Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Dit werk is ondersteund door NIH-subsidies HL148068-04 en R44ES027703-02 (TJH).

hiPSC-gebruik in dit protocol is goedgekeurd door de HPSCRO-commissie van de Universiteit van Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Zie de Tabel met materialen voor een lijst met materialen en apparatuur. Zie tabel 1 voor de media en hun samenstellingen.
1. Ontdooien en plateren van in de handel verkrijgbare gecryopreserveerde hiPSC-CMs voor rijping op een rijpingsinducerende extracellulaire matrix (MECM)
<ol><li>Verwar...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Er zijn verschillende benaderingen voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening met behulp van hiPSC-CMs. Een recent artikel over "Best Practices" over het gebruik van hiPSC-CM's presenteerde de verschillende in vitro assays, hun primaire uitlezingen en, belangrijker nog, de granulariteit van elke assay om de menselijke cardiale elektrofysiologische functie te kwantificeren20. Naast het gebruik van membraandoorborende elektroden, wordt de meest directe meting van de menselijke cardia...

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn op internationale schaal gevalideerd en zijn beschikbaar voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening1. Zeer zuivere hiPSC-CM's kunnen in vrijwel onbeperkte aantallen worden gegenereerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Bij het replateren reanimeren ze ook en beginnen ze samen te trekken met een ritme dat doet denken aan het menselijk hart 2,3. Opmerkelijk is dat individuele hiPSC-CM's aan elkaar koppelen en functionele syncytia vormen die als een enkel weefsel kloppen. Tegenwoordig worden hiPSC's routinematig afgeleid van bloedmonsters van patiënten, zodat elke persoon kan worden weergegeven met behulp van in vitro hiPSC-CM cardiotoxiciteitsscreeningstests 4,5. Dit creëert de mogelijkheid om "Clinical Trials in a Dish" uit te voeren, met een significante vertegenwoordiging uit diverse populaties6.
Een cruciaal voordeel ten opzichte van bestaande benaderingen voor cardiotoxiciteit bij dieren en dierlijke cellen is dat hiPSC-CMs het volledige menselijke genoom gebruiken en een in vitro systeem bieden met genetische overeenkomsten met het menselijk hart. Dit is vooral aantrekkelijk voor farmacogenomica en gepersonaliseerde geneeskunde - het gebruik van hiPSC-CMs voor medicatie en andere therapieontwikkeling zal naar verwachting nauwkeurigere, nauwkeurigere en veiligere medicatievoorschriften opleveren. Inderdaad, tweedimensionale (2D) hiPSC-CM monolayer assays hebben bewezen voorspellend te zijn voor medicatie cardiotoxiciteit, met behulp van een panel van klinisch gebruikte medicijnen met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën 1,7,8,9. Ondanks het enorme potentieel van hiPSC-CMs en de belofte om de ontwikkeling van geneesmiddelen te stroomlijnen en goedkoper te maken, is er een terughoudendheid geweest om deze nieuwe assays10,11,12 te gebruiken.
Tot nu toe is een belangrijke beperking van wijdverspreide acceptatie en acceptatie van hiPSC-CM-screeningstests hun onvolwassen, foetale uiterlijk, evenals hun functie. De kritieke kwestie van hiPSC-CM rijping is besproken en besproken in de wetenschappelijke literatuur ad nauseum13,14,15,16. Evenzo zijn veel benaderingen gebruikt om hiPSC-CM-rijping te bevorderen, waaronder extracellulaire matrix (ECM) manipulaties in 2D-monolagen en de ontwikkeling van 3D-gemanipuleerde hartweefsels (EHT's)17,18. Op dit moment is er een wijdverbreide overtuiging dat het gebruik van 3D EHT's een superieure rijping zal bieden ten opzichte van 2D monolayer-gebaseerde benaderingen. 2D-monolagen bieden echter een hogere efficiëntie van celgebruik en meer succes bij het plateren in vergelijking met 3D-EHT's; 3D EHT's gebruiken grotere aantallen cellen en vereisen vaak de opname van andere celtypen die de resultaten kunnen verstoren. Daarom ligt de focus in dit artikel op het gebruik van een eenvoudige methode om hiPSC-CMs te rijpen die zijn gekweekt als 2D-monolagen van elektrisch en mechanisch gekoppelde cellen.
Geavanceerde hiPSC-CM rijping kan worden bereikt in 2D monolagen met behulp van een ECM. De 2D-monolagen van hiPSC-CMs kunnen worden gerijpt met behulp van een zachte, flexibele polydimethylsiloxaan coverslip, bedekt met keldermembraanmatrix afgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM). In 2016 toonden rapporten aan dat hiPSC-CMs gekweekt op deze zachte ECM-conditie functioneel volwassen werden, met actiepotentiaalgeleidingssnelheden in de buurt van volwassen hartwaarden (~ 50 cm / s)18. Verder vertoonden deze volwassen hiPSC-CM's vele andere elektrofysiologische kenmerken die doen denken aan het volwassen hart, waaronder hyperpolariseerde rustmembraanpotentiaal en expressie van Kir2.1. Meer recent identificeerden rapporten een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM-coating die de structurele rijping van 2D hiPSC-CMsbevordert 19. Hier worden eenvoudig te gebruiken methoden gepresenteerd om structureel volwassen 2D hiPSC-CM monolagen te ontwikkelen voor gebruik in elektrofysiologische schermen met hoge doorvoer. Verder bieden we validatie van een optisch mapping-instrument voor de geautomatiseerde acquisitie en analyse van 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologische functie, met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) en calciumgevoelige sondes en eiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Door de mens geïnduceerde van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden gebruikt om de afhankelijkheid van dieren en dierlijke cellen te vervangen en te verminderen voor preklinische cardiotoxiciteitstests. In tweedimensionale monolaagformaten recapituleren hiPSC-CMs de structuur en functie van de volwassen menselijke hartspiercellen wanneer ze worden gekweekt op een optimale extracellulaire matrix (ECM). Een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM (rijpingsinducerende extracellulaire matrix-MECM) rijpt de hiPSC-CM-structuur, functie en metabole toestand in 7 dagen na plating. 
Volwassen hiPSC-CM monolayers reageren ook zoals verwacht op klinisch relevante medicijnen, met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën en cardiotoxiciteit. De rijping van hiPSC-CM monolagen was tot nu toe een obstakel voor de wijdverspreide acceptatie van deze waardevolle cellen voor regelgevende wetenschap en veiligheidsscreening. Dit artikel presenteert gevalideerde methoden voor de plating, rijping en high-throughput, functionele fenotypering van hiPSC-CM elektrofysiologische en contractiele functie. Deze methoden zijn van toepassing op in de handel verkrijgbare gezuiverde cardiomyocyten, evenals van stamcellen afgeleide cardiomyocyten die intern worden gegenereerd met behulp van zeer efficiënte, kamerspecifieke differentiatieprotocollen. 
De elektrofysiologische functie met hoge doorvoer wordt gemeten met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's; emissie: 488 nm), calciumgevoelige fluoroforen (CSF's) of genetisch gecodeerde calciumsensoren (GCaMP6). Een high-throughput optisch mappingapparaat wordt gebruikt voor optische opnames van elke functionele parameter en aangepaste speciale software wordt gebruikt voor elektrofysiologische gegevensanalyse. MECM-protocollen worden toegepast voor medicatiescreening met behulp van een positieve inotroop (isoprenaline) en humane Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanaalspecifieke blokkers. Deze middelen zullen andere onderzoekers in staat stellen om met succes volwassen hiPSC-CMs te gebruiken voor high-throughput, preklinische cardiotoxiciteitsscreening, hartmedicatie-werkzaamheidstests en cardiovasculair onderzoek.

hiPSC-CM rijping gekenmerkt door fasecontrast en immunofluorescente confocale beeldvorming De tijdlijn voor ECM-gemedieerde rijping van in de handel verkrijgbare hiPSC-CM's met behulp van MECM-gecoate 96-putplaten is weergegeven in figuur 1A. Deze gegevens worden verzameld met behulp van in de handel verkrijgbare cardiomyocyten die in het laboratorium aankomen als gecryopreserveerde injectieflacons met cellen. Elke injectieflacon bevat >5 × 106 levensvatbare c...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om commerciële of in-house gemaakte hiPSC-CMs te rijpen tot een volwassen-achtig fenotype dat de voorspellende waarde van hiPSC-CMs bij cardiotoxiciteitsscreening aanzienlijk verbetert. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het volwassen hiPSC-CMs levert in een high throughput-formaat voor optische mapping van calcium- of spanningsverandering. Dit protocol kan worden gebruikt om ziektemechanismen te onderzoeken of om geneesmiddelen te screenen op cardiotoxiciteit.De procedure wordt gedemonstreerd door Jeffrey Creech, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het wassen van de rijpingsinducerende extracellulaire matrix, of MECM, platen twee keer met 200 microliter van Hank's gebalanceerde zoutoplossing, of HBSS, 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating. Houd de putten gehydrateerd.Breng de cardiomyocytenbuizen over van de tank met vloeibare stikstof naar droogijs en laat de druk los door de buisdoppen iets te openen. Sluit vervolgens de buisdoppen opnieuw en ontdooi ze gedurende 4 minuten in het waterbad. Na het ontdooien van de cellen, besproei de buizen met 70% ethanol voordat u ze opent.Breng de cellen over in conische buizen van 15 milliliter met een pipet van 1 milliliter. Voeg 1 milliliter platingmedium toe aan de cryovial en breng de was over in de conische buis van 15 milliliter. Druppel vervolgens langzaam 1 milliliter platingmedium en roer de buis.Herhaal dit tot de overdracht van 8 milliliter platingmedium. Centrifugeer de buis van 15 milliliter gedurende 5 minuten op 300 x g en resuspensie van de pellet in 1 milliliter van het platingmedium. Verwijder een aliquot en voer live celtelling uit met een hemocytometer voordat u een platingmedium toevoegt om 7,5 x 10 tot de 5e cellen per milliliter te verkrijgen.Doseer 100 microliter van de celsuspensie per put van een MECM-gecoate 96-putplaat met behulp van een meerkanaalspipet en incuber de cellen gedurende 2 dagen. Vervang vervolgens het medium door 200 microliter onderhoudsmedium en onderhoud de platen gedurende 7 dagen, met een verandering van medium op dag 5. Voer op dag 7 een EP-test uit, zoals beschreven in de tekst.Zorg ervoor dat u het medium om de dag vervangt wanneer u kiest voor uitbreiding van de celcultuur. Om hiPSC-CM te zuiveren via magnetisch geactiveerde celsortering, of MACS, zuigt u het celkweekmedium op en wast u de cellen met 1 milliliter HBSS-Dissocieer vervolgens de cellen door 1 milliliter 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur of EDTA toe te voegen en de cellen gedurende 10 minuten te incuberen. Deactiveer vervolgens de trypsine / EDTA door de cellen opnieuw te verzenden en te singulariseren met 2 milliliter platingmedium.Verzamel de cellen uit de zes putten in een conische buis van 50 milliliter met behulp van een zeef van 70 micrometer. Na het wassen van de zeef met 3 milliliter platingmedium, tel je de cellen. Na het tellen, centrifugeer en was de celpellet met 2 milliliter ijskoude MACS-scheidingsbuffer voordat u pelleteert en de cellen opnieuw verzendt in 80 microliter koude MACS-scheidingsbuffer per 5 x 10 naar de 6e cellen.Voeg 20 microliter koude niet-cardiomyocytendepletiecocktail toe en meng de suspensie voordat je gedurende 10 minuten op ijs broedt. Na het wassen van de cellen met 4 milliliter koude MACS-scheidingsbuffer op 300 x g gedurende 5 minuten, resuspensie van de pellet in 80 microliter koude MACS-scheidingsbuffer. Voeg 20 microliter koude anti-biotine microbeads per 5 x 10 toe aan de 6e cellen en meng de celsuspensie voorzichtig voordat je gedurende 10 minuten op ijs broedt.Terwijl de monsters aan het broeden zijn, plaatst u de positieve depletiekolommen die zijn uitgerust met de 30 micrometer voorscheidingsfilters op de MACS-separator en plaatst u de gelabelde 15 milliliter verzamelbuizen onder de kolommen. Vervolgens primeert u elke kolom met 3 milliliter koude MACS-scheidingsbuffer. Meng de met antilichamen behandelde celsuspensie met 2 milliliter MACS-scheidingsbuffer en voeg deze toe aan de kolom.Voeg 2 milliliter MACS-scheidingsbuffer toe aan elke kolom en verzamel 12 milliliter doorstroomde cardiomyocytensuspensie. Centrifugeer de cardiomyocyten en gooi het supernatant weg voordat u de cardiomyocyten opnieuw in een 1-milliliter platingmedium suspenseert. Om de concentratie te bepalen, telt u de cellen en past u het volume aan de gewenste zaaidichtheid aan voordat u de gezuiverde cardiomyocytencellen op de MECM 96-well-platen plaatst.Zuig en vervang het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten door 100 microliter spanningsgevoelige kleurstoffen, of VSD, of calciumgevoelige fluoroforen, of CSF, per put van een plaat met 96 putten. Vervang na 30 minuten incubatie de kleurstoffen door een testmedium of HBSS. Breng de cellen in evenwicht bij 37 graden Celsius voordat u optische mapping van basisgegevens verkrijgt met behulp van een optisch mappingapparaat met hoge doorvoer.Om de cellen te behandelen met geneesmiddelen voor acute blootstellingstests of om de cellen in kaart te brengen die chronisch zijn blootgesteld aan geneesmiddelen van belang, verdunt u de geneesmiddelen in dimethylsulfoxide of DMSO en bewaart u ze als voorraadoplossingen bij 20 graden Celsius voordat u ze in HBSS verdunt tot de gewenste concentraties. Voeg voor cardiotoxiciteitstests in 96-putplaten vier doses van een verbinding toe met ten minste acht putjes per dosis. Gebruik doses variërend van onder tot boven de klinisch effectieve therapeutische plasmaconcentratie, inclusief de effectieve dosis.Vergelijkbaar met de baseline elektrofysiologische metingen vóór toediening van het geneesmiddel, leg elektrofysiologische opnames vast ten minste 30 minuten na medicamenteuze behandeling voor chronische studies. Breng na baseline-opnamen ten minste vier doses van elk medicijn aan op volwassen hiPSC-CMs-monolagen die GCaMP6m tot expressie brengen, met ten minste acht putjes per dosis. Breng de medicijnen op de cellen gedurende 30 minuten in evenwicht en verwarm de cellen tot 37 graden Celsius voor en tijdens de gegevensverzameling.Voeg na basislijnopnamen van een hele plaat 500 nanomolaire isoproterenol toe aan elke put om robuuste medicijnresponsgegevens mogelijk te maken en de effecten van isoproterenol op monolayer beat rate, contractieamplitude en calciumtransiënte duur te kwantificeren. Om optische kaartgegevens te verkrijgen, opent u de voorste lade en plaatst u de plaat op de plaatverwarming. Nadat u de acquisitiesoftware hebt geopend en de locatie voor het opslaan van bestanden in de software hebt bepaald, selecteert u de duur van 10 tot 30 seconden en de framesnelheid van de acquisitie voor een hogere tijdelijke resolutie en klikt u op Acquisitie starten.Open de analysesoftware en selecteer op het tabblad Filter importeren de optie Bladeren naar één bestand of Meerdere naast elkaar plaatsen om een plaat te reconstrueren. Selecteer de bestanden, voer een aantal rijen en kolommen in en selecteer Automatisch. Selecteer vervolgens Pixelgrootte bijwerken, voer de afstand per pixel in en gebruik de putwizard om de locatie van de putten in de afbeelding te bepalen voordat u op Opslaan verwerken klikt en naar het volgende tabblad gaat.Open het tabblad ROI's of Interessegebieden en kies ervoor om de ROI's handmatig, automatisch of helemaal geen ROI's te tekenen, die in aanmerking worden genomen voor de analyse van de hele plaat. Nadat u de regio in het vak hebt geselecteerd, klikt u op de knop Opslaan verwerken om naar de volgende stap te gaan. Vink de vakjes Putten verbergen en Alleen gefilterd weergeven aan om de ROI's te visualiseren.Open het tabblad Analyse, selecteer elke put of ROI om de nauwkeurigheid van automatische beatdetectie te bevestigen. Voeg beats toe of verwijder beats uit de traceringen door een afzonderlijke beat te selecteren en op Delete op het toetsenbord te drukken. Als u klaar bent, klikt u op Opslaan.Klik vervolgens op de knop Time-Space Plot op het tabblad Analyse en voeg de regel toe om de tijd-ruimteplot te bepalen om gegevens voor elke put of de ROI te visualiseren. Nadat u een horizontale of verticale lijn hebt geselecteerd, klikt u op Plot genereren. Nadat u de nauwkeurige beatdetectie hebt gecontroleerd, gaat u naar het tabblad Exporteren en selecteert u Bestandsindeling, voert u de optie Beatstatistiek in voordat u op Exporteren klikt.Eenmaal geëxporteerd, opent u gegevensbestanden en voert u de gekozen statistische analyseroutine uit. Fasecontrastbeeldvorming toonde aan dat de hiPSC-CM's die op de MECM waren geplateerd, volwassen werden en structureel verschilden van dezelfde partij hiPSC-CM's die op de muis-ECU waren gereplateerd. Volwassen cellen werden staafvormig, terwijl onrijpe cellen een cirkelvorm behielden.Cardiomyocyten gekleurd met alfa-actinine-antilichamen toonden de typische vorm van de cellen gekweekt op elke ECM-aandoening. In overeenstemming met de TnI-kleuring gaf de alfa-actininekleuring aan dat de hiPSC-CM's die op de MECM rijpten een staafvormig volwassen fenotype bevorderden en een grotere sarcoomorganisatie induceerden. Mitochondriale inhoud en activiteit waren verschillend tussen cellen gekweekt op de muis ECM en de MECM.De elektrofysiologische gegevens voor actiepotentialen geregistreerd met behulp van VSD's en het optische mappingsysteem toonden aan dat de atriale specifieke cellen een significant snellere spontane slagsnelheid en kortere actiepotentiaalduur, of APD80, hebben dan de ventrikelspecifieke cellen. Heatmaps voor de hele plaat voor parameters zoals APD80 onthulden de reproduceerbaarheid van een bepaalde parameter binnen een plaat. Typische actiepotentialen van volwassen hiPSC-CM monolagen gaven de actiepotentiaalmorfologie van geïsoleerde en geteste volwassen cardiomyocyten aan.Er werd ook een typisch actiepotentiaal spontaan ritme getoond. Als reactie op isoproterenol veroorzaakte activering van de bèta-1-adrenerge receptoren positieve chronotropie, positieve inotropie en positieve lusitropie. HiPSC-CM respons op menselijk Ether-a-go-go-gerelateerd gen, of hERG, kanaalblokker, waaronder E-4031, domperidon, vandetanib en sotalol, werd bestudeerd met behulp van GCaMP6m calciumfluorescentie om het ritme te controleren.De studie toonde de detectie van vroege na-depolarisaties veroorzaakt door de E-4031 hERG-kanaalblokkade. Werk snel met de cellen in suspensie en vermijd schuifspanning door cellen voorzichtig te pipetteren. Voer bovendien zorgvuldig mediawissels uit om te voorkomen dat de hiPS-syncytie wordt beschadigd.Na deze procedure zijn cellen vatbaar voor het verzamelen van eiwitten, RNA, DNA en lipiden voor analyse met de favoriete techniek van onderzoekers. De techniek stelt onderzoekers in staat om ziekten te onderzoeken en te testen op cardiotoxiciteit van nieuwe geneesmiddelen met behulp van volwassen cardiomyocyten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...