Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet af NIH-tilskud HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).

hiPSC-brug i denne protokol blev godkendt af University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialetabellen for en liste over materialer og udstyr. Se tabel 1 for medier og deres sammensætning.
1. Optøning og plettering kommercielt tilgængelige kryopræserverede hiPSC-CM'er til modning på en modningsinducerende ekstracellulær matrix (MECM)
<ol><li>Alle reagenserne opvarmes til stuetempera...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Der er flere forskellige tilgange til in vitro kardiotoksicitet screening ved hjælp af hiPSC-CMs. Et nyligt "Best Practices" -papir om brugen af hiPSC-CM'er præsenterede de forskellige in vitro-assays , deres primære aflæsninger og vigtigst af alt hvert assays granularitet til kvantificering af human hjerteelektrofysiologisk funktion20. Ud over at bruge membranpiercingelektroder tilvejebringes det mest direkte mål for menneskelig hjerteelektrofysiologisk funktion af VSD'er. ...

Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er blevet valideret på internationalt plan og er tilgængelige til in vitro kardiotoksicitetsscreening1. Meget rene hiPSC-CM'er kan genereres i næsten ubegrænset antal, kryopræserveres og optøes. Efter genplettering genoplives de også og begynder at trække sig sammen med en rytme, der minder om det menneskelige hjerte 2,3. Bemærkelsesværdigt parrer individuelle hiPSC-CM'er sig til hinanden og danner funktionel syncytia, der slår som et enkelt væv. I dag er hiPSC'er rutinemæssigt afledt af patientens blodprøver, så enhver person kan repræsenteres ved hjælp af in vitro hiPSC-CM kardiotoksicitetsscreeningsassays 4,5. Dette skaber mulighed for at udføre "kliniske forsøg i en skål" med betydelig repræsentation fra forskellige populationer6.
En kritisk fordel i forhold til eksisterende dyre- og dyrecellekardiotoksicitetsscreeningsmetoder er, at hiPSC-CM'er udnytter det fulde humane genom og tilbyder et in vitro-system med genetiske ligheder med det menneskelige hjerte. Dette er især attraktivt for farmakogenomik og personlig medicin - brugen af hiPSC-CM'er til medicin og anden terapiudvikling forventes at give mere nøjagtige, præcise og sikre medicinrecepter. Faktisk har todimensionelle (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist sig at være prædiktive for medicinsk kardiotoksicitet ved hjælp af et panel af klinisk anvendte lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier 1,7,8,9. På trods af det enorme potentiale i hiPSC-CM'er og løftet om at strømline og gøre lægemiddeludvikling billigere, har der været en modvilje mod at bruge disse nye assays10,11,12.
Indtil nu er en væsentlig begrænsning af udbredt vedtagelse og accept af hiPSC-CM-screeningsassays deres umodne, fosterlignende udseende såvel som deres funktion. Det kritiske spørgsmål om hiPSC-CM-modning er blevet gennemgået og debatteret i den videnskabelige litteratur ad nauseum13,14,15,16. Ligeledes er der anvendt mange tilgange til at fremme hiPSC-CM-modning, herunder ekstracellulær matrix (ECM) manipulationer i 2D-monolag og udvikling af 3D-manipulerede hjertevæv (EHT'er)17,18. I øjeblikket er der en udbredt tro på, at brugen af 3D EHT'er vil give overlegen modning i forhold til 2D-monolagsbaserede tilgange. Imidlertid giver 2D-monolag en højere effektivitet af celleudnyttelse og øget succes med plettering sammenlignet med 3D EHT'er; 3D EHT'er bruger et større antal celler og kræver ofte inkludering af andre celletyper, der kan forvirre resultaterne. Derfor er fokus i denne artikel på at bruge en simpel metode til at modne hiPSC-CM'er dyrket som 2D-monolag af elektrisk og mekanisk koblede celler.
Avanceret hiPSC-CM-modning kan opnås i 2D-monolag ved hjælp af en ECM. 2D-monolagene af hiPSC-CM'er kan modnes ved hjælp af en blød, fleksibel polydimethylsiloxan-coverslip, belagt med kældermembranmatrix udskilt af en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (muse-ECM). I 2016 viste rapporter, at hiPSC-CM'er dyrket på denne bløde ECM-tilstand modnes funktionelt og viser aktionspotentielle ledningshastigheder nær voksne hjerteværdier (~ 50 cm / s)18. Desuden viste disse modne hiPSC-CM'er mange andre elektrofysiologiske egenskaber, der minder om det voksne hjerte, herunder hyperpolariseret hvilemembranpotentiale og ekspression af Kir2.1. For nylig identificerede rapporter en human perinatal stamcelleafledt ECM-belægning, der fremmer strukturel modning af 2D hiPSC-CM'er19. Her præsenteres brugervenlige metoder til strukturelt modne 2D hiPSC-CM-monolag til brug i elektrofysiologiske skærme med høj kapacitet. Desuden leverer vi validering af et optisk kortlægningsinstrument til automatiseret erhvervelse og analyse af 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funktion ved hjælp af spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er) og calciumfølsomme sonder og proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Human inducerede stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) anvendes til at erstatte og reducere afhængigheden af dyr og dyreceller til præklinisk kardiotoksicitetstestning. I todimensionelle monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CM'er strukturen og funktionen af de voksne menneskelige hjertemuskelceller, når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrix (ECM). En human perinatal stamcelleafledt ECM (modningsinducerende ekstracellulær matrix-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funktionen og metabolisk tilstand på 7 dage efter plettering. 
Modne hiPSC-CM-monolag reagerer også som forventet på klinisk relevante lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier og kardiotoksicitet. Modningen af hiPSC-CM-monolag var en hindring for den udbredte anvendelse af disse værdifulde celler til lovgivningsmæssig videnskab og sikkerhedsscreening indtil nu. Denne artikel præsenterer validerede metoder til plettering, modning og funktionel fænotypning med høj kapacitet af hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funktion. Disse metoder gælder for kommercielt tilgængelige oprensede kardiomyocytter samt stamcelleafledte kardiomyocytter, der genereres internt ved hjælp af meget effektive, kammerspecifikke differentieringsprotokoller. 
Elektrofysiologisk funktion med høj kapacitet måles ved hjælp af enten spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er; emission: 488 nm), calciumfølsomme fluoroforer (CSF'er) eller genetisk kodede calciumsensorer (GCaMP6). En optisk kortlægningsenhed med høj kapacitet bruges til optiske optagelser af hver funktionel parameter, og brugerdefineret dedikeret software bruges til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller anvendes til medicinscreening ved hjælp af en positiv inotrop (isoprenalin) og human Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanalspecifikke blokkere. Disse ressourcer vil gøre det muligt for andre efterforskere med succes at udnytte modne hiPSC-CM'er til screening med høj gennemstrømning, præklinisk kardiotoksicitet, hjertemedicineffektivitetstest og kardiovaskulær forskning.

hiPSC-CM-modning karakteriseret ved fasekontrast og immunofluorescerende konfokal billeddannelse Tidslinjen for ECM-medieret modning af kommercielt tilgængelige hiPSC-CM'er ved hjælp af MECM-belagte 96-brøndsplader er vist i figur 1A. Disse data indsamles ved hjælp af kommercielt tilgængelige kardiomyocytter, der ankommer til laboratoriet som kryopræserverede hætteglas med celler. Hvert hætteglas indeholder >5 × 106 levedygtige kardiomyocytter. Cellern...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) tilbyder et alternativ til at bruge dyr til præklinisk kardiotoksicitetsscreening. En begrænsning for den udbredte anvendelse af hiPSC-CM'er i præklinisk toksicitetsscreening er cellernes umodne, føtallignende fænotype. Her præsenteres protokoller for robust og hurtig modning af hiPSC-CM'er.

Kardiotoksicitetsscreening med høj kapacitet ved hjælp af modne humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytmonolag

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Denne protokol er vigtig, fordi den gør det muligt for forskere at modne kommercielle eller internt fremstillede hiPSC-CM'er til en voksenlignende fænotype, der signifikant forbedrer den prædiktive værdi af hiPSC-CM'er i kardiotoksicitetsscreening. Den største fordel ved denne protokol er, at den leverer modne hiPSC-CM'er i et højt gennemstrømningsformat til optisk kortlægning af calcium eller spændingsændring. Denne protokol kan bruges til at undersøge sygdomsmekanismer eller til at screene lægemidler for kardiotoksicitet.Demonstration af proceduren vil være Jeffrey Creech, en forskningsassistent fra mit laboratorium. Begynd med at vaske den modningsinducerende ekstracellulære matrix eller MECM-plader to gange med 200 mikroliter Hanks afbalancerede saltopløsning eller HBSS 1 time før kardiomyocytbelægning. Hold brøndene hydreret.Overfør kardiomyocytrørene fra væskenitrogentanken til tøris, og slip trykket ved let at åbne rørhætterne. Derefter forsegles rørhætterne igen og optø dem i vandbadet i 4 minutter. Efter optøning af cellerne sprøjtes rørene med 70% ethanol, inden de åbnes.Overfør cellerne til 15 ml koniske rør med en 1 ml pipette. Tilsæt 1 ml pletteringsmedium til kryoialen og overfør vasken til det 15 ml koniske rør. Dryp derefter langsomt 1 ml pletteringsmedium og omrør røret.Gentag dette indtil overførslen af 8 ml pletteringsmedium. Centrifuger 15 ml røret ved 300 x g i 5 minutter og resuspender pelleten i 1 ml af pletteringsmediet. Fjern en delprøve, og udfør levende celletælling med et hæmocytometer, før du tilføjer et pletteringsmedium for at opnå 7,5 x 10 til de 5. celler pr. Milliliter.Der dispenseres 100 mikroliter cellesuspension pr. hul i en MECM-belagt plade med 96 brønde ved hjælp af en multikanalpipette, og cellerne inkuberes i 2 dage. Udskift derefter mediet med 200 mikroliter vedligeholdelsesmedium, og vedligehold pladerne i 7 dage med en ændring af medium på dag 5. På dag 7 skal du udføre EP-analyse som beskrevet i teksten.Sørg for at skifte medie hver anden dag, når du vælger at udvide cellekulturen. For at rense hiPSC-CM via magnetisk aktiveret cellesortering eller MACS skal du aspirere cellekulturmediet og vaske cellerne med 1 ml HBSS-Derefter adskilles cellerne ved at tilsætte 1 milliliter 0.25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre eller EDTA og inkubere cellerne i 10 minutter. Inaktiver derefter trypsin / EDTA ved at sende og singularisere cellerne igen med 2 ml pletteringsmedium.Fra de seks brønde samles cellerne i et 50 ml konisk rør ved hjælp af en 70 mikrometer sil. Efter vask af silen med 3 ml pletteringsmedium tælles cellerne. Efter tælling centrifugeres og vaskes cellepillen med 2 ml iskold MACS-separationsbuffer inden pelletering og genafsendelse af cellerne i 80 mikroliter kold MACS-separationsbuffer pr. 5 x 10 til 6. celle.Tilsæt 20 mikroliter kold ikke-kardiomyocytudtømningscocktail og bland suspensionen, før den inkuberes på is i 10 minutter. Efter vask af cellerne med 4 ml kold MACS-separationsbuffer ved 300 x g i 5 minutter, resuspenderes pelleten i 80 mikroliter kold MACS-separationsbuffer. Tilsæt 20 mikroliter kolde antibiotinmikroperler pr. 5 x 10 til de 6. celler, og bland forsigtigt cellesuspensionen, før den inkuberes på is i 10 minutter.Mens prøverne inkuberer, skal du placere de positive udtømningskolonner udstyret med 30 mikrometer forseparationsfiltre på MACS-separatoren og placere de mærkede 15 ml opsamlingsrør under kolonnerne. Prim derefter hver kolonne med 3 ml kold MACS-separationsbuffer. Bland den antistofbehandlede cellesuspension med 2 ml MACS-separationsbuffer og tilsæt den til kolonnen.Tilsæt 2 ml MACS-separationsbuffer til hver kolonne og opsaml 12 ml gennemstrømningskardiomyocytsuspension. Kardiomyocytterne centrifugeres, og supernatanten kasseres, inden kardiomyocytterne resuspenderes i et 1 ml pletteringsmedium. For at bestemme koncentrationen skal du tælle cellerne og justere volumenet til den ønskede såtæthed, før du pletterer de rensede kardiomyocytceller på MECM 96-brøndpladerne.Aspirer og udskift kardiomyocytvedligeholdelsesmediet med 100 mikroliter spændingsfølsomme farvestoffer eller VSD eller calciumfølsomme fluoroforer eller CSF pr. Brønd på en 96-brøndplade. Efter 30 minutters inkubation udskiftes farvestofferne med et analysemedium eller HBSS. Ekvilibrer cellerne ved 37 grader Celsius, før du får baseline data optisk kortlægning ved hjælp af en optisk kortlægningsenhed med høj kapacitet.For at behandle cellerne med lægemidler til akut eksponeringstest eller kortlægge cellerne kronisk udsat for lægemidler af interesse, fortynd lægemidlerne i dimethylsulfoxid eller DMSO og opbevar dem som stamopløsninger ved 20 grader Celsius, før de fortyndes i HBSS til de ønskede koncentrationer. Til kardiotoksicitetstest i plader med 96 brønde tilsættes fire doser af en forbindelse med mindst otte brønde pr. Dosis. Brug doser, der spænder fra under til over den klinisk effektive terapeutiske plasmakoncentration, herunder den effektive dosis.I lighed med baseline elektrofysiologiske målinger før lægemiddelapplikation skal du fange elektrofysiologiske optagelser mindst 30 minutter efter lægemiddelbehandling til kroniske undersøgelser. Efter baseline-optagelser skal du anvende mindst fire doser af hver medicin på modne hiPSC-CMs monolag, der udtrykker GCaMP6m, med mindst otte brønde pr. Dosis. Ligevægt medicinen på cellerne i 30 minutter, og varm cellerne op til 37 grader Celsius før og under dataindsamlingen.Efter baseline optagelser af en hel plade, tilføje 500 nanomolære isoproterenol til hver brønd for at muliggøre robuste lægemiddelrespons data og kvantificere virkningerne af isoproterenol på monolag slå hastighed, sammentrækning amplitude, og calcium forbigående varighed. For at hente optiske kortlægningsdata skal du åbne den forreste skuffe og placere pladen på pladevarmeren. Når du har åbnet anskaffelsessoftwaren og bestemt fillagringsplaceringen i softwaren, skal du vælge 10 til 30 sekunders varighed og billedhastighed for erhvervelse for højere tidsmæssig opløsning og klikke på Start erhvervelse.Åbn analysesoftwaren, og vælg enten Søg efter en enkelt fil eller Inddel flere under fanen Importfilter for at rekonstruere en plade. Vælg filerne, indtast et antal rækker og kolonner, og vælg Automatisk. Vælg derefter Opdater pixelstørrelse, indtast afstand pr. pixel, og brug guiden Brønd til at bestemme brøndenes placering i billedet, før du klikker på Gem proces og flytter til næste fane.Åbn fanen ROI'er eller Interesseområder, og vælg at tegne ROI'erne manuelt, automatisk eller slet ikke bruge ROI'er, hvilket vil blive overvejet til analyse af hele pladen. Når du har valgt området i brønden, skal du klikke på knappen Gem proces for at gå til næste trin. Markér afkrydsningsfelterne Skjul felter og Vis kun filtrerede felter for at visualisere investeringsafkastet.Åbn fanen Analyse, vælg hvert felt eller investeringsafkast for at bekræfte nøjagtigheden af automatisk beatregistrering. Tilføj eller fjern slag fra sporingerne ved at vælge et individuelt slag og trykke på Slet på tastaturet. Når du er færdig, skal du klikke på Gem.Klik derefter på knappen Time-Space Plot på fanen Analyse, og tilføj linjen for at bestemme tids-rum-plottet for at visualisere data for hver brønd eller ROI. Når du har valgt en vandret eller lodret linje, skal du klikke på Generer plot. Når du har sikret den nøjagtige beatdetektion, skal du fortsætte til fanen Eksporter og vælge Filformat, indtaste indstillingen Beatstatistik, før du klikker på Eksporter.Når de er eksporteret, skal du åbne datafiler og køre den valgte statistiske analyserutine. Fasekontrastbilleddannelse viste, at hiPSC-CM'erne belagt på MECM modnedes og blev strukturelt adskilt fra det samme parti hiPSC-CM'er, der blev genbelagt på muse-ECM. Modne celler blev stangformede, mens umodne celler bevarede en cirkulær form.Kardiomyocytter farvet med alfa-actinin-antistoffer viste den typiske form af cellerne dyrket på hver ECM-tilstand. I overensstemmelse med TnI-farvningen indikerede alfa-actininfarvningen, at hiPSC-CM'erne modnet på MECM fremmede en stavformet moden fænotype og inducerede større sarkomerorganisation. Mitokondrieindhold og -aktivitet var forskellig mellem celler dyrket på muse-ECM og MECM.De elektrofysiologiske data for aktionspotentialer registreret ved hjælp af VSD'er og det optiske kortlægningssystem viste, at de atriespecifikke celler har en signifikant hurtigere spontan slaghastighed og kortere aktionspotentiel varighed, eller APD80, end de ventrikelspecifikke celler. Helpladevarmekort for parametre som APD80 afslørede reproducerbarheden af en given parameter i en plade. Typiske aktionspotentialer for modne hiPSC-CM-monolag indikerede aktionspotentialemorfologien for isolerede og testede voksne kardiomyocytter.En typisk handlingspotentiel spontan rytme blev også vist. Som reaktion på isoproroterenol forårsagede aktivering af beta-1-adrenerge receptorer positiv kronotropi, positiv inotropi og positiv lusitropi. HiPSC-CM-respons på humant Ether-a-go-go-relateret gen eller hERG, kanalblokker, herunder E-4031, domperidon, vandetanib og sotalol, blev undersøgt ved hjælp af GCaMP6m calciumfluorescens til overvågning af rytme.Undersøgelsen viste påvisning af tidlige efter-depolariseringer forårsaget af E-4031 hERG-kanalblokaden. Arbejd hurtigt med cellerne i suspension, og undgå forskydningsspænding ved forsigtigt at pipettere celler. Udfør desuden medieskift omhyggeligt for at undgå at beskadige hiPS syncytia.Efter denne procedure er celler modtagelige for protein-, RNA-, DNA- og lipidindsamling til analyse med efterforskernes yndlingsteknik. Teknikken giver forskere mulighed for at undersøge sygdomme og teste for kardiotoksicitet af nye lægemidler ved hjælp af voksenlignende kardiomyocytter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for Højkapacitetsforskning Antifungisk Drug Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injicerbare regenerativ terapi og høj overførselshastighed stof Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering af voksne humane Dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering af inducerede pluripotente stamceller ved hjælp af en ikke-integrerings metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidet differentiering af modne nyre podocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller under kemisk definerede forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen nyre glomerulus chip konstrueret fra humaninducerede pluripotente stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluering af hjertekontraktilitetsmodulationsterapi i 2D humane stamcelleafledte kardiomyocytter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...