Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions HL148068-04 et R44ES027703-02 (TJH) des NIH.

L’utilisation de la CSPhi dans ce protocole a été approuvée par le comité HPSCRO de l’Université du Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement. Voir le tableau 1 pour les supports et leurs compositions.
1. Décongélation et placage de hiPSC-CM cryoconservés disponibles dans le commerce pour maturation sur une matrice extracellulaire induisant la...

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	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Il existe plusieurs approches différentes pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro à l’aide de hiPSC-CM. Un récent article sur les « meilleures pratiques » sur l’utilisation des CM-HIPSC a présenté les différents tests in vitro , leurs lectures primaires et, surtout, la granularité de chaque essai pour quantifier la fonction électrophysiologique cardiaque humaine20. En plus d’utiliser des électrodes de perçage de membrane, la mesure la plus directe de l...

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) ont été validés à l’échelle internationale et sont disponibles pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro 1. Les hiPSC-CM très purs peuvent être générés en nombre pratiquement illimité, cryoconservés et décongelés. Lors du replating, ils se réaniment également et commencent à se contracter avec un rythme rappelant le cœur humain 2,3. Remarquablement, les hiPSC-CM individuels se couplent les uns aux autres et forment une syncytie fonctionnelle qui bat comme un seul tissu. De nos jours, les CSPhi sont systématiquement dérivées d’échantillons de sang de patients, de sorte que toute personne peut être représentée à l’aide de tests de cardiotoxicité hiPSC-CM in vitro 4,5. Cela crée l’opportunité d’effectuer des « essais cliniques dans un plat », avec une représentation significative de diverses populations6.
Un avantage essentiel par rapport aux approches existantes de dépistage de la cardiotoxicité animale et cellulaire animale est que les hiPSC-CM utilisent le génome humain complet et offrent un système in vitro présentant des similitudes génétiques avec le cœur humain. Ceci est particulièrement intéressant pour la pharmacogénomique et la médecine personnalisée - l’utilisation de hiPSC-CM pour le développement de médicaments et d’autres thérapies devrait fournir des prescriptions de médicaments plus précises, précises et sûres. En effet, les tests bidimensionnels (2D) hiPSC-CM monocouche se sont avérés prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments, en utilisant un panel de médicaments utilisés cliniquement avec un risque connu de provoquer des arythmies 1,7,8,9. Malgré le vaste potentiel des hiPSC-CM et la promesse de rationaliser et de rendre le développement de médicaments moins cher, il y a eu une réticence à utiliser ces nouveaux tests10,11,12.
Jusqu’à présent, l’une des principales limites de l’adoption et de l’acceptation généralisées des tests de dépistage HiPSC-CM est leur apparence immature, semblable à celle du fœtus, ainsi que leur fonction. La question critique de la maturation hiPSC-CM a été examinée et débattue dans la littérature scientifique ad nauseum13,14,15,16. De même, de nombreuses approches ont été utilisées pour promouvoir la maturation hiPSC-CM, y compris les manipulations de la matrice extracellulaire (ECM) dans les monocouches 2D et le développement de tissus cardiaques modifiés en 3D (EHTs)17,18. À l’heure actuelle, il existe une croyance largement répandue selon laquelle l’utilisation de EHT 3D fournira une maturation supérieure par rapport aux approches monocouches 2D. Cependant, les monocouches 2D offrent une plus grande efficacité d’utilisation des cellules et un succès accru dans le placage par rapport aux EHT 3D; Les EHT 3D utilisent un plus grand nombre de cellules et nécessitent souvent l’inclusion d’autres types de cellules qui peuvent confondre les résultats. Par conséquent, dans cet article, l’accent est mis sur l’utilisation d’une méthode simple pour faire mûrir les hiPSC-CM cultivés en tant que monocouches 2D de cellules couplées électriquement et mécaniquement.
La maturation hiPSC-CM avancée peut être réalisée en monocouches 2D à l’aide d’un ECM. Les monocouches 2D des hiPSC-CM peuvent être affinées à l’aide d’une couche de couverture souple et flexible en polydiméthylsiloxane, recouverte d’une matrice membranaire basale sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris). En 2016, des rapports ont montré que les CM-HIPSC cultivés sur cette condition ECM molle ont mûri fonctionnellement, affichant des vitesses de conduction potentielles d’action proches des valeurs cardiaques adultes (~50 cm/s)18. De plus, ces hiPSC-CM matures présentaient de nombreuses autres caractéristiques électrophysiologiques rappelant le cœur adulte, notamment un potentiel membranaire au repos hyperpolarisé et l’expression de Kir2.1. Plus récemment, des rapports ont identifié un revêtement ECM dérivé de cellules souches périnatales humaines qui favorise la maturation structurelle des hiPSC-CMs2D 19. Ici, des méthodes faciles à utiliser sont présentées aux monocouches 2D hiPSC-CM structurellement matures pour une utilisation dans des criblages électrophysiologiques à haut débit. En outre, nous fournissons la validation d’un instrument de cartographie optique pour l’acquisition et l’analyse automatisées de la fonction électrophysiologique monocouche 2D hiPSC-CM, à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de sondes et protéines sensibles au calcium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches induites humaines (hiPSC-CM) sont utilisés pour remplacer et réduire la dépendance à l’égard des animaux et des cellules animales pour les tests de cardiotoxicité précliniques. Dans des formats monocouches bidimensionnels, les hiPSC-CM récapitulent la structure et la fonction des cellules du muscle cardiaque humain adulte lorsqu’elles sont cultivées sur une matrice extracellulaire optimale (ECM). Une ECM (matrice extracellulaire induisant la maturation-MECM) dérivée de cellules souches périnatales humaines fait mûrir la structure, la fonction et l’état métabolique de l’hiPSC-CM en 7 jours après le placage. 
Les monocouches matures d’hiPSC-CM répondent également comme prévu aux médicaments cliniquement pertinents, avec un risque connu de provoquer des arythmies et une cardiotoxicité. La maturation des monocouches hiPSC-CM était un obstacle à l’adoption généralisée de ces cellules précieuses pour la science réglementaire et le dépistage de la sécurité, jusqu’à présent. Cet article présente des méthodes validées pour le placage, la maturation et le phénotypage fonctionnel à haut débit de la fonction électrophysiologique et contractile de l’hiPSC-CM. Ces méthodes s’appliquent aux cardiomyocytes purifiés disponibles dans le commerce, ainsi qu’aux cardiomyocytes dérivés de cellules souches générés en interne à l’aide de protocoles de différenciation hautement efficaces et spécifiques à la chambre. 
La fonction électrophysiologique à haut débit est mesurée à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD; émission: 488 nm), de fluorophores sensibles au calcium (LCR) ou de capteurs de calcium génétiquement codés (GCaMP6). Un dispositif de cartographie optique à haut débit est utilisé pour les enregistrements optiques de chaque paramètre fonctionnel, et un logiciel dédié personnalisé est utilisé pour l’analyse des données électrophysiologiques. Les protocoles MECM sont appliqués pour le dépistage des médicaments à l’aide d’un inotrope positif (isoprénaline) et d’un gène humain lié à l’éther (hERG) bloqueur spécifique du canal. Ces ressources permettront à d’autres chercheurs d’utiliser avec succès les CM-HIPSC matures pour le dépistage cardiotoxique préclinique à haut débit, les tests d’efficacité des médicaments cardiaques et la recherche cardiovasculaire.

maturation hiPSC-CM caractérisée par contraste de phase et imagerie confocale immunofluorescente La chronologie de la maturation médiée par ECM des CM-hiPSC disponibles dans le commerce à l’aide de plaques à 96 puits revêtues de MECM est présentée à la figure 1A. Ces données sont recueillies à l’aide de cardiomyocytes disponibles dans le commerce qui arrivent en laboratoire sous forme de flacons cryoconservés de cellules. Chaque flacon contient >5 × 10<s...

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.

Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Ce protocole est important parce qu’il permet aux chercheurs de faire passer les CM-HIPSC commerciales ou fabriquées en interne à un phénotype semblable à celui de l’adulte qui améliore considérablement la valeur prédictive des CM-HiPSC dans le dépistage de la cardiotoxicité. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit des CM-HiPSC matures dans un format à haut débit pour la cartographie optique du calcium ou du changement de tension. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour dépister la cardiotoxicité des médicaments.Jeffrey Creech, un associé de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par laver les plaques de matrice extracellulaire induisant la maturation, ou MECM, deux fois avec 200 microlitres de solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, 1 heure avant le placage cardiomocytes. Gardez les puits hydratés.Transférez les tubes cardiomyocytaires du réservoir d’azote liquide à la glace sèche et relâchez la pression en ouvrant légèrement les bouchons du tube. Ensuite, refermez les bouchons du tube et décongelez-les au bain-marie pendant 4 minutes. Après la décongélation des cellules, vaporisez les tubes avec de l’éthanol à 70% avant de les ouvrir.Transférez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres avec une pipette de 1 millilitre. Ajouter 1 millilitre de milieu de placage au cryovial et transférer le lavage dans le tube conique de 15 millilitres. Ensuite, égoutter lentement 1 millilitre de milieu de placage et agiter le tube.Répétez cette opération jusqu’au transfert de 8 millilitres de milieu de placage. Centrifuger le tube de 15 millilitres à 300 x g pendant 5 minutes et remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre du milieu de placage. Retirer une partie aliquote, et effectuer le comptage des cellules vivantes avec un hémocytomètre avant d’ajouter un milieu de placage pour obtenir 7,5 x 10 à 5ème cellules par millilitre.Distribuer 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 96 puits revêtue de MECM à l’aide d’une pipette multicanal et incuber les cellules pendant 2 jours. Ensuite, remplacez le milieu par 200 microlitres de milieu d’entretien et maintenez les plaques pendant 7 jours, avec un changement de milieu le jour 5. Le jour 7, effectuez le test EP, comme décrit dans le texte.Assurez-vous de changer le milieu tous les deux jours lorsque vous optez pour l’extension de la culture cellulaire. Pour purifier hiPSC-CM par tri cellulaire activé magnétiquement, ou MACS, aspirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec 1 millilitre de HBSS-Ensuite, dissociez les cellules en ajoutant 1 millilitre de trypsine-éthylènediaminetétraacétique, ou EDTA, et en incubant les cellules pendant 10 minutes. Ensuite, inactivez la trypsine/EDTA en renvoyant et singularisant les cellules avec 2 millilitres de milieu de placage.À partir des six puits, recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide d’une crépine de 70 micromètres. Après avoir lavé la passoire avec 3 millilitres de produit de placage, comptez les cellules. Après comptage, centrifuger et laver la pastille de cellule avec 2 millilitres de tampon de séparation MACS glacé avant de granuler et de renvoyer les cellules dans 80 microlitres de tampon de séparation MACS froid par 5 x 10 aux 6ème cellules.Ajouter 20 microlitres de cocktail froid de déplétion non cardiomyocytaire et mélanger la suspension avant d’incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Après avoir lavé les cellules avec 4 millilitres de tampon de séparation MACS froid à 300 x g pendant 5 minutes, remettre la pastille en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation MACS froid. Ajouter 20 microlitres de microbilles froides anti-biotine par 5 x 10 aux 6e cellules, et mélanger délicatement la suspension cellulaire avant d’incuber sur de la glace pendant 10 minutes.Pendant l’incubation des échantillons, placez les colonnes de déplétion positive équipées des filtres de préséparation de 30 micromètres sur le séparateur MACS et placez les tubes de collecte de 15 millilitres étiquetés sous les colonnes. Ensuite, amorcez chaque colonne avec 3 millilitres de tampon de séparation MACS froid. Mélangez la suspension cellulaire traitée par anticorps avec 2 millilitres de tampon de séparation MACS et ajoutez-la à la colonne.Ajouter 2 millilitres de tampon de séparation MACS à chaque colonne et recueillir 12 millilitres de suspension de cardiomyocytes à écoulement. Centrifuger les cardiomyocytes et jeter le surnageant avant de remettre les cardiomyocytes en suspension dans un milieu de placage de 1 millilitre. Pour déterminer la concentration, compter les cellules et ajuster le volume à la densité d’ensemencement souhaitée avant de plaquer les cellules cardiomyocytaires purifiées sur les plaques MECM 96 puits.Aspirer et remplacer le milieu d’entretien des cardiomyocytes par 100 microlitres de colorants sensibles à la tension, ou VSD, ou fluorophores sensibles au calcium, ou LCR, par puits d’une plaque de 96 puits. Après 30 minutes d’incubation, remplacer les colorants par un milieu de dosage ou HBSS. Équilibrez les cellules à 37 degrés Celsius avant d’acquérir une cartographie optique des données de base à l’aide d’un dispositif de cartographie optique à haut débit.Pour traiter les cellules avec des médicaments pour les tests d’exposition aiguë ou cartographier les cellules exposées de façon chronique à des médicaments d’intérêt, diluer les médicaments dans du diméthylsulfoxyde, ou DMSO, et les stocker sous forme de solutions mères à 20 degrés Celsius avant de les diluer dans HBSS aux concentrations souhaitées. Pour les essais de cardiotoxicité dans des plaques de 96 puits, ajouter quatre doses d’un composé avec au moins huit puits par dose. Utilisez des doses allant de dessous à au-dessus de la concentration plasmatique thérapeutique cliniquement efficace, y compris la dose efficace.Semblable aux mesures électrophysiologiques de base avant l’application du médicament, capturez les enregistrements électrophysiologiques au moins 30 minutes après le traitement médicamenteux pour les études chroniques. Après les enregistrements de base, appliquer au moins quatre doses de chaque médicament sur les monocouches matures de hiPSC-CMs exprimant GCaMP6m, avec au moins huit puits par dose. Équilibrez les médicaments sur les cellules pendant 30 minutes et réchauffez les cellules à 37 degrés Celsius avant et pendant l’acquisition des données.Après les enregistrements de base d’une plaque entière, ajouter 500 nanomolaires d’isoprotérénol à chaque puits pour obtenir des données robustes sur la réponse aux médicaments et quantifier les effets de l’isoprotérénol sur la vitesse de battement monocouche, l’amplitude de contraction et la durée transitoire du calcium. Pour acquérir des données de cartographie optique, ouvrez le tiroir avant et positionnez la plaque sur le réchauffeur de plaques. Après avoir ouvert le logiciel d’acquisition et déterminé l’emplacement d’enregistrement du fichier dans le logiciel, sélectionnez la durée de 10 à 30 secondes et la fréquence d’images de l’acquisition pour une résolution temporelle plus élevée, puis cliquez sur Démarrer l’acquisition.Ouvrez le logiciel d’analyse et, dans l’onglet Filtre d’importation, sélectionnez Rechercher un seul fichier ou Mosaïque multiple pour reconstruire une plaque. Sélectionnez les fichiers et entrez un certain nombre de lignes et de colonnes, puis sélectionnez Automatique. Ensuite, sélectionnez Mettre à jour la taille des pixels, entrez la distance par pixel et utilisez l’assistant de puits pour déterminer l’emplacement des puits dans l’image avant de cliquer sur Enregistrer le processus et de passer à l’onglet suivant.Ouvrez l’onglet ROIs, ou Regions of Interest, et choisissez de dessiner les ROI manuellement, automatiquement, ou de ne pas utiliser les ROI du tout, qui seront pris en compte pour l’analyse de l’ensemble de la plaque. Après avoir sélectionné la région dans le puits, cliquez sur le bouton Enregistrer le processus pour passer à l’étape suivante. Cochez les cases Masquer les puits et Afficher uniquement les filtres pour visualiser le retour sur investissement.Ouvrez l’onglet Analyse, sélectionnez chaque puits ou retour sur investissement pour confirmer la précision de la détection automatique des battements. Ajoutez ou supprimez des temps des traces en sélectionnant un temps individuel et en appuyant sur Suppr sur le clavier. Une fois terminé, cliquez sur Enregistrer.Ensuite, cliquez sur le bouton Time-Space Plot dans l’onglet Analyse et ajoutez la ligne pour déterminer le diagramme spatio-temporel pour visualiser les données de chaque puits ou le retour sur investissement. Après avoir sélectionné une ligne horizontale ou verticale, cliquez sur Générer un tracé. Après avoir assuré la détection précise des battements, passez à l’onglet Exporter et sélectionnez Format de fichier, entrez l’option Statistiques de battement avant de cliquer sur Exporter.Une fois exportés, ouvrez les fichiers de données et exécutez la routine d’analyse statistique choisie. L’imagerie par contraste de phase a montré que les hiPSC-CM plaqués sur le MECM ont mûri et sont devenus structurellement distincts du même lot de hiPSC-CM replaqués sur l’ECM de la souris. Les cellules matures sont devenues en forme de bâtonnet, tandis que les cellules immatures ont conservé une forme circulaire.Les cardiomyocytes colorés avec des anticorps alpha-actinine ont montré la forme typique des cellules cultivées sur chaque condition ECM. Conformément à la coloration TnI, la coloration alpha-actinine indiquait que les hiPSC-CMs mûris sur le MECM favorisaient un phénotype mature en forme de bâtonnet et induisaient une plus grande organisation sarcomère. Le contenu et l’activité mitochondriaux étaient distincts entre les cellules cultivées sur l’ECM de souris et le MECM.Les données électrophysiologiques pour les potentiels d’action enregistrés à l’aide de VSD et du système de cartographie optique ont montré que les cellules spécifiques auriculaires ont un taux de battement spontané significativement plus rapide et une durée de potentiel d’action plus courte, ou APD80, que les cellules spécifiques ventrales. Les cartes thermiques de la plaque entière pour des paramètres tels que APD80 ont révélé la reproductibilité d’un paramètre donné dans une plaque. Les potentiels d’action typiques des monocouches matures de hiPSC-CM ont indiqué la morphologie du potentiel d’action des cardiomyocytes adultes isolés et testés.Un rythme spontané typique de potentiel d’action a également été affiché. En réponse à l’isoprotérénol, l’activation des récepteurs bêta-1-adrénergiques a provoqué une chronotropie positive, une inotropie positive et une lusitropie positive. La réponse HiPSC-CM au bloqueur de canaux humain lié à l’Ether-a-go-go-go, ou hERG, y compris E-4031, la dompéridone, le vandétanib et le sotalol, a été étudiée en utilisant la fluorescence calcique GCaMP6m pour surveiller le rythme.L’étude a montré la détection de post-dépolarisations précoces causées par le blocage du canal hERG E-4031. Travaillez rapidement avec les cellules en suspension et évitez les contraintes de cisaillement en pipetant doucement les cellules. De plus, effectuez un changement de support avec précaution pour éviter d’endommager la synchronisation hiPS.Après cette procédure, les cellules se prêtent à la collecte de protéines, d’ARN, d’ADN et de lipides pour analyse avec la technique préférée des chercheurs. La technique permet aux chercheurs d’étudier les maladies et de tester la cardiotoxicité de nouveaux médicaments utilisant des cardiomyocytes de type adulte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

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