Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

この作業は、NIH助成金HL148068-04およびR44ES027703-02(TJH)によってサポートされています。

このプロトコルにおけるhiPScの使用は、ミシガン大学HPSCRO委員会(ヒト多能性幹細胞監視委員会)によって承認された。材料と機器のリストについては、 材料表 を参照してください。メディアとその組成については 、表 1 を参照してください。
1. 市販の凍結保存済みhiPSC-CMを成熟誘導細胞外マトリックス(MECM)上で解凍・めっき
<ol><li>...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

hiPSC-CMを用いた in vitro 心毒性スクリーニングには、いくつかの異なるアプローチがあります。hiPSC-CMの使用に関する最近の「ベストプラクティス」論文では、さまざまな in vitro アッセイ、それらの主要な読み出し、そして重要なことに、ヒトの心臓電気生理学的機能を定量化するための各アッセイの粒度が提示されました20。メンブレンピアス電極の使用に加?...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は国際規模で検証されており、in vitro心毒性スクリーニングに利用できます1。高純度のhiPSC-CMは、事実上無制限の数で生成し、凍結保存し、解凍することができます。再メッキすると、彼らはまた蘇生し、人間の心臓を彷彿とさせるリズムで収縮し始めます2,3。驚くべきことに、個々のhiPSC-CMは互いに結合し、単一の組織として拍動する機能的合胞体を形成します。現在、hiPS細胞は日常的に患者の血液サンプルに由来するため、in vitro hiPSC-CM心毒性スクリーニングアッセイを使用して、あらゆる人を表すことができます4,5。これにより、「皿の中の臨床試験」を実施する機会が生まれ、多様な集団からの重要な代表がいます6。
既存の動物および動物細胞の心毒性スクリーニングアプローチに対する重要な利点の1つは、hiPSC-CMが完全なヒトゲノムを利用し、ヒト心臓と遺伝的に類似したin vitroシステムを提供することです。これは、薬理ゲノミクスや個別化医療にとって特に魅力的であり、薬物療法やその他の治療法の開発にhiPSC-CMを使用することで、より正確で正確かつ安全な投薬処方が可能になると予測されています。実際、2次元(2D)hiPSC-CM単層アッセイは、不整脈を引き起こすリスクが知られている臨床的に使用される薬物のパネルを使用して、薬物の心毒性を予測することが証明されています1、7、8、9。hiPSC-CMの大きな可能性と、医薬品開発を合理化し、より安価にすることを約束しているにもかかわらず、これらの新しいアッセイを使用することには消極的でした10、11、12。
これまで、hiPSC-CMスクリーニングアッセイの広範な採用と受け入れの大きな制限の1つは、未熟な胎児のような外観とその機能でした。hiPSC-CM成熟の重要な問題は、科学文献アドナウセウム13,14,15,16でレビューされ、議論されています。同様に、2D単層での細胞外マトリックス(ECM)操作や3D操作心臓組織(EHT)の開発など、hiPSC-CMの成熟を促進するために多くのアプローチが採用されてきました17,18。現時点では、3D EHTの使用は、2D単層ベースのアプローチと比較して優れた成熟度を提供すると広く信じられています。ただし、2D単分子膜は、3D EHTと比較して、セル利用の効率が高く、めっきの成功率が向上します。3D EHTはより多くの細胞を利用し、多くの場合、結果を混乱させる可能性のある他の細胞タイプを含める必要があります。そこで本稿では、電気的・機械的結合細胞の2次元単層として培養したhiPSC-CMを簡便な方法で成熟させることに焦点をあてます。
高度なhiPSC-CM成熟は、ECMを使用して2D単層で達成できます。hiPSC-CMの2D単分子膜は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される基底膜マトリックスでコーティングされた、柔らかく柔軟なポリジメチルシロキサンカバーガラスを使用して成熟させることができます。2016年には、このソフトECM条件で培養したhiPSC-CMが機能的に成熟し、成人の心臓値(~50 cm/s)に近い活動電位伝導速度を示すことが報告されました18。さらに、これらの成熟したhiPSC-CMは、過分極休止膜電位やKir2.1の発現など、成人の心臓を連想させる他の多くの電気生理学的特性を示しました。最近では、2D hiPSC-CMの構造的成熟を促進するヒト周産期幹細胞由来のECMコーティングが同定されたという報告があります19。ここでは、ハイスループット電気生理学的スクリーニングで使用するために、構造的に成熟した2D hiPSC-CM単分子膜に使いやすい方法を紹介します。さらに、電位感受性色素(VSD)とカルシウム感受性プローブおよびタンパク質を使用して、2D hiPSC-CM単層電気生理学的機能の自動取得と分析のための光学マッピング装置の検証を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

ヒト誘導幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性試験のために動物および動物細胞への依存を置き換え、軽減するために使用されます。2次元単層フォーマットでは、hiPSC-CMは、最適な細胞外マトリックス(ECM)上で培養すると、成人のヒト心筋細胞の構造と機能を再現します。ヒト周産期幹細胞由来ECM(成熟誘導細胞外マトリックス-MECM)は、プレーティング後7日でhiPSC-CMの構造、機能、代謝状態を成熟させます。 
成熟したhiPSC-CM単分子膜は、臨床的に関連する薬物療法にも期待どおりに反応し、不整脈や心毒性を引き起こすリスクが知られています。hiPSC-CM単分子膜の成熟は、これまで、これらの貴重な細胞を規制科学や安全性スクリーニングに広く採用する上での障害となっていました。本稿では、hiPSC-CMの電気生理学的および収縮機能のプレーティング、成熟、ハイスループットの機能的表現型分析のための検証済みの方法を紹介します。これらの方法は、市販の精製心筋細胞だけでなく、高効率のチャンバー特異的分化プロトコルを使用して社内で生成された幹細胞由来の心筋細胞にも適用されます。 
ハイスループットの電気生理学的機能は、電位感受性色素(VSD、発光:488 nm)、カルシウム感受性蛍光色素(CSF)、または遺伝子にコードされたカルシウムセンサー(GCaMP6)のいずれかを使用して測定されます。各機能パラメータの光学記録にはハイスループットの光学マッピング装置を使用し、電気生理学的データ解析にはカスタム専用ソフトウェアを使用します。MECMプロトコルは、陽性変力剤(イソプレナリン)およびヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル特異的遮断薬を使用した投薬スクリーニングに適用されます。これらのリソースにより、他の研究者は、ハイスループットの前臨床心毒性スクリーニング、心臓投薬効果試験、および心血管研究のために成熟したhiPSC-CMをうまく利用することができます。

位相差と免疫蛍光共焦点イメージングを特徴とするhiPSC-CM成熟 MECMコーティングされた96ウェルプレートを使用した市販のhiPSC-CMのECMを介した成熟のタイムラインを 図1Aに示します。これらのデータは、細胞の凍結保存されたバイアルとして実験室に到着する市販の心筋細胞を使用して収集されます。各バイアルには、>5×106 の生存心筋細胞が含ま?...

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

このプロトコルは、研究者が市販または自社製のhiPSC-CMを成人様表現型に成熟させ、心毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの予測値を大幅に改善することを可能にするため、重要です。このプロトコルの主な利点は、成熟したhiPSC-CMを高スループットフォーマットで提供し、カルシウムまたは電圧変化の光学マッピングを行うことです。このプロトコルは、疾患メカニズムを調査したり、心毒性の薬物をスクリーニングしたりするために使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるジェフリー・クリーチです。心筋細胞メッキの1時間前に、成熟を誘導する細胞外マトリックス(MECM)プレートを200マイクロリットルのハンク平衡塩溶液(HBSS)で2回洗浄することから始めます。ウェルを水和させてください。心筋細胞チューブを液体窒素タンクからドライアイスに移し、チューブキャップを少し開けて圧力を解放します。次に、チューブキャップを再シールし、水浴中で4分間解凍します。細胞を解凍した後、チューブを開く前に70%エタノールをチューブにスプレーします。細胞を1ミリリットルのピペットで15ミリリットルの円錐形チューブに移します。1ミリリットルのメッキ媒体をクライオバイアルに加え、洗浄液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。次に、1ミリリットルのメッキ媒体をゆっくりと滴下し、チューブを攪拌します。8ミリリットルのメッキ媒体を移すまでこれを繰り返します。15ミリリットルのチューブを300 x gで5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのメッキ媒体に再懸濁します。アリコートを除去し、血球計算盤で生細胞計数を行ってからプレーティング培地を添加し、ミリリットルあたり7.5 x 10〜5番目の細胞を得ました。マルチチャンネルピペットを使用して、MECMコーティングされた96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を分注し、細胞を2日間インキュベートします。次に、培地を200マイクロリットルの維持培地と交換し、プレートを7日間維持し、5日目に培地を交換します。7日目に、本文に記載されているようにEPアッセイを実行します。細胞培養の延長を選択する場合は、必ず一日おきに培地を交換してください。磁気活性化セルソーティング(MACS)を介してhiPSC-CMを精製するには、細胞培養培地を吸引し、1ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄し、1ミリリットルの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加して細胞を解離し、細胞を10分間インキュベートします。次に、2ミリリットルのプレーティング培地で細胞を再送して単離化することにより、トリプシン/EDTAを不活性化します。6つのウェルから、70マイクロメートルのストレーナーを使用して細胞を50ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。3ミリリットルのメッキ媒体でストレーナーを洗浄した後、細胞を数えます。計数後、遠心分離し、細胞ペレットを2ミリリットルの氷冷MACS分離バッファーで洗浄してから、ペレット化し、5 x 10あたり80マイクロリットルの冷たいMACS分離バッファーで細胞を6番目の細胞に再送します。20マイクロリットルの冷たい非心筋細胞枯渇カクテルを加え、氷上で10分間インキュベートする前に懸濁液を混合します。細胞を300 x gで5分間4ミリリットルのコールドMACS分離バッファーで洗浄した後、ペレットを80マイクロリットルのコールドMACS分離バッファーに再懸濁します。5 x 10あたり20マイクロリットルの冷たい抗ビオチンマイクロビーズを6番目の細胞に加え、細胞懸濁液を穏やかに混合してから、氷上で10分間インキュベートします。サンプルのインキュベーション中に、30マイクロメートルの予備分離フィルターを取り付けたポジティブデプレッションカラムをMACSセパレーターに配置し、ラベルの付いた15ミリリットルの収集チューブをカラムの下に置きます。次に、各カラムに3ミリリットルのコールドMACS分離バッファーをプライミングします。抗体処理した細胞懸濁液を2ミリリットルのMACS分離バッファーと混合し、カラムに加えます。各カラムに2ミリリットルのMACS分離バッファーを加え、12ミリリットルのフロースルー心筋細胞懸濁液を回収します。心筋細胞を遠心分離し、上清を廃棄してから、心筋細胞を1ミリリットルのメッキ培地に再懸濁します。濃度を決定するには、細胞をカウントし、精製心筋細胞をMECM 96ウェルプレートにプレーティングする前に、容量を目的の播種密度に調整します。心筋細胞維持培地を吸引し、96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルの電位感受性色素(VSD)またはカルシウム感受性蛍光色素(CSF)で交換します。30分間のインキュベーション後、色素をアッセイ培地またはHBSSと交換します。高スループット光学マッピングデバイスを使用してベースラインデータの光学マッピングを取得する前に、摂氏37度でセルを平衡化します。急性暴露試験用の薬物で細胞を処理するか、目的の薬物に慢性的に曝露された細胞をマッピングするには、薬物をジメチルスルホキシドまたはDMSOで希釈し、ストック溶液として摂氏20度で保存してから、HBSSで目的の濃度に希釈します。96ウェルプレートでの心毒性試験では、1用量あたり少なくとも8ウェルの化合物を4回投与します。有効用量を含む、臨床的に有効な治療血漿濃度の下から上の範囲の用量を使用してください。.薬物適用前のベースライン電気生理学測定と同様に、慢性研究のために薬物治療の少なくとも30分後に電気生理学の記録をキャプチャします。ベースライン記録後、GCaMP6mを発現する成熟hiPSC-CM単層に各薬剤を少なくとも4回投与し、1用量あたり少なくとも8ウェルを適用します。細胞上の薬を30分間平衡化し、データ取得の前と最中に細胞を摂氏37度に温めます。プレート全体のベースライン記録に続いて、500ナノモルのイソプロテレノールをすべてのウェルに追加して、堅牢な薬物反応データを可能にし、単層の拍動速度、収縮振幅、およびカルシウム過渡持続時間に対するイソプロテレノールの効果を定量化します。光学マッピングデータを取得するには、フロントドロワーを開き、プレートヒーターにプレートを配置します。集録ソフトウェアを開き、ソフトウェアでファイルの保存場所を決定したら、時間分解能を上げるために10〜30秒の収集時間とフレームレートを選択し、[集録の開始]をクリックします。解析ソフトウェアを開き、[インポート フィルタ]タブで、[単一ファイルを参照]または[複数タイル]を選択してプレートを再構築します。ファイルを選択し、行数と列数を入力して、[自動]を選択します。次に、[ピクセルサイズを更新]を選択し、ピクセルあたりの距離を入力し、ウェルウィザードを使用して画像内のウェルの位置を確認してから、[プロセス保存]をクリックして次のタブに移動します。ROIまたは関心領域タブを開き、ROIを手動で描画するか、自動的に描画するか、プレート全体の分析で考慮されるROIをまったく使用しないかを選択します。ウェルで領域を選択したら、[保存の処理]ボタンをクリックして次のステップに進みます。[ウェルを非表示にする] ボックスと [フィルターされたみを表示] チェックボックスをオンにして、ROI を視覚化します。[分析]タブを開き、各ウェルまたはROIを選択して、自動ビート検出の精度を確認します。トレースに拍を追加または削除するには、個々の拍を選択し、キーボードの Delete キーを押します。完了したら、[保存]をクリックします。次に、[分析]タブの[時空間プロット]ボタンをクリックし、各井戸のデータまたはROIを視覚化するための時空間プロットを決定する線を追加します。水平線または垂直線を選択したら、[プロットの生成]をクリックします。正確なビート検出を確認したら、[エクスポート]タブに進み、[ファイル形式]を選択し、[エクスポート]をクリックする前に[ビート統計]オプションを入力します。エクスポートしたら、データファイルを開き、選択した統計分析ルーチンを実行します。位相差イメージングは、MECMにメッキされたhiPSC-CMが成熟し、マウスECMに再メッキされたhiPSC-CMの同じバッチと構造的に異なることを示しました。成熟細胞は棒状になり、未熟細胞は円形を保った。α-アクチニン抗体で染色された心筋細胞は、各ECM条件で培養した細胞の典型的な形状を示した。TnI染色と一致して、α-アクチニン染色は、MECM上で成熟したhiPSC-CMが棒状の成熟表現型を促進し、より大きなサルコメア組織を誘導することを示しました。ミトコンドリア含量および活性は、マウスECM上で培養された細胞とMECMで異なっていた。VSDと光学マッピングシステムを使用して記録された活動電位の電気生理学的データは、心房特異的細胞が心室特異的細胞よりも有意に速い自発拍動速度と短い活動電位持続時間(APD80)を有することを示した。APD80などのパラメータのプレート全体のヒートマップにより、プレート内の特定のパラメータの再現性が明らかになりました。成熟hiPSC-CM単層の典型的な活動電位は、単離および試験された成体心筋細胞の活動電位形態を示した。典型的な活動電位自発リズムも表示された。イソプロテレノールに応答して、β-1-アドレナリン作動性受容体の活性化は、正の変時変化、正の変力、および正のルシトロピーを引き起こした。E-4031、ドンペリドン、バンデタニブ、ソタロールなどのヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル遮断薬に対するHiPSC-CM応答を、GCaMP6mカルシウム蛍光を用いて研究し、リズムをモニターしました。この研究は、E-4031 hERGチャネル遮断によって引き起こされる早期の脱分極後の検出を示しました。懸濁液中の細胞で迅速に作業し、細胞を穏やかにピペッティングすることでせん断応力を回避します。また、hiPSシンシチウムの損傷を防ぐため、メディア交換を慎重に行ってください。この手順に続いて、細胞は研究者のお気に入りの技術で分析するためのタンパク質、RNA、DNA、および脂質の収集に適しています。この技術により、研究者は成人様心筋細胞を使用して疾患を調査し、新薬の心毒性を試験することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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