Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).

L'utilizzo di hiPSC in questo protocollo è stato approvato dal Comitato HPSCRO dell'Università del Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Vedere la tabella dei materiali per un elenco di materiali e attrezzature. Vedi Tabella 1 per i supporti e le loro composizioni.
1. Scongelamento e placcatura di hiPSC-CM crioconservate disponibili in commercio per la maturazione su una matrice extracellulare che induce maturazione (MECM)</strong...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Esistono diversi approcci allo screening della cardiotossicità in vitro utilizzando hiPSC-CMs. Un recente documento "Best Practices" sull'uso di hiPSC-CMs ha presentato i vari saggi in vitro , le loro letture primarie e, soprattutto, la granularità di ciascun test per quantificare la funzione elettrofisiologica cardiaca umana20. Oltre all'utilizzo di elettrodi perforanti a membrana, la misura più diretta della funzione elettrofisiologica cardiaca umana è fornita dai VSD. Le l...

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM) sono stati convalidati su scala internazionale e sono disponibili per lo screening cardiotossicologico in vitro 1. Gli hiPSC-CM altamente puri possono essere generati in numero virtualmente illimitato, crioconservati e scongelati. Dopo la riplaccatura, si rianimano e iniziano a contrarsi con un ritmo che ricorda il cuore umano 2,3. Sorprendentemente, i singoli hiPSC-CM si accoppiano tra loro e formano sincizia funzionale che batte come un singolo tessuto. Al giorno d'oggi, le hiPSC sono abitualmente derivate da campioni di sangue dei pazienti, quindi qualsiasi persona può essere rappresentata utilizzando saggi di screening della cardiotossicità hiPSC-CM in vitro 4,5. Ciò crea l'opportunità di eseguire "Clinical Trials in a Dish", con una rappresentanza significativa di diverse popolazioni6.
Un vantaggio critico rispetto agli attuali approcci di screening della cardiotossicità su animali e cellule animali è che gli hiPSC-CM utilizzano l'intero genoma umano e offrono un sistema in vitro con somiglianze genetiche con il cuore umano. Ciò è particolarmente interessante per la farmacogenomica e la medicina personalizzata: si prevede che l'uso di hiPSC-CM per lo sviluppo di farmaci e altre terapie fornisca prescrizioni di farmaci più accurate, precise e sicure. Infatti, i saggi monostrato bidimensionali (2D) hiPSC-CM hanno dimostrato di essere predittivi della cardiotossicità dei farmaci, utilizzando un pannello di farmaci clinicamente usati con un rischio noto di causare aritmie 1,7,8,9. Nonostante il vasto potenziale delle hiPSC-CM e la promessa di semplificare e rendere lo sviluppo di farmaci più economico, c'è stata una riluttanza a utilizzare questi nuovi saggi10,11,12.
Fino ad ora, uno dei principali limiti dell'adozione diffusa e dell'accettazione dei test di screening hiPSC-CM è il loro aspetto immaturo, simile al feto, così come la loro funzione. La questione critica della maturazione dell'hiPSC-CM è stata rivista e dibattuta nella letteratura scientifica fino alla nausea13,14,15,16. Allo stesso modo, sono stati impiegati molti approcci per promuovere la maturazione dell'hiPSC-CM, comprese le manipolazioni della matrice extracellulare (ECM) nei monostrati 2D e lo sviluppo di tessuti cardiaci ingegnerizzati 3D (EHT)17,18. Al momento, c'è una convinzione diffusa che l'uso di EHT 3D fornirà una maturazione superiore rispetto agli approcci basati su monostrato 2D. Tuttavia, i monostrati 2D offrono una maggiore efficienza nell'utilizzo delle celle e un maggiore successo nella placcatura rispetto agli EHT 3D; Gli EHT 3D utilizzano un numero maggiore di celle e spesso richiedono l'inclusione di altri tipi di cellule che possono confondere i risultati. Pertanto, in questo articolo, l'attenzione si concentra sull'utilizzo di un metodo semplice per maturare hiPSC-CM coltivati come monostrati 2D di cellule accoppiate elettricamente e meccanicamente.
La maturazione avanzata di hiPSC-CM può essere ottenuta in monostrati 2D utilizzando un ECM. I monostrati 2D di hiPSC-CMs possono essere maturati utilizzando un coprislip morbido e flessibile in polidimetilsilossano, rivestito con matrice di membrana basale secreta da una cellula di sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM di topo). Nel 2016, i rapporti hanno mostrato che le hiPSC-CM coltivate su questa condizione di ECM morbida sono maturate funzionalmente, mostrando velocità di conduzione del potenziale d'azione vicino ai valori cardiaci adulti (~ 50 cm / s)18. Inoltre, questi hiPSC-CM maturi hanno mostrato molte altre caratteristiche elettrofisiologiche che ricordano il cuore adulto, tra cui il potenziale di membrana a riposo iperpolarizzato e l'espressione di Kir2.1. Più recentemente, i rapporti hanno identificato un rivestimento ECM derivato da cellule staminali perinatali umane che promuove la maturazione strutturale di 2D hiPSC-CMs19. Qui vengono presentati metodi facili da usare per sviluppare strutturalmente i monostrati 2D hiPSC-CM per l'uso in schermi elettrofisiologici ad alta produttività. Inoltre, forniamo la validazione di uno strumento di mappatura ottica per l'acquisizione e l'analisi automatizzata della funzione elettrofisiologica monostrato 2D hiPSC-CM, utilizzando coloranti sensibili alla tensione (VSD) e sonde e proteine sensibili al calcio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

I cardiomiociti derivati da cellule staminali indotte umane (hiPSC-CM) sono utilizzati per sostituire e ridurre la dipendenza da animali e cellule animali per i test di cardiotossicità preclinica. Nei formati monostrato bidimensionali, le hiPSC-CM ricapitolano la struttura e la funzione delle cellule muscolari cardiache umane adulte quando coltivate su una matrice extracellulare ottimale (ECM). Una ECM (matrice extracellulare che induce la maturazione-inducendo la maturazione (MECM) derivata da cellule staminali perinatali umane matura la struttura, la funzione e lo stato metabolico dell'hiPSC-CM in 7 giorni dopo la placcatura. 
Anche i monostrati maturi di hiPSC-CM rispondono come previsto a farmaci clinicamente rilevanti, con un rischio noto di causare aritmie e cardiotossicità. La maturazione dei monostrati hiPSC-CM è stata un ostacolo all'adozione diffusa di queste preziose celle per la scienza normativa e lo screening di sicurezza, fino ad ora. Questo articolo presenta metodi convalidati per la placcatura, la maturazione e la fenotipizzazione funzionale ad alto rendimento della funzione elettrofisiologica e contrattile hiPSC-CM. Questi metodi si applicano ai cardiomiociti purificati disponibili in commercio, nonché ai cardiomiociti derivati da cellule staminali generati internamente utilizzando protocolli di differenziazione altamente efficienti e specifici per camera. 
La funzione elettrofisiologica ad alto rendimento viene misurata utilizzando coloranti sensibili alla tensione (VSD; emissione: 488 nm), fluorofori sensibili al calcio (CSF) o sensori di calcio geneticamente codificati (GCaMP6). Un dispositivo di mappatura ottica ad alta produttività viene utilizzato per le registrazioni ottiche di ciascun parametro funzionale e un software dedicato personalizzato viene utilizzato per l'analisi dei dati elettrofisiologici. I protocolli MECM sono applicati per lo screening dei farmaci utilizzando un inotropo positivo (isoprenalina) e bloccanti specifici del gene umano Ether-a-go-go-related (hERG). Queste risorse consentiranno ad altri ricercatori di utilizzare con successo hiPSC-CM maturi per lo screening preclinico della cardiotossicità ad alto rendimento, i test di efficacia dei farmaci cardiaci e la ricerca cardiovascolare.

Maturazione hiPSC-CM caratterizzata da contrasto di fase e imaging confocale immunofluorescente La tempistica per la maturazione mediata da ECM di hiPSC-CM disponibili in commercio utilizzando piastre a 96 pozzetti rivestite MECM è presentata nella Figura 1A. Questi dati vengono raccolti utilizzando cardiomiociti disponibili in commercio che arrivano in laboratorio come fiale crioconservate di cellule. Ogni flaconcino contiene >5 × 106 cardiomiociti vitali. L...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) offrono un'alternativa all'uso di animali per lo screening preclinico della cardiotossicità. Una limitazione all'adozione diffusa di hiPSC-CMs nello screening preclinico della tossicità è il fenotipo immaturo e fetale delle cellule. Qui sono presentati protocolli per la maturazione robusta e rapida delle hiPSC-CM.

Screening della cardiotossicità ad alto rendimento utilizzando monostrati di cardiomiociti pluripotenti indotti da cellule staminali umane mature

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Questo protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di maturare hiPSC-CMs commerciali o in-house in un fenotipo adulto che migliora significativamente il valore predittivo delle hiPSC-CMs nello screening della cardiotossicità. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce hiPSC-CM maturi in un formato ad alta produttività per la mappatura ottica del calcio o della variazione di tensione. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi della malattia o per lo screening di farmaci per la cardiotossicità.A dimostrare la procedura sarà Jeffrey Creech, un ricercatore associato del mio laboratorio. Iniziare lavando la matrice extracellulare che induce la maturazione, o MECM, piastre due volte con 200 microlitri di soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, 1 ora prima della placcatura cardiomiocitaria. Mantieni i pozzetti idratati.Trasferire i tubi cardiomiocitari dal serbatoio di azoto liquido al ghiaccio secco e rilasciare la pressione aprendo leggermente i tappi del tubo. Quindi, richiudere i tappi del tubo e scongelarli a bagnomaria per 4 minuti. Dopo lo scongelamento delle cellule, spruzzare i tubi con etanolo al 70% prima di aprirli.Trasferire le celle in tubi conici da 15 millilitri con una pipetta da 1 millilitro. Aggiungere 1 millilitro di mezzo di placcatura al crioviale e trasferire il lavaggio nel tubo conico da 15 millilitri. Quindi, gocciolare lentamente 1 millilitro di mezzo di placcatura e agitare il tubo.Ripetere l'operazione fino al trasferimento di 8 millilitri di mezzo di placcatura. Centrifugare il tubo da 15 millilitri a 300 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 1 millilitro del mezzo di placcatura. Rimuovere un'aliquota ed eseguire il conteggio delle cellule vive con un emocitometro prima di aggiungere un mezzo di placcatura per ottenere 7,5 x 10 alla 5a cellula per millilitro.Erogare 100 microlitri della sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestita MECM utilizzando una pipetta multicanale e incubare le celle per 2 giorni. Quindi, sostituire il mezzo con 200 microlitri di mezzo di manutenzione e mantenere le piastre per 7 giorni, con un cambio di mezzo il giorno 5. Il giorno 7, eseguire il test EP, come descritto nel testo.Assicurarsi di cambiare il terreno a giorni alterni quando si opta per l'estensione della coltura cellulare. Per purificare l'hiPSC-CM tramite la selezione cellulare attivata magneticamente, o MACS, aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule con 1 millilitro di HBSS-Quindi, dissociare le cellule aggiungendo 1 millilitro di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico, o EDTA, e incubare le cellule per 10 minuti. Quindi, inattivare la tripsina / EDTA reinviando e singolarizzando le cellule con 2 millilitri di mezzo di placcatura.Dai sei pozzetti, raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando un filtro da 70 micrometri. Dopo aver lavato il colino con 3 millilitri di mezzo di placcatura, contare le celle. Dopo il conteggio, centrifugare e lavare il pellet cellulare con 2 millilitri di tampone di separazione MACS ghiacciato prima di pellettare e inviare nuovamente le celle in 80 microlitri di tampone di separazione MACS freddo per 5 x 10 alle celle 6th.Aggiungere 20 microlitri di cocktail freddo di deplezione non cardiomiocitaria e mescolare la sospensione prima di incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Dopo aver lavato le celle con 4 millilitri di tampone di separazione MACS freddo a 300 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone di separazione MACS freddo. Aggiungere 20 microlitri di microsfere fredde anti-biotina per 5 x 10 alle 6 cellule e mescolare delicatamente la sospensione cellulare prima di incubare sul ghiaccio per 10 minuti.Durante l'incubazione dei campioni, posizionare le colonne di esaurimento positivo dotate dei filtri di pre-separazione da 30 micrometri sul separatore MACS e posizionare i tubi di raccolta da 15 millilitri etichettati sotto le colonne. Quindi, innescare ogni colonna con 3 millilitri di buffer di separazione MACS freddo. Mescolare la sospensione cellulare trattata con anticorpi con 2 millilitri di tampone di separazione MACS e aggiungerlo alla colonna.Aggiungere 2 millilitri di tampone di separazione MACS a ciascuna colonna e raccogliere 12 millilitri di sospensione cardiomiocitaria flowthrough. Centrifugare i cardiomiociti e scartare il surnatante prima di risospendere i cardiomiociti in un mezzo di placcatura da 1 millilitro. Per determinare la concentrazione, contare le cellule e regolare il volume alla densità di semina desiderata prima di placcare le cellule cardiomiocitarie purificate sulle piastre MECM a 96 pozzetti.Aspirare e sostituire il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti con 100 microlitri di coloranti sensibili alla tensione, o VSD, o fluorofori sensibili al calcio, o CSF, per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo 30 minuti di incubazione, sostituire i coloranti con un mezzo di analisi o HBSS. Equilibrare le celle a 37 gradi Celsius prima di acquisire la mappatura ottica dei dati di base utilizzando un dispositivo di mappatura ottica ad alta produttività.Per trattare le cellule con farmaci per test di esposizione acuta o mappare le cellule cronicamente esposte a farmaci di interesse, diluire i farmaci in dimetilsolfossido o DMSO e conservarli come soluzioni madre a 20 gradi Celsius prima di diluirli in HBSS alle concentrazioni desiderate. Per i test di cardiotossicità in piastre a 96 pozzetti, aggiungere quattro dosi di un composto con almeno otto pozzetti per dose. Utilizzare dosi che vanno da sotto a sopra la concentrazione plasmatica terapeutica clinicamente efficace, compresa la dose efficace.Analogamente alle misurazioni elettrofisiologiche di base prima dell'applicazione del farmaco, acquisire registrazioni elettrofisiologiche almeno 30 minuti dopo il trattamento farmacologico per gli studi cronici. Dopo le registrazioni basali, applicare almeno quattro dosi di ciascun farmaco ai monostrati hiPSC-CMs maturi che esprimono GCaMP6m, con almeno otto pozzetti per dose. Equilibrare i farmaci sulle cellule per 30 minuti e riscaldare le cellule a 37 gradi Celsius prima e durante l'acquisizione dei dati.Dopo le registrazioni basali di un'intera piastra, aggiungere 500 isoproterenolo nanomolare a ciascun pozzetto per consentire dati di risposta al farmaco robusti e quantificare gli effetti dell'isoproterenolo sulla frequenza di battito monostrato, sull'ampiezza della contrazione e sulla durata transitoria del calcio. Per acquisire i dati di mappatura ottica, aprire il cassetto anteriore e posizionare la piastra sul riscaldatore a piastre. Dopo aver aperto il software di acquisizione e determinato la posizione di salvataggio dei file nel software, selezionare la durata da 10 a 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi di acquisizione per una risoluzione temporale più elevata, quindi fare clic su Avvia acquisizione.Aprire il software di analisi e, nella scheda Filtro di importazione, selezionare Cerca un singolo file o Affianca multiplo per ricostruire una lastra. Selezionare i file e immettere un numero di righe e colonne, quindi selezionare Automatico. Quindi, seleziona Aggiorna dimensione pixel, inserisci la distanza per pixel e utilizza la Creazione guidata pozzo per determinare la posizione dei pozzi nell'immagine prima di fare clic su Elabora salvataggio e passare alla scheda successiva.Apri la scheda ROI o Regioni di interesse e scegli di disegnare i ROI manualmente, automaticamente o di non utilizzare affatto i ROI, che verranno considerati per l'analisi dell'intera piastra. Dopo aver selezionato la regione nel rizzetto, fare clic sul pulsante Elabora salvataggio per passare al passaggio successivo. Seleziona Nascondi pozzetti e Mostra solo caselle filtrate per visualizzare i ROI.Apri la scheda Analisi, seleziona ciascun pozzetto o ROI per confermare l'accuratezza del rilevamento automatico dei battiti. Aggiungere o rimuovere battute dalle tracce selezionando una singola battuta e premendo Canc sulla tastiera. Una volta fatto, fai clic su Salva.Quindi, fare clic sul pulsante Grafico spazio-tempo nella scheda Analisi e aggiungere la linea per determinare il grafico spazio-tempo per visualizzare i dati per ciascun pozzo o il ROI. Dopo aver selezionato una linea orizzontale o verticale, fare clic su Genera plot. Dopo esserti assicurato il rilevamento accurato dei battiti, vai alla scheda Esporta e seleziona Formato file, inserisci l'opzione Statistiche battiti prima di fare clic su Esporta.Una volta esportati, apri i file di dati ed esegui la routine di analisi statistica scelta. L'imaging a contrasto di fase ha mostrato che gli hiPSC-CM placcati sul MECM maturavano e diventavano strutturalmente distinti dallo stesso lotto di hiPSC-CM riplaccati sull'ECM del topo. Le cellule mature sono diventate a forma di bastoncello, mentre le cellule immature hanno mantenuto una forma circolare.I cardiomiociti colorati con anticorpi alfa-actina hanno mostrato la forma tipica delle cellule coltivate su ciascuna condizione di ECM. Coerentemente con la colorazione TnI, la colorazione alfa-actina ha indicato che gli hiPSC-CM maturati sul MECM hanno promosso un fenotipo maturo a forma di bastoncello e hanno indotto una maggiore organizzazione del sarcomero. Il contenuto e l'attività mitocondriale erano distinti tra le cellule coltivate sul topo ECM e la MECM.I dati elettrofisiologici per i potenziali d'azione registrati utilizzando VSD e il sistema di mappatura ottica hanno mostrato che le cellule atrial-specifiche hanno una frequenza di battito spontaneo significativamente più veloce e una durata del potenziale d'azione più breve, o APD80, rispetto alle cellule ventricolari specifiche. Le mappe di calore dell'intera piastra per parametri come APD80 hanno rivelato la riproducibilità di un determinato parametro all'interno di una piastra. I potenziali d'azione tipici dei monostrati hiPSC-CM maturi hanno indicato la morfologia del potenziale d'azione dei cardiomiociti adulti isolati e testati.È stato anche mostrato un tipico ritmo spontaneo del potenziale d'azione. In risposta all'isoproterenolo, l'attivazione dei recettori beta-1-adrenergici ha causato cronotropia positiva, inotropia positiva e lusitropia positiva. La risposta HiPSC-CM al gene umano correlato all'etere correlato, o hERG, bloccante dei canali, tra cui E-4031, domperidone, vandetanib e sotalolo, è stata studiata utilizzando la fluorescenza del calcio GCaMP6m per monitorare il ritmo.Lo studio ha mostrato il rilevamento delle prime depolarizzazioni post-depolarizzazioni causate dal blocco del canale E-4031 hERG. Lavorare velocemente con le celle in sospensione ed evitare lo stress da taglio pipettando delicatamente le cellule. Inoltre, eseguire la sostituzione dei supporti con attenzione per evitare di danneggiare la sincizia hiPS.Seguendo questa procedura, le cellule sono suscettibili per la raccolta di proteine, RNA, DNA e lipidi per l'analisi con la tecnica preferita dai ricercatori. La tecnica consente ai ricercatori di studiare le malattie e testare la cardiotossicità di nuovi farmaci utilizzando cardiomiociti simili agli adulti.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Ricerca

Bioingegneria

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...