Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL148068-04 و R44ES027703-02 (TJH).

تمت الموافقة على استخدام hiPSC في هذا البروتوكول من قبل لجنة HPSCRO بجامعة ميشيغان (لجنة الإشراف على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات). انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات. انظر الجدول 1 للاطلاع على الوسائط ومؤلفاتها.
1. إذابة الجليد وال?...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

هناك عدة طرق مختلفة لفحص سمية القلب في المختبر باستخدام hiPSC-CMs. قدمت ورقة "أفضل الممارسات" الأخيرة حول استخدام hiPSC-CMs المقايسات المختلفة في المختبر ، وقراءاتها الأولية ، والأهم من ذلك ، دقة كل فحص لتحديد وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب البشري20. بالإضافة إلى استخدام ?...

تم التحقق من صحة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) على نطاق دولي ، وهي متاحة لفحص السمية القلبية في المختبر 1. يمكن إنشاء hiPSC-CMs عالية النقاء بأعداد غير محدودة تقريبا ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها. عند إعادة الطلاء ، يقومون أيضا بإعادة التنشيط ويبدأون في التعاقد مع إيقاع يذكرنا بقلب الإنسان 2,3. ومن اللافت للنظر أن hiPSC-CMs الفردية تتزاوج مع بعضها البعض وتشكل تخليقية وظيفية تنبض كنسيج واحد. في الوقت الحاضر ، يتم اشتقاق hiPSCs بشكل روتيني من عينات دم المريض ، لذلك يمكن تمثيل أي شخص باستخدام فحوصات فحص السمية القلبية hiPSC-CM في المختبر 4,5. هذا يخلق الفرصة لإجراء "التجارب السريرية في طبق" ، مع تمثيل كبير من مجموعات سكانية متنوعة6.
تتمثل إحدى المزايا الحاسمة على مناهج فحص السمية القلبية للخلايا الحيوانية والحيوانية الحالية في أن hiPSC-CMs تستخدم الجينوم البشري الكامل وتقدم نظاما في المختبر مع أوجه تشابه وراثية مع قلب الإنسان. هذا جذاب بشكل خاص لعلم الصيدلة الجيني والطب الشخصي - من المتوقع أن يوفر استخدام hiPSC-CMs للأدوية وتطوير العلاجات الأخرى وصفات أدوية أكثر دقة ودقة وأمانا. في الواقع ، أثبتت فحوصات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) hiPSC-CM أنها تنبئ بسمية القلب للأدوية ، باستخدام لوحة من الأدوية المستخدمة سريريا مع خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب1،7،8،9. على الرغم من الإمكانات الهائلة ل hiPSC-CMs والوعد بتبسيط وجعل تطوير الأدوية أرخص ، كان هناك إحجام عن استخدام هذه المقايسات الجديدة10،11،12.
حتى الآن ، فإن أحد القيود الرئيسية على التبني والقبول الواسع النطاق لفحوصات فحص hiPSC-CM هو مظهرها غير الناضج الشبيه بالجنين ، فضلا عن وظيفتها. تمت مراجعة ومناقشة القضية الحرجة لنضج hiPSC-CM في الأدبيات العلمية ad nauseum13،14،15،16. وبالمثل ، تم استخدام العديد من الأساليب لتعزيز نضوج hiPSC-CM ، بما في ذلك التلاعب بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) في أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد وتطوير أنسجة القلب المهندسة ثلاثية الأبعاد (EHTs) 17،18. في الوقت الحالي ، هناك اعتقاد سائد على نطاق واسع بأن استخدام 3D EHTs سيوفر نضجا فائقا مقارنة بالنهج القائمة على 2D أحادية الطبقة. ومع ذلك ، توفر الطبقات الأحادية 2D كفاءة أعلى لاستخدام الخلايا وزيادة النجاح في الطلاء مقارنة ب 3D EHTs ؛ تستخدم 3D EHTs أعدادا أكبر من الخلايا ، وغالبا ما تتطلب إدراج أنواع أخرى من الخلايا يمكن أن تربك النتائج. لذلك ، في هذه المقالة ، ينصب التركيز على استخدام طريقة بسيطة لنضج hiPSC-CMs المستزرعة كطبقة أحادية 2D من الخلايا المقترنة كهربائيا وميكانيكيا.
يمكن تحقيق نضج hiPSC-CM المتقدم في أحادي الطبقات 2D باستخدام ECM. يمكن نضج الطبقات الأحادية 2D من hiPSC-CMs باستخدام غطاء بوليديميثيل سيلوكسان ناعم ومرن ، مطلي بمصفوفة غشاء قاعدي تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM). في عام 2016 ، أظهرت التقارير أن hiPSC-CMs المستزرعة على حالة ECM الناعمة هذه نضجت وظيفيا ، حيث أظهرت سرعات توصيل جهد الفعل بالقرب من قيم قلب البالغين (~ 50 سم / ثانية) 18. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه hiPSC-CMs الناضجة العديد من الخصائص الكهربية الأخرى التي تذكرنا بقلب البالغين ، بما في ذلك إمكانات غشاء الراحة المفرط الاستقطاب والتعبير عن Kir2.1. في الآونة الأخيرة ، حددت التقارير طلاء ECM البشري المشتق من الخلايا الجذعية في الفترة المحيطة بالولادة والذي يعزز النضج الهيكلي ل 2D hiPSC-CMs19. هنا ، يتم تقديم طرق سهلة الاستخدام لأحادية الطبقات 2D hiPSC-CM الناضجة هيكليا لاستخدامها في الشاشات الكهربية عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، نقدم التحقق من صحة أداة رسم الخرائط الضوئية للاكتساب والتحليل الآلي لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الطبقة 2D hiPSC-CM ، باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والمجسات والبروتينات الحساسة للكالسيوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

تستخدم الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) لتحل محل وتقليل الاعتماد على الحيوانات والخلايا الحيوانية لاختبار السمية القلبية قبل السريرية. في تنسيقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد ، تلخص hiPSC-CMs بنية ووظيفة خلايا عضلة القلب البشرية البالغة عند زراعتها على مصفوفة مثالية خارج الخلية (ECM). ينضج ECM المشتق من الخلايا الجذعية البشرية في الفترة المحيطة بالولادة (مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج) هيكل hiPSC-CM ووظيفته وحالة التمثيل الغذائي في 7 أيام بعد الطلاء. 
تستجيب أحاديات الطبقة الناضجة hiPSC-CM أيضا كما هو متوقع للأدوية ذات الصلة سريريا ، مع وجود خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية. كان نضوج الطبقات الأحادية hiPSC-CM عقبة أمام الاعتماد الواسع النطاق لهذه الخلايا القيمة للعلوم التنظيمية وفحص السلامة ، حتى الآن. تقدم هذه المقالة طرقا تم التحقق من صحتها للطلاء والنضج والتنميط الظاهري الوظيفي عالي الإنتاجية لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية والانقباض hiPSC-CM. تنطبق هذه الطرق على خلايا عضلة القلب النقية المتاحة تجاريا ، وكذلك خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي يتم إنشاؤها داخليا باستخدام بروتوكولات تمايز عالية الكفاءة خاصة بالغرفة. 
يتم قياس وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية عالية الإنتاجية باستخدام إما الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs ؛ الانبعاثات: 488 نانومتر) ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs) ، أو مستشعرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GCaMP6). يتم استخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية للتسجيلات البصرية لكل معلمة وظيفية ، ويتم استخدام برنامج مخصص مخصص لتحليل البيانات الكهربية. يتم تطبيق بروتوكولات MECM لفحص الأدوية باستخدام مؤثرات إينوتروب إيجابية (إيزوبرينالين) وحاصرات خاصة بقناة الجينات البشرية المرتبطة بالأثير (hERG). ستمكن هذه الموارد الباحثين الآخرين من الاستفادة بنجاح من hiPSC-CMs الناضجة لفحص السمية القلبية قبل السريرية عالي الإنتاجية واختبار فعالية أدوية القلب وأبحاث القلب والأوعية الدموية.

يتميز نضوج hiPSC-CM بتباين الطور والتصوير المناعي البؤري يتم عرض الجدول الزمني للنضج بوساطة ECM ل hiPSC-CMs المتاحة تجاريا باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM في الشكل 1A. يتم جمع هذه البيانات باستخدام خلايا عضلة القلب المتاحة تجاريا والتي تصل إلى المختبر كقوارير محفوظة بالتب...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

توفر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) بديلا لاستخدام الحيوانات لفحص السمية القلبية قبل السريرية. من القيود المفروضة على التبني الواسع النطاق ل hiPSC-CMs في فحص السمية قبل السريرية هو النمط الظاهري غير الناضج الذي يشبه الجنين للخلايا. تظهر هنا بروتوكولات للنضج القوي والسريع ل hiPSC-CMs.

فحص السمية القلبية عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات الخلايا العضلية القلبية الناضجة المستحثة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن الباحثين من إنضاج hiPSC-CMs التجارية أو المصنوعة داخليا إلى نمط ظاهري يشبه البالغين يحسن بشكل كبير القيمة التنبؤية ل hiPSC-CMs في فحص السمية القلبية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يوفر hiPSC-CMs ناضجة بتنسيق عالي الإنتاجية لرسم الخرائط البصرية للكالسيوم أو تغيير الجهد. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في آليات المرض أو لفحص الأدوية بحثا عن السمية القلبية.سيوضح الإجراء جيفري كريش ، وهو باحث مشارك من مختبري. ابدأ بغسل المصفوفة خارج الخلية التي تحفز النضج ، أو MECM ، مرتين مع 200 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، قبل 1 ساعة من طلاء عضلة القلب. حافظ على رطوبة الآبار.انقل أنابيب عضلة القلب من خزان النيتروجين السائل إلى الثلج الجاف ، وحرر الضغط عن طريق فتح أغطية الأنبوب قليلا. بعد ذلك ، أعد إغلاق أغطية الأنبوب وقم بإذابتها في حمام مائي لمدة 4 دقائق. بعد ذوبان الخلايا ، قم برش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل فتحها.نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر مع ماصة 1 ملليلتر. أضف 1 ملليلتر من وسط الطلاء إلى cryovial وانقل الغسيل إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر. ثم ، بالتنقيط ببطء 1 ملليلتر من وسط الطلاء وتحريك الأنبوب.كرر هذا حتى نقل 8 ملليلتر من وسط الطلاء. أجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 ملليلتر في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 1 ملليلتر من وسط الطلاء. قم بإزالة القسمة ، وقم بإجراء عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم قبل إضافة وسيط طلاء للحصول على 7.5 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 96 بئر المغلفة MECM باستخدام ماصة متعددة القنوات ، واحتضان الخلايا لمدة 2 أيام. بعد ذلك ، استبدل الوسيط ب 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة ، وحافظ على الألواح لمدة 7 أيام ، مع تغيير الوسيط في اليوم 5. في اليوم 7 ، قم بإجراء فحص EP ، كما هو موضح في النص.تأكد من تغيير الوسيط كل يوم عند اختيار توسيع ثقافة الخلية. لتنقية hiPSC-CM عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ، أو MACS ، قم بشفط وسط زراعة الخلايا وغسل الخلايا ب 1 ملليلتر من HBSS-ثم ، قم بفصل الخلايا عن طريق إضافة 1 ملليلتر من 0.25٪ تربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك ، أو EDTA ، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق. ثم قم بتعطيل التربسين / EDTA عن طريق إعادة إرسال الخلايا وتفردها ب 2 ملليلتر من وسط الطلاء.من الآبار الستة ، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر باستخدام مصفاة 70 ميكرومتر. بعد غسل المصفاة ب 3 ملليلتر من وسط الطلاء ، عد الخلايا. بعد العد ، قم بالطرد المركزي وغسل حبيبات الخلية ب 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد قبل التكوير وإعادة إرسال الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 10 إلى الخلايا السادسة.أضف 20 ميكرولترا من كوكتيل استنفاد الخلايا العضلية الباردة غير القلبية واخلط التعليق قبل الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد غسل الخلايا ب 4 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. أضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات الباردة المضادة للبيوتين لكل 5 × 10 إلى الخلايا السادسة ، وامزج تعليق الخلية برفق قبل الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق.أثناء احتضان العينات ، ضع أعمدة الاستنفاد الموجبة المزودة بمرشحات ما قبل الفصل 30 ميكرومتر على فاصل MACS ، وضع أنابيب التجميع الموسومة 15 ملليلتر أسفل الأعمدة. بعد ذلك ، قم بتجهيز كل عمود ب 3 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. امزج معلق الخلية المعالج بالأجسام المضادة مع 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS وأضفه إلى العمود.أضف 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS إلى كل عمود واجمع 12 ملليلتر من تعليق خلايا عضلة القلب المتدفقة. الطرد المركزي للخلايا العضلية القلبية وتجاهل المادة الطافية قبل تعليق خلايا عضلة القلب في وسط طلاء 1 ملليلتر. لتحديد التركيز ، عد الخلايا واضبط الحجم على كثافة البذر المطلوبة قبل طلاء خلايا عضلة القلب المنقاة على ألواح MECM 96-well.نضح واستبدل وسط صيانة خلايا عضلة القلب ب 100 ميكرولتر من الأصباغ الحساسة للجهد ، أو VSD ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم ، أو CSF ، لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، استبدل الأصباغ بوسيط فحص أو HBSS. قم بموازنة الخلايا عند 37 درجة مئوية قبل الحصول على رسم الخرائط الضوئية لبيانات خط الأساس باستخدام جهاز رسم خرائط بصري عالي الإنتاجية.لعلاج الخلايا بالأدوية لاختبار التعرض الحاد أو رسم خريطة للخلايا المعرضة بشكل مزمن للعقاقير ذات الأهمية ، قم بتخفيف الأدوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO ، وتخزينها كمحاليل مخزون عند 20 درجة مئوية قبل تخفيفها في HBSS إلى التركيزات المطلوبة. لاختبار السمية القلبية في 96 لوحة بئر ، أضف أربع جرعات من مركب يحتوي على ثمانية آبار على الأقل لكل جرعة. استخدم جرعات تتراوح من أقل إلى أعلى من تركيز البلازما العلاجية الفعالة سريريا ، بما في ذلك الجرعة الفعالة.على غرار قياسات الفيزيولوجيا الكهربية الأساسية قبل تطبيق الدواء ، التقط تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية بعد 30 دقيقة على الأقل من العلاج الدوائي للدراسات المزمنة. بعد التسجيلات الأساسية ، ضع أربع جرعات على الأقل من كل دواء على طبقات أحادية hiPSC-CMs الناضجة التي تعبر عن GCaMP6m ، مع ثمانية آبار على الأقل لكل جرعة. قم بموازنة الأدوية على الخلايا لمدة 30 دقيقة ، وقم بتسخين الخلايا إلى 37 درجة مئوية قبل وأثناء الحصول على البيانات.بعد التسجيلات الأساسية للوحة بأكملها ، أضف 500 نانومولار إيزوبروتيرينول إلى كل بئر لتمكين بيانات استجابة قوية للأدوية وتحديد آثار الأيزوبروتيرينول على معدل ضربات أحادي الطبقة ، وسعة الانكماش ، ومدة الكالسيوم العابرة. للحصول على بيانات الخرائط الضوئية ، افتح الدرج الأمامي وضع اللوحة على سخان اللوحة. بعد فتح برنامج الاستحواذ وتحديد موقع حفظ الملف في البرنامج ، حدد مدة 10 إلى 30 ثانية ومعدل الإطارات للاكتساب للحصول على دقة زمنية أعلى ، وانقر فوق بدء الاستحواذ.افتح برنامج التحليل، وفي علامة التبويب استيراد عامل تصفية، حدد إما الاستعراض بحثا عن ملف واحد أو تجانب متعدد لإعادة إنشاء لوحة. حدد الملفات وأدخل عددا من الصفوف والأعمدة وحدد تلقائي. بعد ذلك ، حدد تحديث حجم البكسل ، وأدخل المسافة لكل بكسل ، واستخدم معالج البئر لتحديد موقع الآبار في الصورة قبل النقر فوق عملية حفظ والانتقال إلى علامة التبويب التالية.افتح علامة التبويب عائد الاستثمار ، أو مناطق الاهتمام ، واختر رسم عائد الاستثمار يدويا أو تلقائيا أو عدم استخدام عائد الاستثمار على الإطلاق ، والذي سيتم أخذه في الاعتبار لتحليل اللوحة بأكملها. بعد تحديد المنطقة في البئر ، انقر فوق حفظ العملية زر للانتقال إلى الخطوة التالية. حدد مربعات إخفاء الآبار وإظهار المربعات التي تمت تصفيتها فقط لتصور عائد الاستثمار.افتح علامة التبويب التحليل ، وحدد كل بئر أو عائد استثمار لتأكيد دقة الكشف التلقائي عن النبض. قم بإضافة أو إزالة النبضات من الآثار عن طريق تحديد إيقاع فردي والضغط على حذف على لوحة المفاتيح. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق حفظ.بعد ذلك ، انقر فوق الزر Time-Space Plot في علامة التبويب Analysis وأضف السطر لتحديد مخطط الزمان والمكان لتصور البيانات لكل بئر أو عائد الاستثمار. بعد تحديد خط أفقي أو رأسي ، انقر فوق إنشاء مؤامرة. بعد التأكد من الكشف الدقيق عن الإيقاع ، انتقل إلى تصدير علامة التبويب وحدد تنسيق الملف ، أدخل خيار Beat Statistic قبل النقر فوق تصدير.بمجرد التصدير ، افتح ملفات البيانات وقم بتشغيل روتين التحليل الإحصائي المختار. أظهر تصوير تباين الطور أن hiPSC-CMs المطلية على MECM قد نضجت وأصبحت متميزة هيكليا عن نفس المجموعة من hiPSC-CMs المعاد طلاؤها على الماوس ECM. أصبحت الخلايا الناضجة على شكل قضيب ، بينما احتفظت الخلايا غير الناضجة بشكل دائري.أظهرت خلايا عضلة القلب الملطخة بالأجسام المضادة ألفا أكتينين الشكل النموذجي للخلايا المزروعة في كل حالة ECM. تمشيا مع تلطيخ TnI ، أشار تلطيخ ألفا أكتينين إلى أن hiPSC-CMs الناضجة على MECM عززت النمط الظاهري الناضج على شكل قضيب وحفزت تنظيما أكبر للقطعة العضلية. كان محتوى الميتوكوندريا ونشاطها متميزين بين الخلايا المزروعة على ECM للفأر و MECM.أظهرت البيانات الفيزيولوجية الكهربية لجهود الفعل المسجلة باستخدام VSDs ونظام رسم الخرائط الضوئية أن الخلايا الخاصة بالأذين لها معدل ضربات تلقائي أسرع بكثير ومدة جهد عمل أقصر ، أو APD80 ، من الخلايا الخاصة بالبطين. كشفت الخرائط الحرارية للوحة الكاملة لمعلمات مثل APD80 عن قابلية استنساخ معلمة معينة داخل اللوحة. أشارت إمكانات العمل النموذجية للطبقات الأحادية hiPSC-CM الناضجة إلى مورفولوجيا جهد العمل لخلايا عضلة القلب البالغة المعزولة والمختبرة.كما تم عرض إيقاع عفوي محتمل نموذجي. استجابة للأيزوبروتيرينول ، تسبب تنشيط مستقبلات بيتا 1 الأدرينالية في كرونوتروبي إيجابي ، مؤثر في التقلص العضلي الإيجابي ، و lusitropy الإيجابي. تمت دراسة استجابة HiPSC-CM للجين البشري المرتبط بالأثير ، أو hERG ، مانع القناة ، بما في ذلك E-4031 ، ودومبيريدون ، وفاندتانيب ، وسوتالول ، باستخدام مضان الكالسيوم GCaMP6m لمراقبة الإيقاع.أظهرت الدراسة الكشف المبكر عن إزالة الاستقطاب بعد حصار قناة E-4031 hERG. اعمل بسرعة مع الخلايا المعلقة وتجنب إجهاد القص عن طريق سحب الخلايا برفق. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء تغيير الوسائط بعناية لتجنب إتلاف الخلايا المخلوية hiPS.بعد هذا الإجراء ، تكون الخلايا قابلة للبروتين والحمض النووي الريبي والحمض النووي وجمع الدهون للتحليل باستخدام التقنية المفضلة للباحثين. تمكن هذه التقنية الباحثين من التحقيق في الأمراض واختبار السمية القلبية للعقاقير الجديدة باستخدام خلايا عضلية قلبية تشبه البالغين.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

رقاقة كبيبات الكلى متساوية المنشأ المصممة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

تقييم علاج تعديل انقباض القلب في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية 2D

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...