Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL148068-04 ו- R44ES027703-02 (TJH).

השימוש ב-hiPSC בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת HPSCRO של אוניברסיטת מישיגן (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים וציוד. ראו טבלה 1 למדיה והרכביה.
1. הפשרה וציפוי hiPSC-CMs בהקפאה זמינים מסחרית להבשלה על מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות (M...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

ישנן מספר גישות שונות לבדיקת רעילות לב חוץ גופית באמצעות hiPSC-CMs. מאמר "שיטות עבודה מומלצות" שפורסם לאחרונה על השימוש ב- hiPSC-CMs הציג את מבחני המבחנה השונים, את הקריאות העיקריות שלהם, וחשוב מכך, את הפירוט של כל בדיקה לכימות תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי20. בנוסף לשימו...

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) אומתו בקנה מידה בינלאומי, והם זמינים לבדיקת רעילות לב חוץ גופית 1. ניתן לייצר hiPSC-CMs טהורים במיוחד במספרים כמעט בלתי מוגבלים, לשמר בהקפאה ולהפשיר. עם הציפוי מחדש, הם גם מתעוררים לחיים ומתחילים להתכווץ בקצב המזכיר את הלב האנושי 2,3. למרבה הפלא, hiPSC-CMs בודדים מתחברים זה לזה ויוצרים סינסיטיה פונקציונלית שפועמת כרקמה אחת. כיום, hiPSCs נגזרים באופן שגרתי מדגימות דם של מטופלים, כך שכל אדם יכול להיות מיוצג באמצעות בדיקות בדיקת רעילות לב במבחנה hiPSC-CM 4,5. כך נוצרת הזדמנות לבצע "ניסויים קליניים בצלחת", עם ייצוג משמעותי מאוכלוסיות מגוונות6.
יתרון קריטי אחד על פני גישות קיימות לבדיקת רעילות לב של תאי בעלי חיים ובעלי חיים הוא ש- hiPSC-CMs מנצלים את הגנום האנושי המלא ומציעים מערכת במבחנה עם דמיון גנטי ללב האנושי. זה אטרקטיבי במיוחד עבור פרמקוגנומיקה ורפואה מותאמת אישית - השימוש hiPSC-CMs עבור תרופות ופיתוח טיפול אחר צפוי לספק מרשמים מדויקים, מדויקים ובטוחים יותר לתרופות. ואכן, בדיקות חד-שכבתיות hiPSC-CM דו-ממדיות (2D) הוכיחו את עצמן כמנבאות רעילות לב-ריאוקסית של תרופות, באמצעות פאנל של תרופות בשימוש קליני עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב 1,7,8,9. למרות הפוטנציאל העצום של hiPSC-CMs וההבטחה לייעל ולהפוך את פיתוח התרופות לזול יותר, הייתה רתיעה משימוש בבדיקות חדשניות אלה10,11,12.
עד כה, מגבלה מרכזית אחת של אימוץ וקבלה נרחבים של בדיקות סקר hiPSC-CM היא המראה הלא בוגר והעוברי שלהם, כמו גם תפקודם. הנושא הקריטי של הבשלת hiPSC-CM נבדק ונידון בספרות המדעית ad nauseum13,14,15,16. כמו כן, גישות רבות שימשו לקידום הבשלת hiPSC-CM, כולל מניפולציות מטריצה חוץ-תאית (ECM) בחד-שכבות דו-ממדיות ופיתוח רקמות לב מהונדסות-תלת-ממדיות (EHTs)17,18. כרגע, קיימת אמונה רווחת כי השימוש ב- EHTs תלת ממדיים יספק התבגרות מעולה ביחס לגישות מבוססות חד-שכבות דו-ממדיות. עם זאת, חד-שכבות דו-ממדיות מספקות יעילות גבוהה יותר של ניצול תאים והצלחה מוגברת בציפוי בהשוואה ל-EHTs תלת-ממדיים; EHTs תלת-ממדיים משתמשים במספר גדול יותר של תאים, ולעתים קרובות דורשים הכללה של סוגי תאים אחרים שיכולים לבלבל תוצאות. לכן, במאמר זה, ההתמקדות היא בשימוש בשיטה פשוטה להבשלת hiPSC-CMs בתרבית כמונושכבות דו-ממדיות של תאים מצומדים חשמלית ומכנית.
ניתן להשיג הבשלה מתקדמת של hiPSC-CM בחד-שכבות דו-ממדיות באמצעות ECM. ניתן להבשיל את החד-שכבות הדו-ממדיות של hiPSC-CMs באמצעות כיסוי פולידימתילסילוקסאן רך וגמיש, המצופה במטריצת קרום מרתף המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר). בשנת 2016, דיווחים הראו כי hiPSC-CMs בתרבית על מצב ECM רך זה הבשילו פונקציונלית, והציגו מהירויות הולכה פוטנציאליות פעולה ליד ערכי לב בוגר (~ 50 ס"מ לשנייה)18. יתר על כן, hiPSC-CMs בוגרים אלה הציגו מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים רבים אחרים המזכירים את הלב הבוגר, כולל פוטנציאל קרום מנוחה היפרפולרי וביטוי של Kir2.1. לאחרונה, דיווחים זיהו ציפוי ECM אנושי שמקורו בתאי גזע פרינטליים המקדם את ההבשלה המבנית של hiPSC-CMsדו-ממדיים 19. כאן, שיטות קלות לשימוש מוצגות למונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בשלות מבחינה מבנית לשימוש במסכים אלקטרופיזיולוגיים בעלי תפוקה גבוהה. יתר על כן, אנו מספקים אימות של מכשיר מיפוי אופטי לרכישה וניתוח אוטומטיים של פונקציה אלקטרופיזיולוגית חד-שכבתית דו-ממדית hiPSC-CM, תוך שימוש בצבעים רגישים למתח (VSD) ובבדיקות וחלבונים רגישים לסידן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) משמשים להחליף ולהפחית את התלות בבעלי חיים ובתאי בעלי חיים לצורך בדיקות קרדיוטוקסיות פרה-קליניות. בפורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים, hiPSC-CMs משחזרים את המבנה והתפקוד של תאי שריר הלב האנושיים הבוגרים כאשר הם מאורגנים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית אופטימלית (ECM). ECM אנושי הנגזר מתאי גזע פרינטליים (מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות) מבשיל את המבנה, התפקוד והמצב המטבולי hiPSC-CM תוך 7 ימים לאחר הציפוי. 
חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות מגיבות כצפוי גם לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית, עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב ורעילות לב. ההבשלה של חד-שכבות hiPSC-CM היוותה מכשול לאימוץ נרחב של תאים יקרי ערך אלה למדע רגולטורי וסינון בטיחות, עד כה. מאמר זה מציג שיטות מאומתות עבור ציפוי, הבשלה ופנוטיפ פונקציונלי בתפוקה גבוהה של תפקוד אלקטרופיזיולוגי והתכווצות hiPSC-CM. שיטות אלה חלות על קרדיומיוציטים מטוהרים הזמינים באופן מסחרי, כמו גם קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע שנוצרו בתוך החברה באמצעות פרוטוקולי התמיינות יעילים ביותר, ספציפיים לחדר. 
תפקוד אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה נמדד באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD; פליטה: 488 ננומטר), פלואורופורים רגישים לסידן (CSFs), או חיישני סידן מקודדים גנטית (GCaMP6). מכשיר מיפוי אופטי בתפוקה גבוהה משמש להקלטות אופטיות של כל פרמטר פונקציונלי, ותוכנה ייעודית מותאמת אישית משמשת לניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים. פרוטוקולי MECM מיושמים לבדיקת תרופות באמצעות אינוטרופ חיובי (איזופרנלין) וחוסמי תעלות ספציפיים לערוץ Ether-a-go-go-go (hERG). משאבים אלה יאפשרו לחוקרים אחרים להשתמש בהצלחה ב- hiPSC-CMs בוגרים לבדיקות סקר פרה-קליניות פרה-קליניות לקרדיוטוקסיות, בדיקות יעילות של תרופות לב וכלי דם ומחקר קרדיווסקולרי.

הבשלת hiPSC-CM המאופיינת בניגודיות פאזה והדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית ציר הזמן להבשלה בתיווך ECM של hiPSC-CMs הזמינים מסחרית באמצעות לוחות 96 בארות מצופות MECM מוצג באיור 1A. נתונים אלה נאספים באמצעות קרדיומיוציטים זמינים מסחרית המגיעים למעבדה כמו בקבוקונים cryopreserved ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחוקרים להבשיל hiPSC-CMs מסחריים או מתוצרת בית לפנוטיפ דמוי מבוגר המשפר באופן משמעותי את הערך הניבוי של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות לב. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק hiPSC-CMs בוגרים בפורמט תפוקה גבוהה למיפוי אופטי של סידן או שינוי מתח. פרוטוקול זה עשוי לשמש לחקירת מנגנוני מחלה או לבדיקת רעילות לב בתרופות.מי שידגים את ההליך יהיה ג'פרי קריץ', עמית מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בשטיפת הצלחות החוץ-תאיות מעוררות ההתבגרות, או MECM, פעמיים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק, או HBSS, שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים. שמור על בארות hydrated.מעבירים את צינורות הקרדיומיוציטים ממיכל החנקן הנוזלי לייבוש קרח, ומשחררים את הלחץ על ידי פתיחה קלה של מכסי הצינורות. לאחר מכן, לאטום מחדש את כובעי הצינור ולהפשיר אותם באמבט המים במשך 4 דקות. לאחר הפשרת התאים, רססו את הצינורות באתנול 70% לפני פתיחתם.מעבירים את התאים לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר עם פיפטה של 1 מיליליטר. מוסיפים 1 מיליליטר של ציפוי בינוני לקריוביאל ומעבירים את הכביסה לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, לטפטף באיטיות 1 מיליליטר של ציפוי בינוני ולעורר את הצינור.חזור על זה עד העברת 8 מיליליטר של ציפוי בינוני. צנטריפוגה את צינור 15 מיליליטר ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו resuspend את הגלולה ב 1 מיליליטר של מדיום ציפוי. הסר aliquot, ולבצע ספירת תאים חיים עם hemocytometer לפני הוספת מדיום ציפוי כדי לקבל 7.5 x 10 לתאים 5 למיליליטר.מוציאים 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת 96 באר מצופה MECM באמצעות פיפטה רב ערוצית, ודגרים על התאים במשך יומיים. לאחר מכן, להחליף את המדיום עם 200 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה, ולשמור על הצלחות במשך 7 ימים, עם שינוי של מדיום ביום 5. ביום השביעי, בצע EP assay, כמתואר בטקסט.הקפד לשנות את המדיום כל יומיים כאשר בוחרים להרחיב את תרבית התא. כדי לטהר hiPSC-CM באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנטית, או MACS, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים עם מיליליטר אחד של HBSS-לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטי, או EDTA, ודגרה על התאים למשך 10 דקות. לאחר מכן, נטרל את הטריפסין/EDTA על ידי שליחה מחדש וסינגולריזציה של התאים עם 2 מיליליטר של מדיום ציפוי.מתוך שש הבארות, לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר באמצעות מסננת 70 מיקרומטר. לאחר שטיפת המסננת עם 3 מיליליטר של ציפוי בינוני, לספור את התאים. לאחר הספירה, צנטריפוגה ושטפו את גלולת התא עם 2 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS קר כקרח לפני הגלולה ושליחה מחדש של התאים ב 80 מיקרוליטר של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 x 10 לתאים 6.מוסיפים 20 מיקרוליטר של קוקטייל דלדול קר שאינו קרדיומיוציטים ומערבבים את התרחיף לפני הדגירה על קרח במשך 10 דקות. לאחר שטיפת התאים עם 4 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS קר ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשעות מחדש את הגלולה ב 80 מיקרוליטר של חיץ הפרדת MACS קר. הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין קרות לכל 5 x 10 לתאים השישיים, וערבב בעדינות את תרחיף התאים לפני הדגירה על קרח במשך 10 דקות.בזמן הדגירה, מקמו את עמודות הדלדול החיובי המצוידות במסנני קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר על מפריד MACS, והניחו את צינורות האיסוף המסומנים של 15 מיליליטר מתחת לעמודים. לאחר מכן, הפריימו כל עמודה עם 3 מיליליטר של מאגר הפרדת MACS קר. ערבבו את תרחיף התאים שטופל בנוגדנים עם 2 מיליליטר של מאגר הפרדת MACS והוסיפו אותו לעמודה.הוסף 2 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS לכל עמודה ואסוף 12 מיליליטר של השעיית קרדיומיוציטים זורמים. צנטריפוגות את הקרדיומיוציטים ומשליכים את הסופרנאטנט לפני השעיית הקרדיומיוציטים בתווך ציפוי של 1 מיליליטר. כדי לקבוע את הריכוז, ספור את התאים והתאם את הנפח לצפיפות הזריעה הרצויה לפני ציפוי תאי קרדיומיוציטים מטוהרים על לוחות MECM 96-well.שאפו והחליפו את מדיום תחזוקת הקרדיומיוציטים ב-100 מיקרוליטר צבעים רגישים למתח, או VSD, או פלואורופורים רגישים לסידן, או CSF, לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר 30 דקות של דגירה, להחליף את הצבעים עם מדיום הבדיקה או HBSS. אזן את התאים ב- 37 מעלות צלזיוס לפני קבלת מיפוי אופטי של נתונים בסיסיים באמצעות התקן מיפוי אופטי בעל תפוקה גבוהה.כדי לטפל בתאים עם תרופות לבדיקת חשיפה חריפה או למפות את התאים החשופים באופן כרוני לתרופות מעניינות, לדלל את התרופות בדימתיל סולפוקסיד, או DMSO, ולאחסן אותם כתמיסות מלאי ב 20 מעלות צלזיוס לפני דילול אותם HBSS לריכוזים הרצויים. לבדיקת רעילות לב בצלחות של 96 בארות, יש להוסיף ארבע מנות של תרכובת עם לפחות שמונה בארות בכל מנה. השתמש במינונים הנעים מלמטה ומעלה ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה מבחינה קלינית, כולל המינון היעיל.בדומה למדידות האלקטרופיזיולוגיות הבסיסיות לפני יישום תרופות, לכוד רישומי אלקטרופיזיולוגיה לפחות 30 דקות לאחר הטיפול התרופתי במחקרים כרוניים. לאחר הקלטות בסיסיות, יש למרוח לפחות ארבע מנות של כל תרופה על חד-שכבות hiPSC-CMs בוגרות המבטאות GCaMP6m, עם לפחות שמונה בארות למנה. אזנו את התרופות על התאים למשך 30 דקות, וחממו את התאים ל -37 מעלות צלזיוס לפני ובמהלך איסוף הנתונים.לאחר רישומים בסיסיים של צלחת שלמה, הוסף איזופרוטרנול ננו-מולארי לכל באר כדי לאפשר נתוני תגובה חזקים לתרופות ולכמת את ההשפעות של איזופרוטרנול על קצב פעימות חד-שכבתיות, משרעת התכווצות ומשך מעבר הסידן. כדי לקבל נתוני מיפוי אופטיים, פתח את המגירה הקדמית ומקם את הצלחת על מחמם הצלחות. לאחר פתיחת תוכנת הרכישה וקביעת מיקום שמירת הקבצים בתוכנה, בחר משך זמן של 10 עד 30 שניות וקצב פריימים של רכישה לקבלת רזולוציה זמנית גבוהה יותר, ולחץ על התחל רכישה.פתח את תוכנת הניתוח ובכרטיסייה ייבוא מסנן, בחר אתר קובץ בודד או פרוס מרובים כדי לבנות מחדש לוחית. בחר את הקבצים והזן מספר שורות ועמודות ובחר אוטומטי. לאחר מכן, בחר עדכן גודל פיקסל, הזן מרחק לפיקסל והשתמש באשף הבארות כדי לקבוע את מיקום הבארות בתמונה לפני לחיצה על עבד שמירה ומעבר לכרטיסייה הבאה.פתח את החזר ההשקעה, או את הכרטיסיה אזורי עניין, ובחר לצייר את החזר ההשקעה באופן ידני, אוטומטי, או לא להשתמש בהחזר השקעה כלל, אשר ייחשב לניתוח הצלחת כולה. לאחר בחירת האזור בבאר, לחץ על תהליך שמירה כפתור כדי לעבור לשלב הבא. סמן את התיבות הסתר בארות והצג רק מסוננים כדי להציג באופן חזותי את החזר ההשקעה.פתח את הכרטיסיה ניתוח, בחר כל באר או החזר השקעה כדי לאשר את הדיוק של זיהוי פעימות אוטומטי. הוסף או הסר פעימות מהעקבות על-ידי בחירת פעימה בודדת והקשה על Delete בלוח המקשים. לאחר שתסיים, לחץ על שמור.לאחר מכן, לחץ על לוח זמן-מרחב לחצן בכרטיסיה ניתוח והוסף את הקו כדי לקבוע את התוויית זמן-מרחב כדי להציג נתונים באופן חזותי עבור כל באר או החזר ההשקעה. לאחר בחירת קו אופקי או אנכי, לחץ על צור עלילה. לאחר הבטחת זיהוי הפעימות המדויק, המשך אל יצוא הכרטיסייה ובחר פורמט קובץ, הזן סטטיסטיקת פעימות אפשרות לפני לחיצה על יצא.לאחר הייצוא, פתח קבצי נתונים והפעל את שגרת הניתוח הסטטיסטי שנבחרה. הדמיית ניגודיות פאזה הראתה כי hiPSC-CMs המצופים על MECM התבגרו ונבדלו מבנית מאותה אצווה של hiPSC-CMs שצופו מחדש ב- ECM של העכבר. תאים בוגרים הפכו לצורת מוט, בעוד שתאים לא בוגרים שמרו על צורה מעגלית.קרדיומיוציטים מוכתמים בנוגדני אלפא-אקטינין הראו את הצורה האופיינית של התאים בתרבית בכל מצב ECM. בהתאם לצביעת ה-TnI, צביעת האלפא-אקטינין הצביעה על כך שה-hiPSC-CMs שהבשילו על ה-MECM קידמו פנוטיפ בוגר בצורת מוט וגרמו לארגון סרקומר גדול יותר. התוכן והפעילות של המיטוכונדריה היו שונים בין תאים שגודלו בתרבית בעכבר ECM ו-MECM.הנתונים האלקטרופיזיולוגיים של פוטנציאלי פעולה שתועדו באמצעות VSD ומערכת המיפוי האופטי הראו כי לתאים הספציפיים לפרוזדורים יש קצב פעימות ספונטני מהיר משמעותית ומשך פוטנציאל פעולה קצר יותר, או APD80, מאשר התאים הספציפיים לחדר. מפות חום של צלחת שלמה עבור פרמטרים כגון APD80 חשפו את יכולת השחזור של פרמטר נתון בתוך לוחית. פוטנציאלי פעולה אופייניים של חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות הצביעו על מורפולוגיית פוטנציאל הפעולה של קרדיומיוציטים בוגרים מבודדים ונבדקים.כמו כן הוצג קצב ספונטני אופייני של פוטנציאל פעולה. בתגובה לאיזופרוטרנול, הפעלת קולטני בטא-1-אדרנרגי גרמה לכרונוטרופיה חיובית, אינוטרופיה חיובית ולוזיטרופיה חיובית. תגובת HiPSC-CM לגן אנושי הקשור לאתר, או hERG, חוסם תעלות, כולל E-4031, דומפרידון, ונדטניב וסוטלול, נחקרה באמצעות GCaMP6m סידן פלואורסצנטי לניטור קצב.המחקר הראה זיהוי של לאחר דפולריזציה מוקדמת שנגרמה על ידי חסימת ערוץ E-4031 hERG. עבדו מהר עם התאים בתרחיף והימנעו מלחץ גזירה על ידי צנרת תאים בעדינות. בנוסף, בצע שינוי מדיה בזהירות כדי למנוע נזק לסינכרון hiPS.לאחר הליך זה, התאים ניתנים לאיסוף חלבונים, רנ"א, דנ"א ושומנים לצורך ניתוח בטכניקה המועדפת על החוקרים. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור מחלות ולבדוק רעילות לבבית של תרופות חדשות באמצעות קרדיומיוציטים דמויי מבוגרים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...