Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL148068-04 und R44ES027703-02 (TJH) unterstützt.

Die Verwendung von hiPSC in diesem Protokoll wurde vom HPSCRO-Komitee der Universität Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Materialien und Geräte. Siehe Tabelle 1 für Medien und ihre Zusammensetzungen.
1. Auftauen und Plattieren kommerziell erhältlicher kryokonservierter hiPSC-CMs zur Reifung auf einer reifungsinduzierenden extrazellulären Matrix (MECM)
<o...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Es gibt verschiedene Ansätze für das In-vitro-Kardiotoxizitätsscreening mit hiPSC-CMs . In einem kürzlich veröffentlichten "Best Practices"-Artikel über die Verwendung von hiPSC-CMs wurden die verschiedenen In-vitro-Assays , ihre primären Messwerte und vor allem die Granularität jedes Assays zur Quantifizierung der elektrophysiologischen Funktion des menschlichen Herzensvorgestellt 20. Neben der Verwendung von Membran-Piercing-Elektroden liefern VSDs das direkteste Maß f...

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurden auf internationaler Ebene validiert und stehen für ein In-vitro-Kardiotoxizitäts-Screening zur Verfügung 1. Hochreine hiPSC-CMs können in nahezu unbegrenzter Anzahl erzeugt, kryokonserviert und aufgetaut werden. Nach dem Umplattieren reanimieren sie sich ebenfalls und beginnen sich mit einem Rhythmus zusammenzuziehen, der an das menschliche Herz erinnert 2,3. Bemerkenswert ist, dass einzelne hiPSC-CMs aneinander koppeln und funktionelle Synzytien bilden, die als ein einziges Gewebe schlagen. Heutzutage werden hiPS-Zellen routinemäßig aus Blutproben von Patienten gewonnen, so dass jede Person mit In-vitro-hiPSC-CM-Screening-Assays für die Kardiotoxizität dargestellt werden kann 4,5. Dies schafft die Möglichkeit, "klinische Studien in einer Schale" durchzuführen, bei denen verschiedene Populationen signifikant vertreten sind6.
Ein entscheidender Vorteil gegenüber bestehenden Screening-Ansätzen für die Kardiotoxizität von Tieren und tierischen Zellen besteht darin, dass hiPSC-CMs das gesamte menschliche Genom nutzen und ein In-vitro-System mit genetischen Ähnlichkeiten zum menschlichen Herzen bieten. Dies ist besonders attraktiv für die Pharmakogenomik und die personalisierte Medizin - die Verwendung von hiPSC-CMs für die Entwicklung von Medikamenten und anderen Therapien soll genauere, präzisere und sicherere Medikamentenverschreibungen ermöglichen. In der Tat haben sich zweidimensionale (2D) hiPSC-CM-Monolayer-Assays als prädiktiv für die Kardiotoxizität von Medikamenten erwiesen, wobei eine Reihe von klinisch eingesetzten Medikamenten mit einem bekannten Risiko für die Entstehung von Herzrhythmusstörungen verwendetwird 1,7,8,9. Trotz des enormen Potenzials von hiPSC-CMs und des Versprechens, die Arzneimittelentwicklung zu rationalisieren und billiger zu machen, gab es eine Zurückhaltung bei der Verwendung dieser neuartigen Assays10,11,12.
Bisher ist eine wesentliche Einschränkung der weit verbreiteten Einführung und Akzeptanz von hiPSC-CM-Screening-Assays ihr unreifes, fetales Aussehen sowie ihre Funktion. Die kritische Frage der hiPSC-CM-Reifung wurde in der wissenschaftlichen Literatur bis zum Überdruss diskutiert 13,14,15,16. Ebenso wurden viele Ansätze eingesetzt, um die hiPSC-CM-Reifung zu fördern, darunter Manipulationen der extrazellulären Matrix (EZM) in 2D-Monoschichten und die Entwicklung von 3D-manipuliertem Herzgewebe (EHTs)17,18. Derzeit herrscht die weit verbreitete Überzeugung, dass die Verwendung von 3D-EHTs im Vergleich zu 2D-Monolayer-basierten Ansätzen eine bessere Reifung bieten wird. 2D-Monolagen bieten jedoch im Vergleich zu 3D-EHTs eine höhere Effizienz der Zellnutzung und einen höheren Erfolg bei der Beschichtung. 3D-EHTs verwenden eine größere Anzahl von Zellen und erfordern oft die Einbeziehung anderer Zelltypen, die die Ergebnisse verfälschen können. Daher liegt der Fokus in diesem Artikel auf der Verwendung einer einfachen Methode zur Reifung von hiPSC-CMs, die als 2D-Monolagen aus elektrisch und mechanisch gekoppelten Zellen kultiviert werden.
Eine fortgeschrittene hiPSC-CM-Reifung kann in 2D-Monolagen mit einem ECM erreicht werden. Die 2D-Monoschichten von hiPSC-CMs können mit Hilfe eines weichen, flexiblen Polydimethylsiloxan-Deckglases gereift werden, das mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die von einer Engelbreth-Holm-Schwarm-Maussarkomzelle (Maus-EZM) sezerniert wird. Im Jahr 2016 zeigten Berichte, dass hiPSC-CMs, die unter dieser weichen EZM-Erkrankung kultiviert wurden, funktionell reiften und Aktionspotential-Leitungsgeschwindigkeiten in der Nähe von Herzwerten bei Erwachsenen (~50 cm/s) aufwiesen18. Darüber hinaus zeigten diese reifen hiPSC-CMs viele andere elektrophysiologische Eigenschaften, die an das adulte Herz erinnern, einschließlich des hyperpolarisierten Ruhemembranpotentials und der Expression von Kir2.1. In jüngerer Zeit wurde in Berichten eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM-Beschichtung identifiziert, die die strukturelle Reifung von 2D-hiPSC-CMs fördert19. Hier werden einfach anzuwendende Methoden vorgestellt, um strukturell ausgereifte 2D-hiPSC-CM-Monolagen für den Einsatz in elektrophysiologischen Hochdurchsatz-Screens zu entwickeln. Darüber hinaus bieten wir die Validierung eines optischen Mapping-Instruments für die automatisierte Erfassung und Analyse der elektrophysiologischen Funktion von 2D-hiPSC-CM-Monolayern unter Verwendung spannungsempfindlicher Farbstoffe (VSDs) und kalziumsensitiver Sonden und Proteine an.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Aus humanen Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) werden verwendet, um die Abhängigkeit von Tieren und tierischen Zellen für präklinische Kardiotoxizitätstests zu ersetzen und zu verringern. In zweidimensionalen Monolayer-Formaten rekapitulieren hiPSC-CMs die Struktur und Funktion der adulten menschlichen Herzmuskelzellen, wenn sie auf einer optimalen extrazellulären Matrix (EZM) kultiviert werden. Eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM (Maturation-inducing extracellular matrix-MECM) reift die hiPSC-CM-Struktur, -Funktion und den Stoffwechselzustand innerhalb von 7 Tagen nach der Plattierung. 
Reife hiPSC-CM-Monoschichten sprechen auch auf klinisch relevante Medikamente erwartungsgemäß an, wobei ein bekanntes Risiko besteht, Herzrhythmusstörungen und Kardiotoxizität zu verursachen. Die Reifung von hiPSC-CM-Monoschichten war bisher ein Hindernis für die breite Akzeptanz dieser wertvollen Zellen für die regulatorische Wissenschaft und das Sicherheitsscreening. In diesem Artikel werden validierte Methoden für das Platting, die Reifung und die funktionelle Phänotypisierung der elektrophysiologischen und kontraktilen Funktion von hiPSC-CM vorgestellt. Diese Methoden gelten sowohl für kommerziell erhältliche gereinigte Kardiomyozyten als auch für aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten, die intern mit hocheffizienten, kammerspezifischen Differenzierungsprotokollen erzeugt werden. 
Die elektrophysiologische Funktion im Hochdurchsatz wird entweder mit spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSDs; Emission: 488 nm), kalziumempfindlichen Fluorophoren (CSFs) oder genetisch kodierten Kalziumsensoren (GCaMP6) gemessen. Ein optisches Hochdurchsatz-Kartierungsgerät wird für die optische Aufzeichnung jedes Funktionsparameters verwendet, und eine spezielle Software wird für die elektrophysiologische Datenanalyse verwendet. MECM-Protokolle werden für das Medikationsscreening unter Verwendung eines positiven inotropen (Isoprenalin) und humanen Ether-a-go-go-related gene (hERG)-Kanal-spezifischen Blockers angewendet. Diese Ressourcen werden es anderen Prüfärzten ermöglichen, ausgereifte hiPSC-CMs erfolgreich für Hochdurchsatz, präklinisches Kardiotoxizitätsscreening, Wirksamkeitstests von Herzmedikamenten und kardiovaskuläre Forschung einzusetzen.

hiPSC-CM-Reifung durch Phasenkontrast und konfokale Immunfluoreszenzbildgebung Der Zeitplan für die ECM-vermittelte Reifung kommerziell erhältlicher hiPSC-CMs unter Verwendung von MECM-beschichteten 96-Well-Platten ist in Abbildung 1A dargestellt. Diese Daten werden mit kommerziell erhältlichen Kardiomyozyten gesammelt, die als kryokonservierte Zellfläschchen ins Labor kommen. Jede Durchstechflasche enthält >5 × 106 lebensfähige Kardiomyozyten. Die Zelle...

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Dieses Protokoll ist bedeutsam, da es Forschern ermöglicht, kommerzielle oder intern hergestellte hiPSC-CMs zu einem erwachsenenähnlichen Phänotyp heranreifen zu lassen, der den prädiktiven Wert von hiPSC-CMs im Kardiotoxizitätsscreening signifikant verbessert. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ausgereifte hiPSC-CMs in einem Hochdurchsatzformat für die optische Abbildung von Kalzium oder Spannungsänderungen liefert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen oder Medikamente auf Kardiotoxizität zu untersuchen.Das Verfahren wird von Jeffrey Creech, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, die reifungsinduzierende extrazelluläre Matrix (MECM) zweimal mit 200 Mikrolitern Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 1 Stunde vor der Kardiomyozytenbeschichtung zu waschen. Halten Sie die Brunnen hydratisiert.Übertragen Sie die Kardiomyozytenröhrchen aus dem Flüssigstickstofftank in Trockeneis und lassen Sie den Druck ab, indem Sie die Röhrchenkappen leicht öffnen. Als nächstes verschließen Sie die Tubenkappen wieder und tauen Sie sie 4 Minuten lang im Wasserbad auf. Nach dem Auftauen der Zellen besprühen Sie die Röhrchen mit 70%igem Ethanol, bevor Sie sie öffnen.Übertragen Sie die Zellen mit einer 1-Milliliter-Pipette in konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 1 Milliliter Beschichtungsmedium in das Kryopapier und füllen Sie die Wäsche in das konische 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend langsam 1 Milliliter Beschichtungsmedium abtropfen lassen und das Röhrchen umrühren.Wiederholen Sie dies bis zum Umfüllen von 8 Millilitern Beschichtungsmedium. Zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter des Beschichtungsmediums. Entfernen Sie ein Aliquot und führen Sie die Lebendzellzählung mit einem Hämozytometer durch, bevor Sie ein Beschichtungsmedium hinzufügen, um 7,5 x 10 bis 5 Zellen pro Milliliter zu erhalten.Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension pro Well einer MECM-beschichteten 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette ab und inkubieren Sie die Zellen 2 Tage lang. Ersetzen Sie als Nächstes das Medium durch 200 Mikroliter Pflegemedium und pflegen Sie die Platten 7 Tage lang, wobei das Medium am 5. Tag gewechselt wird. Führen Sie an Tag 7 einen EP-Test durch, wie im Text beschrieben.Achten Sie darauf, das Medium jeden zweiten Tag zu wechseln, wenn Sie sich für die Erweiterung der Zellkultur entscheiden. Um hiPSC-CM durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) zu reinigen, saugen Sie das Zellkulturmedium an und waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter HBSS-Methyls-Tetraessigsäure (EDTA). Inaktivieren Sie dann das Trypsin/EDTA, indem Sie die Zellen erneut senden und mit 2 Millilitern Beschichtungsmedium vereinzeln.Aus den sechs Vertiefungen werden die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Nachdem Sie das Sieb mit 3 Millilitern Beschichtungsmedium gewaschen haben, zählen Sie die Zellen. Nach dem Zählen zentrifugieren und waschen Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern eiskaltem MACS-Trennpuffer, bevor Sie es pelletieren und die Zellen in 80 Mikrolitern kaltem MACS-Trennpuffer pro 5 x 10 an die 6. Zellen erneut senden.Fügen Sie 20 Mikroliter kalten Cocktail zur Depletion von Nicht-Kardiomyozyten hinzu und mischen Sie die Suspension, bevor Sie sie 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. Nachdem Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 4 Millilitern kaltem MACS-Trennpuffer bei 300 x g gewaschen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern kaltem MACS-Trennpuffer. Fügen Sie 20 Mikroliter kalte Antibiotin-Mikrokügelchen pro 5 x 10 zu den 6. Zellen hinzu und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, bevor Sie sie 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.Platzieren Sie während der Inkubation der Proben die mit den 30-Mikrometer-Vorabscheidungsfiltern ausgestatteten Säulen mit positiver Abreicherung auf dem MACS-Separator und platzieren Sie die beschrifteten 15-Milliliter-Sammelröhrchen unter den Säulen. Als nächstes wird jede Säule mit 3 Millilitern kaltem MACS-Trennpuffer befüllt. Mischen Sie die mit Antikörpern behandelte Zellsuspension mit 2 Millilitern MACS-Trennpuffer und geben Sie sie in die Säule.Geben Sie 2 Milliliter MACS-Trennpuffer in jede Säule und sammeln Sie 12 Milliliter Durchfluss-Kardiomyozyten-Suspension. Zentrifugieren Sie die Kardiomyozyten und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Kardiomyozyten in einem 1-Milliliter-Beschichtungsmedium resuspendieren. Um die Konzentration zu bestimmen, zählen Sie die Zellen und stellen Sie das Volumen auf die gewünschte Seeding-Dichte ein, bevor Sie die gereinigten Kardiomyozytenzellen auf die MECM 96-Well-Platten plattieren.Aspirieren und ersetzen Sie das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium durch 100 Mikroliter spannungsempfindliche Farbstoffe (VSD) oder kalziumempfindliche Fluorophore (CSF) pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Ersetzen Sie die Farbstoffe nach 30 Minuten Inkubation durch ein Assaymedium oder HBSS. Gleichen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius aus, bevor Sie mit einem optischen Kartierungsgerät mit hohem Durchsatz eine optische Kartierung der Basisdaten erfassen.Um die Zellen mit Medikamenten für akute Expositionstests zu behandeln oder die Zellen zu kartieren, die chronisch den interessierenden Medikamenten ausgesetzt sind, verdünnen Sie die Medikamente in Dimethylsulfoxid oder DMSO und lagern Sie sie als Stammlösungen bei 20 Grad Celsius, bevor Sie sie in HBSS auf die gewünschten Konzentrationen verdünnen. Für Kardiotoxizitätstests in 96-Well-Platten werden vier Dosen einer Verbindung mit mindestens acht Wells pro Dosis hinzugefügt. Verwenden Sie Dosen, die von unterhalb bis oberhalb der klinisch wirksamen therapeutischen Plasmakonzentration reichen, einschließlich der effektiven Dosis.Ähnlich wie bei den elektrophysiologischen Basismessungen vor der Anwendung des Medikaments sollten elektrophysiologische Aufzeichnungen mindestens 30 Minuten nach der medikamentösen Behandlung für chronische Studien erfasst werden. Nach der Baseline-Aufzeichnung werden mindestens vier Dosen jedes Medikaments auf reife hiPSC-CMs-Monolagen, die GCaMP6m exprimieren, mit mindestens acht Vertiefungen pro Dosis appliziert. Bringen Sie die Medikamente 30 Minuten lang auf die Zellen und erwärmen Sie die Zellen vor und während der Datenerfassung auf 37 Grad Celsius.Nach Baseline-Aufnahmen einer ganzen Platte werden 500 nanomolare Isoproterenol in jede Vertiefung gegeben, um robuste Daten zum Ansprechen auf das Arzneimittel zu erhalten und die Auswirkungen von Isoproterenol auf die Monolagenschlagrate, die Kontraktionsamplitude und die vorübergehende Dauer von Kalzium zu quantifizieren. Um optische Mapping-Daten zu erfassen, öffnen Sie die vordere Schublade und positionieren Sie die Platte auf der Plattenheizung. Nachdem Sie die Erfassungssoftware geöffnet und den Speicherort für die Datei in der Software festgelegt haben, wählen Sie die Dauer von 10 bis 30 Sekunden und die Bildrate der Erfassung, um eine höhere zeitliche Auflösung zu erzielen, und klicken Sie auf Erfassung starten.Öffnen Sie die Analysesoftware, und wählen Sie auf der Registerkarte Importfilter entweder Nach einer einzelnen Datei suchen oder Mehrere kacheln, um eine Platte zu rekonstruieren. Wählen Sie die Dateien aus, geben Sie eine Anzahl von Zeilen und Spalten ein und wählen Sie Automatisch aus. Wählen Sie als Nächstes Pixelgröße aktualisieren, geben Sie den Abstand pro Pixel ein und verwenden Sie den Well-Assistenten, um die Position der Wells im Bild zu bestimmen, bevor Sie auf "Speichern verarbeiten" klicken und zur nächsten Registerkarte wechseln.Öffnen Sie die Registerkarte ROIs oder Regions of Interest und wählen Sie, ob Sie die ROIs manuell, automatisch oder gar nicht für ROIs zeichnen möchten, die für die Analyse der gesamten Platte berücksichtigt werden. Nachdem Sie die Region im Feld ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern", um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Vertiefungen ausblenden und Nur gefilterte anzeigen, um die ROIs zu visualisieren.Öffnen Sie die Registerkarte "Analyse" und wählen Sie jedes Well oder jeden ROI aus, um die Genauigkeit der automatischen Beat-Erkennung zu bestätigen. Fügen Sie Beats zu den Spuren hinzu oder entfernen Sie sie, indem Sie einen einzelnen Beat auswählen und die Entf-Taste auf der Tastatur drücken. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Speichern.Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte Analyse auf die Schaltfläche Zeit-Raum-Diagramm und fügen Sie die Linie hinzu, um das Zeit-Raum-Diagramm zu bestimmen, um die Daten für jedes Well oder den ROI zu visualisieren. Nachdem Sie eine horizontale oder vertikale Linie ausgewählt haben, klicken Sie auf Plot generieren. Nachdem Sie die genaue Beat-Erkennung sichergestellt haben, fahren Sie mit der Registerkarte Exportieren fort und wählen Sie Dateiformat, geben Sie die Option Beat-Statistik ein, bevor Sie auf Exportieren klicken.Öffnen Sie nach dem Export die Datendateien und führen Sie die ausgewählte statistische Analyseroutine aus. Die Phasenkontrast-Bildgebung zeigte, dass die hiPSC-CMs, die auf dem MECM plattiert wurden, reiften und sich strukturell von der gleichen Charge von hiPSC-CMs unterschieden, die auf dem Maus-ECM neu plattiert wurden. Reife Zellen wurden stäbchenförmig, während unreife Zellen eine kreisförmige Form behielten.Kardiomyozyten, die mit Alpha-Aktinin-Antikörpern gefärbt wurden, zeigten die typische Form der Zellen, die bei jeder EZM-Erkrankung kultiviert wurden. In Übereinstimmung mit der TnI-Färbung deutete die alpha-Aktinin-Färbung darauf hin, dass die auf dem MECM gereiften hiPSC-CMs einen stäbchenförmigen, reifen Phänotyp förderten und eine größere Sarkomerorganisation induzierten. Der mitochondriale Inhalt und die Aktivität unterschieden sich zwischen den Zellen, die auf der Maus-ECM und dem MECM kultiviert wurden.Die elektrophysiologischen Daten für Aktionspotentiale, die mit VSDs und dem optischen Mapping-System aufgezeichnet wurden, zeigten, dass die atrial-spezifischen Zellen eine signifikant schnellere spontane Schlagrate und eine kürzere Aktionspotentialdauer (APD80) aufweisen als die ventrikulären spezifischen Zellen. Heatmaps für die gesamte Platte für Parameter wie APD80 zeigten die Reproduzierbarkeit eines bestimmten Parameters innerhalb einer Platte. Typische Aktionspotentiale reifer hiPSC-CM-Monolagen zeigten die Aktionspotentialmorphologie isolierter und getesteter adulter Kardiomyozyten an.Ein typischer Aktionspotential, ein spontaner Rhythmus, zeigte sich ebenfalls. Als Reaktion auf Isoproterenol führte die Aktivierung der beta-1-adrenergen Rezeptoren zu einer positiven Chronotropie, einer positiven Inotropie und einer positiven Lusitropie. Die HiPSC-CM-Antwort auf humane Ether-a-go-go-related gene (hERG)-Kanalblocker, einschließlich E-4031, Domperidon, Vandetanib und Sotalol, wurde mit GCaMP6m-Kalziumfluoreszenz untersucht, um den Rhythmus zu überwachen.Die Studie zeigte die Detektion von frühen Nachdepolarisationen, die durch die Blockade des E-4031 hERG-Kanals verursacht werden. Arbeiten Sie schnell mit den Zellen in Suspension und vermeiden Sie Scherspannungen, indem Sie die Zellen schonend pipettieren. Führen Sie außerdem den Medienwechsel sorgfältig durch, um eine Schädigung der hiPS-Synzytie zu vermeiden.Nach diesem Verfahren können die Zellen Proteine, RNA, DNA und Lipide sammeln, um sie mit der von den Forschern bevorzugten Technik zu analysieren. Die Technik ermöglicht es Forschern, Krankheiten zu untersuchen und die Kardiotoxizität neuer Medikamente mit adulten Kardiomyozyten zu testen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

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Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

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3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

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Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

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Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

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Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

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Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

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Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...