözelti içinde boyandıktan sonra kapak kaymasına çapraz bağlar. Bu modifikasyon, immünoetiketleme için kullanılan antikorların dokuya her taraftan serbestçe erişmesine izin verirken, dokunun kapak kaymasına kovalent bağlanması, antikorların kapak kaymasına en yakın çekirdeğe ulaşmasını kısıtlayabilir ve böylece etiketleme derecesini azaltabilir. Birlikte, burada açıklanan modifikasyonlar çözünürlüğü 40-50 nm'den (FRC çözünürlüğü)16'dan 30-40 nm'ye (bu protokol) yükseltir.
Önemli olarak, SMLM için yüksek etiketleme yoğunluğu ve yüksek konsantrasyonda antikor gerekli olsa da, daha düşük antikor konsantrasyonları kullanılarak daha iyi STED mikroskopi görüntülerinin elde edildiğini bulduk. Onlarca nanometrelik bir çözünürlükte, ilgilenilen proteini etiketlemek için kullanılan moleküllerin boyutu giderek daha önemli hale geliyor. Bu nedenle, tam uzunluktaki antikorların yarısı büyüklüğünde olan F (ab')2 fragmanlarını kullandık. Daha küçük bir sinyal kaynağı nedeniyle lokal kontrasttaki iyileşme ve dolayısıyla tam uzunlukta ikincil antikorların kullanılmasına kıyasla bu modifikasyonla elde edilen çözünürlük, merkezi bölge içindeki SYP-5'in iki C-termininin TauSTED tarafından çözülmesine izin verdi, bunlar tam uzunlukta antikorlar kullanılarak geleneksel STED ile çözülmedi (16 ve veriler gösterilmedi). Bozulmamış C. elegangerm hatlarındaki SC'leri görüntülemek için optimize edilmiş bu protokolün, mayoz sırasında SC'nin yapı-fonksiyon ilişkisinin araştırılmasını kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Mayoz sırasında kromozom sayısını yarı yarıya azaltmak, cinsel olarak üreyen organizmalarda sağlıklı soy üretmenin anahtarıdır. Kromozom sayısındaki bu azalmayı sağlamak için, homolog kromozomlar mayoz I sırasında eşleşmeli ve ayrılmalıdır. Homolog kromozomların doğru bir şekilde ayrılmasını sağlamak için, germ hücreleri, homolog kromozomların homologlar1 arasında fiziksel bağlantılar oluşturmak için eşleştiği, sinaps yaptığı ve yeniden birleştiği genişletilmiş bir faz I'e maruz kalır. SC, mayotik faz2 yoluyla doğru ilerlemeyi düzenlemede anahtar olan merkezi yapı olarak ortaya çıkmıştır.
SC, protein bileşenleri arasında çok az homoloji olmasına rağmen, genel yapısı evrimsel olarak korunan bir komplekstir. SC ilk olarak elektron mikrograflarında iki yanal eleman veya eksenden oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı, enine filamentlerin oluşturduğu merkezi bir bölge ve merkezi bir element 3,4 olarak tanımlanmıştır. Kompleks içindeki bireysel bileşenlerin organizasyonunu belirlemek, mayotik profaz sırasında SC'nin rolü hakkındaki anlayışımızı ilerletmenin anahtarıdır.
Model organizma C. elegans, SC'nin yapısını ve işlevini incelemek için idealdir, çünkü germ hatları tamamen monte edilmiş SCs5 ile çok sayıda mayotik çekirdek içerir. Genetik ve biyokimyasal çalışmalar, kromozom eksenlerinin, C. elegans'ta HTP-1/2/3 ve HIM-3 7,8,9,10,11 olarak adlandırılan üç ayrı kohezin kompleksi 6,7 ve dört HORMA alan proteini tarafından oluşturulduğunu ortaya koymuştur. SC'nin merkezi bölgesinde, sarmal bobin alanları içeren altı protein bugüne kadar 12,13,14,15,16,17 tanımlanmıştır. İki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için, SYP-1, -5 ve -6 kafa kafaya bir şekilde dimerize olurken (Şekil 1), üç ek protein isemerkezi element 16,17,18,19'daki etkileşimlerini stabilize eder.
Bu proteinlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi edinmek, SC'nin mayoz sırasındaki birçok fonksiyonunu anlamada esastır. SC'nin merkezi bölgesinin genişliği sadece ~ 100 nm olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, bu boyuttaki bir yapı içindeki bileşenleri görselleştirmek, süper çözünürlüklü mikroskopi ile kolayca elde edilebilir. Gerçekten de, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), genleşme mikroskobu 20, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu 21 ve tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM)22,23, SC'nin moleküler mimarisini 16,24,25,26,27,28,29 türleri arasında incelemek için gerekli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. 30.
Çözünürlük sınırının üstesinden gelmek için, STED mikroskopisi, emisyon ışığının kırınım sınırlı noktasını, STED lazerden gelen çörek şeklindeki bir ışınla kaplamaya dayanır ve bu da teorik olarak nokta yayılma fonksiyonunu moleküler boyutlara kadar daraltır31,32. Bununla birlikte, biyolojik örnekler içinde STED tarafından pratik olarak elde edilebilen çözünürlük, xy33'te birkaç on nanometre aralığında kalmaktadır.
SMLM teknikleri ile biyolojik örneklerde daha da yüksek çözünürlük elde edilebilir. SMLM, mekansal olarak örtüşen floroforları zaman içinde ayırarak nesneleri alt kırınım seviyesinde çözmek için spesifik floroforların yanıp sönme özelliklerinden yararlanır. Numune daha sonra floroforların farklı alt kümelerini yakalamak için tekrar tekrar görüntülenir. Floroforların numune içindeki konumu daha sonra, nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) tüm görüntülerde elde edilen sinyallere takılmasıyla belirlenir ve bu da yapıları 15 nm 23,34'e kadar çözebilir.
Birlikte ele alındığında, lokalize görüntüler tüm floroforların konumlarını kodlar. SMLM'nin çözünürlüğü, etiketleme yoğunluğu ve floroforun yanıp sönen özellikleri ile belirlenir. Nyquist-Shannon kriterine göre, ortalama etiket-etiket mesafesinin iki katından daha az olan nesneleri güvenilir bir şekilde çözmek imkansızdır. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek bir etiketleme yoğunluğuna ihtiyaç vardır. C. elegans'taki SC için, genom düzenleme kullanılarak endojen proteinlerin belirli bölgelerine bağlı epitop etiketleri kullanılarak yüksek bir etiketleme yoğunluğu elde edilebilir. Epitop etiketleri daha sonra yüksek afiniteleri19,30 olan spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak yüksek yoğunlukta boyanabilir. Aynı zamanda, bireysel floroforların döngü süresi, mekansal olarak örtüşen floroforların aynı anda yakalanmamasını sağlayacak kadar kısa olmalıdır35.
Bu iki gereksinim nedeniyle, SC gibi büyük makromoleküler komplekslerin yapısını çözmek, yeterince fazla sayıda görüntünün görüntülenmesini gerektirir ve bu nedenle birkaç saat sürebilir. Uzun görüntüleme sürelerinin tuzağı, numunelerin sahnenin hareketi veya numune tamponu içindeki küçük akımlar nedeniyle sürüklenme eğiliminde olmasıdır; 10 nm mertebesindeki küçük hareketler bile nm çözünürlükte zararlıdır ve düzeltilmesi gerekir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan sapma düzeltme yöntemleri, sırayla görüntülenen iki kanalın görüntülerini doğru bir şekilde bindirmek için yeterince sağlam değildir36. Bu sorunludur, çünkü biyolojik sorular genellikle aynı numune içindeki birden fazla hedefin kesin tespitini ve lokalizasyonunu ister. Bu sorunları aşmak için, oranmetrik görüntüleme gibi yöntemler geliştirilmiştir. Oranmetrik görüntüleme, örtüşen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip çoklu floroforların eşzamanlı görüntülenmesine izin verir ve tespit edilen her sinyalin, spektral olarak farklı kanallardaki yoğunlukların oranına bağlı olarak kendi floroforuna atanmasını sağlar37,38.
Ek olarak, SC gibi makromoleküler komplekslerin organizasyonunu incelemek, üç boyutlu (3B) bilgi gerektirir. Üç boyutta (3D-SMLM) süper çözünürlük elde etmek için, yayılan ışığın optik yoluna, odak düzleminden uzaklığına bağlı olarak bir floroforun PSF'sinin şeklini bozan silindirik bir lens dahil edilmiştir. Bu nedenle, bir floroforun z-düzlemindeki kesin konumu, emisyon sinyali35,39'un şeklini analiz ederek tahmin edilebilir. SMLM'deki bu ilerlemeleri birleştirmek, SC de dahil olmak üzere makromoleküler komplekslerin 3D organizasyonunun görüntülenmesini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.5 oil objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
			<td>UPLAPO100XOHR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethylamine (MEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070-10G</td>
			<td>Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH&#160; 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional 640 nm booster laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37572</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647, NHS ester</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2-2.2.14</td>
			<td>Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HTP-3</td>
			<td>a gift from Abby F. Dernburg</td>
			<td>MacQueen et al., 2005</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain&#160; YKM349</td>
			<td>a gift from Yumi Kim</td>
			<td>Hurlock et al., 2020</td>
			<td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF6680, NHS ester</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92139</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 12 mm No. 1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular cover glass 24 mm No. 1.5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PK26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>Edgar 1995</td>
			<td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-chicken IgY</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340347</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>AB_2340761</td>
			<td>Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>7107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10%</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat )</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 
			50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging buffer base</td>
			<td>a gift from Jonas Ries</td>
			<td>Hoess, Mund, Reitberger, &#38; Ries, 2018</td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. 
			Aliquoted to a single-use volume (950 &#956;L), frozen, and kept at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.&#160; Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F47-702</td>
			<td>700/100 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (absolute for analysis)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>100 mM NaHCO3, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near-infrared fiber-coupled laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>IBEAM-SMART-PT-CD</td>
			<td>Custom Design, 808 nm - 75mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens piezo mount (PIFOC )</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-726.1.CD</td>
			<td>100 &#181;m travel range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Fusion BT sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C15440-20UP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673283</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline Buffer (PBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td>16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaPrep2 plasma cleaner</td>
			<td>GaLa Instrumente GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P2636-25MG</td>
			<td>0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary dichroic (illumination reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F73-866S</td>
			<td>quad bandpass @ 405, 488, 561, 640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadnotch filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F40-072</td>
			<td>405/488/561/640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrant photodiode (QPD)</td>
			<td>Laser Components</td>
			<td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Apollo Herkenrath Solinger</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractive beam shaper</td>
			<td>AdlOptica</td>
			<td>PiShaper 6_6_VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3)</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1110911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel removal box</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10002-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary dichroic (emission reflecting)</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F38-785S</td>
			<td>750 nm longpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>BSP01-785R-25</td>
			<td>&#160;750 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortwave channel emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F37-677</td>
			<td>&#160;676/37 nm bandpass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule localization microscope</td>
			<td>EMBL Imaging Centre</td>
			<td>Diekmann et al., 2020 with modifications</td>
			<td>The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera&#160; and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. 
			For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). 
			A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. 
			To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser&#160; from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. 
			For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-mode fiber-coupled multi-laser engine</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iCHROME MLE-LFA-HP</td>
			<td>Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitting dichroic</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>F48-665SG</td>
			<td>665 nm long pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square cover glass 22 x 22 mm No.1</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser; VWR</td>
			<td>630-2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR 635P, NHS ester</td>
			<td>Abberior</td>
			<td>ST635P-0002-1MG</td>
			<td>Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T1512-2G</td>
			<td>1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 &#176;C. 
			Thawed aliquot was kept at 4 &#176;C and used for several months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>&#160;0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>Kept at room temperature in original packaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormStuff worm pick</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>789277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage</td>
			<td>&#160;Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Column</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td>&#160;7K MWCO, 75 &#181;L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution microscopy of the synaptonemal complex within the caenorhabditis elegans germline

Mayoz sırasında, homolog kromozomlar doğru ayrışmalarına izin vermek için birbirlerini tanımalı ve birbirine yapışmalıdır. Homolog kromozomların etkileşimini güvence altına alan anahtar olaylardan biri, mayotik faz I'de sinaptonemal kompleksin (SC) birleşmesidir. Farklı türler arasında SC içindeki protein bileşenleri arasında çok az dizi homolojisi olmasına rağmen, SC'nin genel yapısı evrim sırasında oldukça korunmuştur. Elektron mikrograflarında, SC, yanal elemanlardan veya eksenlerden, enine filamentlerden ve merkezi bir elemandan oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı olarak görünür. 
Bununla birlikte, SC'nin moleküler yapısını belirlemek için kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonunu elektron mikroskobu ile kesin olarak tanımlamak zor olmaya devam etmektedir. Buna karşılık, floresan mikroskopi, kompleks içindeki bireysel protein bileşenlerinin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, SC sadece ~ 100 nm genişliğinde olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bu nedenle, SC'nin moleküler mimarisinin belirlenmesi, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu veya tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi süper çözünürlüklü ışık mikroskobu teknikleri gerektirir. 
SC içindeki bireysel bileşenlerin yapısını ve etkileşimlerini korumak için, kompleksi germ hücrelerindeki doğal ortamına yakın bir ortamda gözlemlemek önemlidir. Bu nedenle, SMLM ve STED mikroskobu ile sağlam, ekstrüde Caenorhabditis elegans germline dokusunda SC'nin alt yapısının incelenmesini sağlayan bir immünohistokimya ve görüntüleme protokolü sunuyoruz. Dokunun doğrudan kapak kapağına sabitlenmesi, görüntüleme sırasında numunelerin hareketini azaltır ve SC'nin altyapısını biyolojik bağlamında görselleştirmek için gereken yüksek çözünürlüğü elde etmek için numunedeki sapmaları en aza indirir.

SMLM ile C. elegans germline dokusu içindeki SC'yi görüntülemek için, kromozom eksenlerinin bir bileşeni olan HTP-3'ü ve enine filament SYP-5'in C-terminusunu bir hemaglutinin (HA) etiketi ile endojen olarak etiketlenmiş olarak lokalize etmek için 2 renk oranmetrik 3D-SMLM kullandık. Her iki proteinin de C. elegans'ın SC'si içindeki yeri daha önce diğer çalışmalarla16,30 olarak belirlenmişti.
Kalın biyolojik örneklerde bulunan ışık saçılımını ve optik sapmaları en aza indirmek için, SC'leri içeren mayotik çekirdeklerin en alttaki z bölümünü görüntüledik (Şekil 3, sarı çizgiler). Elde edilen her görüntü için, görüntüleme düzleminin piezo sahne konumu, hedef kapak kaymasına odaklandığında piezo sahne konumuna göre işaretlendi. Bu, piezo mesafesinin kapak fişinden hesaplanmasına izin verdi. Başarılı bir şekilde monte edilmiş numuneler, kapak kaymasına yakın bir yere istikrarlı bir şekilde tutturulur ve gonad şeklini korur (yani, postfiksasyon adımı sırasında doku iki kapak kayması arasında ezilmez). Numune montajının kalitesi stereo mikroskop altında kolayca değerlendirilebilir, çünkü iyi tutturulmuş gonadlar çözeltide herhangi bir hareket göstermez (adım 4.2.6). Bununla birlikte, montaj işleminin stokastikliği nedeniyle, gonad dokusu mutlaka kapak kayması üzerine tamamen düz bir şekilde yerleştirilmeyecektir. Bu nedenle, SC'leri içeren çekirdeklerin alt düzlemi, aynı gonad içindeki örtü kaymasına göre değişen mesafelerde bulunabilir.
Dokunun kapak kaymasına bağlanmasına bağlı olarak çözünürlüğün nasıl değiştiğini göstermek için, kapak kaymasına farklı piezo mesafelerinde görüntüler elde ettik. Tek bir görüntünün kalitesini değerlendirmek için, Fourier halka korelasyon (FRC) eğrileri50,51 hesaplandı ve çözünürlük, SMAP yazılımı48 içindeki FRCResolution eklentisi kullanılarak belirlendi. Kapak kaymasına farklı mesafelerde çekilen iki ayrı 3D-SMLM görüntüsünden çıkarılan iki temsili çekirdek Şekil 4'te gösterilmiştir. Örtü kaymasının yakınında bulunan SC'lerde, kromozom eksenleri ve SYP-5::HA'nın C-terminusu her üç boyutta da iyi bir şekilde çözülmüştür (Şekil 4A, kapak kaymasından 0.8 μm). Belirli bir mesafe ile ayrılmış iki yapıyı çözmek için, elde edilen FRC çözünürlüğü genellikle eksenel çözünürlükte bu mesafenin yarısından daha küçük olmalıdır.
Aynı yapıları yanal olarak ayırmak için, daha küçük FRC çözünürlük değerlerinin elde edilmesi gerekir. Gerçekten de, kapak fişine yakın bir yerde bulunan örneklerde, FRC çözünürlüğü AlexaFluor 647 kanalı için 38 nm ve CF680 kanalı için 34 nm'dir ve bu nedenle SYP-516'nın C-termini arasındaki beklenen 84 nm mesafenin çok altındadır. Bu nedenle bu karar, SC'nin organizasyonunu sadece cephede değil, aynı zamanda yanal görüşlerde de kolayca çözmektedir (Şekil 4B i,ii). Buna karşılık, ışık saçılması ve küresel sapmalar nedeniyle kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan SC'lerde çözünürlük bozulur (Şekil 4B). Bu mesafedeki FRC çözünürlükleri, SYP-5'in C-terminini tam olarak çözemeyen 47 nm (AlexaFluor 647) ve 41 nm'ye (CF680) düşer. Optik sapmalar yanal çözünürlüğü eksenel çözünürlükten daha ciddi şekilde bozduğundan, HTP-3 ve SYP-5 bantları artık kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan örneklerde yanal görünümün kesitinde net bir şekilde çözülmemektedir (Şekil 4B ii). Kapak kaymasından farklı piezo mesafelerinde elde edilen görüntülerin FRC çözünürlüğünün karşılaştırılması, görüntülenen dokunun kapak kaymasından 2 μm'den daha fazla olmaması gerektiğini ortaya koymuştur (Şekil 5). Bu sonuç, postfiksasyon adımının doğru bir şekilde uygulanmasının önemini vurgulamaktadır, bu sırada doku, kapak kaymasının poli-L-lizin kaplamasına başarılı bir şekilde çapraz bağlanmalıdır.
Başka bir süper çözünürlük tekniği ile elde edilebilir çözünürlüğü göstermek için, SC'leri TauSTED mikroskobu ile sabit bozulmamış germline dokusunda da görüntüledik. Şekil 6A, SC'nin önden görünümdeki çizgi profillerinden tahmin edildiği gibi, bu çalışmada elde edilen en yüksek ve en düşük çözünürlüğe sahip TauSTED görüntülerini göstermektedir (Şekil 6B). Her iki çekirdekte de, kromozom eksenlerinde HTP-3'ün iki lokalizasyon bandını ve merkezi bölgedeki SYP-5'in C-terminini çözebiliriz, bu da TauSTED'de bu optimize edilmiş protokolü kullanarak elde edilebilecek çözünürlüğün 84 nm'nin altında olduğunu göstermiştir. En uygun koşullar altında (Şekil 6A, üstte), C-termini SC'nin sadece 50 nm ile ayrılmış hafif eğimli görünümlerinde çözebiliriz (Şekil 6A, sarı dikdörtgen ve 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg"> Şekil 1: Caenorhabditis elegans'taki sinaptonemal kompleksin organizasyonunun şeması. Karikatür, C. elegans'taki SC'nin basitleştirilmiş bir yapısını, iki homolog kromozomu (gri) birbirine bağlayan bir yapıyı göstermektedir. Yapı ön, yanal ve kesitsel görünümlerde gösterilir. Kromozom eksenleri kırmızı çubuklar olarak görüntülenirken, enine filamentler camgöbeği içinde gösterilir. Enine filament proteinleri (C. elegans'ta SYP-1, 5, 6), iki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için merkezi bölgede kafa kafaya bir şekilde (camgöbeği bilyalı çubuk grafikleri) yönlendirilir. Eksenler ve enine filamentlerin C-termini arasındaki beklenen mesafeler belirtilmiştir. Kısaltma: SC = synaptonemal complex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg"> Şekil 2: Çalışmada kullanılan örnek preparatın illüstrasyonu . (A) Genç C. elegans yetişkinleri başlarına veya kuyruklarına (yeşil, kesikli çizgiler) diseke edilir ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. (B) Yöntemin bireysel adımları, gri oklarla bağlanmış grafiklerle gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenmesi; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; PBS = fosfat tamponlu salin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg"> Şekil 3: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ile gözlenebilen doku kesitinin yeri. Bütün bir montaj C. elegans gonadının dönen disk konfokal görüntüsünün MIP'si. Doku HTP-3 ve SYP-5'in C-terminali (SYP-5::HA) için boyandı ve kombine sinyal gri renkte gösterildi. Bireysel konfokal görüntüler, tüm gonadın bir görüntüsünü oluşturmak için Izgara / Koleksiyon dikiş Fiji eklentisi52 kullanılarak dikildi. İç kısım, SC'leri içeren en alttaki z-düzleminin xy görünümünü gösterir. Bu düzlemin lokalizasyonu, gonadın MIP görüntüsünde bir dikdörtgenle gösterilen doku bölümünün ortogonal görünümlerinde gösterilir (sarı çizgiler). Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: MIP = maksimum yoğunluk projeksiyonu; SC'ler = sinaptonemal kompleksler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg"> Şekil 4: HTP-3'ün tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ve SYP-5'in C-termini. (A,B) Sol: HTP-3 (kırmızı) için boyanmış pakiten çekirdeklerini gösteren SMLM görüntüleri ve SYP-5'in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) (ölçek çubuğu = 1 μm). Orta: A ve B'de belirtilen, her görüntünün altında karşılık gelen kesit görünümleriyle birlikte gösterilen ilgi çekici bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri (i, ii; ölçek çubuğu = 100 nm). SC'nin yakınlaştırılmış görüntülerdeki uzantıları, kromozom eksenlerini y eksenine paralel olarak yönlendirmek için döndürülür. Sağ: SC içindeki ilgili proteinlerin lokalizasyonunun grafiksel gösterimi, SC'nin şeklin merkezinde görüntülenen yakınlaştırılmış bölgelerdeki yönelimini tasvir eder. Kısaltmalar: SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi; SC = sinaptonemal kompleks. SMLM görüntülerini yeniden oluşturmak için ham veriler BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg"> Şekil 5: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi görüntülerinin Fourier halka korelasyon çözünürlüğü, görüntülenen z-düzleminin kapak kayması düzleminden uzaklığına bağlıdır. Renkli çizgiler, kapak kapağından farklı mesafelerde (renk çubuğuyla gösterildiği gibi) elde edilen görüntülerin FRC eğrilerini gösterir. FRC çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan 1/7 eşiği siyah yatay bir çizgi ile gösterilir. Girintiler, FRC çözünürlüğünün kapak fişinden piezo mesafesine bağımlılığını gösterir. Çizim, orijinal eğrilerin "ggplot2" paketindeki işlevlerle düzgünleştirildiği özel olarak yazılmış bir R komut dosyası (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) tarafından gerçekleştirildi. Kısaltmalar: FRC = Fourier halka korelasyonu; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. FRC eğrileri ve SMLM verileri BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla edinilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg"> Şekil 6: Floresan ömür boyu tabanlı bilgi (TauSTED) ile geliştirilmiş uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu, hem HTP-3 hem de SYP-5'in C-terminusu için iki lokalizasyon bandını çözer. (A) İki temsili TauSTED görüntüsü, HTP-3 (kırmızı) ve SYP-5'in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) için boyanmış pakiten çekirdeklerini, daha yüksek (üst) ve alt (alt) yapısal tanım (ölçek çubuğu = 1 μm) ile göstermektedir. Dikdörtgenler, SYP-5'in çözülmüş C-termini ile bölgeleri önden (beyaz) ve SC'nin hafif eğimli bir görünümü (sarı) ile işaretler. (B, C) HTP-3 (kırmızı) dağılımı ve TauSTED tarafından çözülen SYP-5 (camgöbeği) sinyalinin C-terminusu. SC'yi önden (B) veya hafif eğimli (C) görünümlerde içeren ilgili bölgelerin çizgi profilleri, yoğunluğu maksimum değere normalleştirilmiş tam çizgiler olarak gösterilir. Çizgi profilleri Fiji ImageJ kullanılarak oluşturulmuştur. B'deki kesikli çizgiler , her protein için ortalama verileri gösterir. C'deki kalın camgöbeği çizgisi , SYP-5'in C-termini arasındaki en kısa çözülmüş mesafeye sahip çizgi profiline karşılık gelir. Spesifik proteinleri hedef alan antikorlar arasındaki mesafeleri belirlemek için, çizgi profilleri (n = 9 (B), n = 7 (C)), özel olarak yazılmış bir R betiği (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) kullanılarak çift gaussianlar ile donatıldı. Ortalama mesafe ± standart sapma (B) ve minimum değeri kalın (C) olarak vurgulanan aralık sırasıyla her grafiğin üstünde gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. Çizilen çizgi profillerinin görüntülenen görüntüleri ve veri noktaları BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Video 1: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi edinimi. Floroforların uygun bir hızda yanıp söndüğünü gösteren video (50 kare gösterilir, ölçek çubuğu = 5 μm, 20 ms/kare). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: Veri analizi komut dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline at JoVE.com

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Sinaptonemal kompleks mayozun önemli bir bileşenidir. İşlevini incelemek için, süper çözünürlüklü mikroskobun inanılmaz derecede yararlı olduğu ortaya çıkan yapısını da anlamalıyız. Protokolümüzü, immün boyalı C.elegans gonadını, bozulmamış dokularda çözünürlüğü 30 nanometreye kadar iyileştirmeye yardımcı olan bir kapak kaymasına istikrarlı bir şekilde bağlamak için optimize ettik.Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopi deneylerinin tasarımı, sonraki analizler ve ayrıca verilerin yorumlanması oldukça zor olabilir ve en iyisi bir uzmanla birlikte kurulmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarda doktora öncesi bir araştırmacı olan Ivana Cavka olacak. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopi görüntülerinin elde edilmesi, MBL Görüntüleme Merkezi'nde optik mühendisi olan Rory Power tarafından da gösterilecek.NGM agar plakalarından yaşa uygun Caenorhabditis elegans solucanlarını toplayarak başlayın. Solucanları bir kapak kapağı üzerinde 30 mikrolitrelik bir EBTT damlasına aktarın. Solucanları ilave 30 mikrolitre EBTT ile yıkayın.Çözeltinin 30 mikrolitresini çıkarın ve kapak kayması üzerindeki solucanlarla 30 mikrolitrelik bir damla bırakın. Gonadı ekstrüzyon yapmak için solucanların kafalarını ve / veya kuyruklarını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın. Başarılı bir diseksiyonda, gonad dokusu solucan gövdesinin dışına tamamen ekstrüde edilecektir.Pipet, fiksatif çözeltinin 30 mikrolitresini, disseke edilmiş solucanların damlasına dönüştürür. Pipetleme ile karıştırın ve numuneleri bir dakika boyunca sabitlenmeye bırakın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak solucanları TBST ile doldurulmuş bir PCR tüpüne aktararak sabitlemeyi tam olarak bir dakika sonra durdurun.Ardından, disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürerek bir yıkama işlemi gerçekleştirin. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, solucanları 200 mikrolitre taze TBST'de yeniden askıya alın. Son yıkamadan sonra, solucanları 200 mikrolitre PBST'de yeniden askıya alın ve PCR tüpünü buzun üzerine yerleştirin.Disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 ila 100 mikrolitre soğuk metanol ekleyin, pipetle karıştırın ve numuneleri buz üzerinde 30 ila 60 saniye metanol içinde bırakın. Numuneleri 200 mikrolitre PBST ile iki kez yıkayın.Numuneleri eğirdikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, blokaj çözeltisini numunelere ekleyin ve 45 ila 60 dakika oda sıcaklığında tutun. Birincil antikorları, bloke edici tampondaki çalışma çözeltilerine karşı seyreltin. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürün, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve birincil antikor çözeltisinden 30 ila 50 mikrolitre ekleyin.Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka sonunda, numuneleri PBST'de üç kez yıkayın. Etiketli Fab prime iki parçayı blokaj tamponundaki çalışma çözeltilerine seyreltin.Üçüncü yıkamadan sonra, numuneleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı çıkarın ve ikincil antikor çözeltisinden 30 ila 50 mikrolitre ekleyin. Numuneyi karanlık bir odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika ila iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numuneleri beş ila 15 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.Lekeli örnekleri döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 mikrolitre PBST ekleyin ve lekeli solucanları bir kapak kapağına aktarın. Pipet, 5.7 ila 6.3 mikrolitre post-fiksatif çözeltiyi bir poli-l-lizin kapak kapağı üzerine yerleştirin.Piseke edilmiş solucanları aynı hacimde çıkarın ve poli-l-lizin kapak kayması üzerindeki fiksatif damlasına aktarın. Numuneyi küçük bir kapak kapağı ile örtün. Küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve numuneyi karanlık bir odada üç ila beş dakika sabitleyin.Numuneleri kuru buzda alüminyum bir blok üzerine yerleştirerek dondurun. En az 20 dakika sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak daha küçük kapak kapağını çıkarın. Kapak kapağını, yaklaşık 10 saniye boyunca eksi 20 santigrat derecede soğutulmuş buz gibi PBS veya metanol içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe batırın.Kapak kapağını PBST tamponuyla doldurulmuş altı delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. PBST'yi kuyudan çıkarın, taze PBST ekleyin ve numuneyi beş dakika bekletin. PBST ile bir kez daha yıkadıktan sonra, örnekleri görüntülemeye kadar dört santigrat derecede bırakın.Görüntülemeden önce, numune montajının kalitesini stereo mikroskop altında değerlendirin. Burada gösterilen ısmarlama numune tutucuyu kullanıyorsanız, manyetik halkayı parafilmle sarın, ardından bir mililitre görüntüleme tamponu hazırlayın. Altı kuyucuklu plakadan bir kapak kayması alın.Özel yapım tutucuya yerleştirin ve kapaklı kapağı tutucuya parafilm sarılı manyetik halka ile sabitleyin. Numunenin üstündeki manyetik halka tarafından oluşturulan odadaki görüntüleme tamponunu nazikçe pipetleyin ve odayı parafilm kullanarak kapatın. Numuneyi monte etmek için, temiz yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin.Daldırma yağına herhangi bir hava sokmadan, numune tutucuyu monte edilmiş numuneyle birlikte mikroskop aşamasına yavaşça yerleştirin. MicroManager 2 içindeki EMU eklenti penceresini kullanarak, kadran fotodiyotunda odak kilidi lazerinden gelen sinyal algılanana kadar piezo aşamasını hareket ettirin. Daldırma yağında hava kabarcıklarının bulunmadığını doğrulamak için 640 nanometre uyarılmada bir lazerle daha düşük güçte bir arka odak düzlemi görüntüsü elde edin.Parlak alan aydınlatmasını kullanarak gonad dokusunu lokalize edin. 640 nanometrede düşük yoğunluklu bir aydınlatma kullanarak, birçok sinaptonemal kompleks içeren doku bölümüne odaklanın. Uygun bir yanıp sönme hızı elde edilene kadar numuneyi 640 nanometrede aydınlatma ile yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek ışımada maruz bırakmaya devam edin.MicroManager 2'deki çok boyutlu alma aracını kullanarak 20 milisaniyelik pozlama süresine sahip 200.000 kare elde edin. Bu arada, istenen yanıp sönme hızını korumak için EMU eklentisinin etkinleştirme seçeneğini kullanarak UV aktivasyonunu ayarlayın. Sinaptonemal kompleksler içeren mayotik çekirdeklerin en alt düzlemi, HTP-3 ve SYP-5 boyaması kullanılarak bir Caenorhabditis elegans gonad içinde görselleştirildi.SYP-5 HA'nın C-terminüsündeki kromozom eksenleri, kapak kaymasına yakın bulunan sinaptonemal komplekslerde her üç boyutta da iyi çözülmüştür. Bununla birlikte, ışık saçılması ve küresel sapmalar nedeniyle örtü kaymasından beş mikrometre uzaklıkta bulunan sinaptonemal komplekslerde çözünürlük bozulur. Örtü kaymasından farklı piezo mesafelerinde elde edilen görüntüler, görüntülenen dokunun örtü kaymadan iki mikrometreden daha fazla olmaması gerektiğini ortaya koymuştur.Numune hazırlama protokolü TauSTED mikroskopisi ile de kullanılabilir. Optimize edilmiş numune hazırlama ile, kromozom eksenlerindeki HTP-3 ve merkezi bölgedeki SYP-5'in C-termini, önden görünümde ve hafif eğimli görünümde çözüldü. En iyi çözünürlüğü elde etmek için, gonadlar, sinaptonemal komplekslerin kapak kaymasından iki mikrometreden fazla olmamasını sağlamak için kapak kaymasına sıkıca çapraz bağlanmalıdır.Bu protokolü sadece tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu için değil, aynı zamanda uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu için de kullanıyoruz. Diğer süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri için de yararlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...