Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

이 작업은 NIH 보조금 HL148068-04 및 R44ES027703-02(TJH)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜에서 hiPSC 사용은 미시간 대학 HPSCRO 위원회(Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee)에 의해 승인되었습니다. 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오. 미디어와 그 구성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
1. 성숙 유도 세포외 기질(MECM)에서 성숙을 위해 상업적으로 이용 가능한 냉동 보존된 hiPSC-CM의 해동 및 도금
<ol><li>모든 ...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

hiPSC-CM을 사용한 체외 심장 독성 스크리닝에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. hiPSC-CM의 사용에 관한 최근의 "모범 사례" 논문은 다양한 체외 분석법, 1차 판독값, 그리고 중요하게는 인간 심장 전기생리학적 기능을 정량화하기 위한 각 분석의 세분성을 제시했다20. 멤브레인 피어싱 전극을 사용하는 것 외에도 인간의 심장 전기생리학적 기능에 대한 가장 직접적인 ...

인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)는 국제적 규모로 검증되었으며, 체외 심장독성 스크리닝에 사용할 수 있다1. 고순도 hiPSC-CM은 거의 무제한으로 생성, 냉동 보존 및 해동할 수 있습니다. 다시 도금 할 때, 그들은 또한 인간의 심장 2,3을 연상시키는 리듬으로 다시 살아 움직이고 수축하기 시작합니다. 놀랍게도, 개별 hiPSC-CM은 서로 결합되어 단일 조직으로 뛰는 기능적 세포융합을 형성합니다. 오늘날, hiPSC는 일상적으로 환자의 혈액 샘플에서 추출되므로, 시험관 내 hiPSC-CM 심장독성 스크리닝 분석법을 사용하여 모든 사람을 대표할 수 있다 4,5. 이를 통해 "Clinical Trials in a Dish"를 수행할 수 있는 기회가 주어지며, 다양한 집단을 대표하는 비율이 높아진다6.
기존 동물 및 동물 세포 심장 독성 스크리닝 접근법에 비해 한 가지 중요한 이점은 hiPSC-CM이 전체 인간 게놈을 활용하고 인간 심장과 유전적 유사성을 가진 시험관 내 시스템을 제공한다는 것입니다. 이는 약물유전체학 및 개인 맞춤 의학에 특히 매력적이며, 약물 및 기타 치료법 개발에 hiPSC-CM을 사용하면 보다 정확하고 정확하며 안전한 약물 처방을 제공할 것으로 예상됩니다. 실제로, 2차원(2D) hiPSC-CM 단층 분석은 부정맥을 유발할 위험이 있는 것으로 알려진 임상적으로 사용되는 약물 패널을 사용하여 약물 심장 독성을 예측하는 것으로 입증되었습니다 1,7,8,9. hiPSC-CM의 방대한 잠재력과 약물 개발을 간소화하고 더 저렴하게 만들겠다는 약속에도 불구하고 이러한 새로운 분석법을 사용하는 것을 꺼려했습니다10,11,12.
지금까지 hiPSC-CM 스크리닝 분석의 광범위한 채택 및 수용의 주요 한계 중 하나는 미성숙하고 태아와 유사한 외관과 기능입니다. hiPSC-CM 성숙의 중요한 문제는 과학 문헌 광고 메스꺼움13,14,15,16에서 검토되고 논의되었습니다. 마찬가지로, 2D 단층의 세포외 기질(ECM) 조작 및 3D 공학 심장 조직(EHT)의 개발을 포함하여 hiPSC-CM 성숙을 촉진하기 위해 많은 접근 방식이 사용되었습니다17,18. 현재 3D EHT를 사용하면 2D 단층 기반 접근 방식에 비해 우수한 성숙도를 제공할 것이라는 믿음이 널리 퍼져 있습니다. 그러나 2D 단층은 3D EHT에 비해 셀 활용 효율이 높고 도금 성공률이 높습니다. 3D EHT는 더 많은 수의 셀을 사용하며, 종종 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 다른 셀 유형을 포함해야 합니다. 따라서 이 기사에서는 전기적 및 기계적으로 결합된 세포의 2D 단층으로 배양된 hiPSC-CM을 성숙시키는 간단한 방법을 사용하는 데 중점을 둡니다.
ECM을 사용하여 2D 단층에서 고급 hiPSC-CM 성숙을 달성할 수 있습니다. hiPSC-CM의 2D 단층은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에서 분비되는 기저막 매트릭스로 코팅된 부드럽고 유연한 폴리디메틸실록산 커버슬립을 사용하여 성숙할 수 있습니다. 2016년 보고서에 따르면 이 부드러운 ECM 조건에서 배양된 hiPSC-CM은 기능적으로 성숙하여 성인 심장 값(~50cm/s)에 가까운 활동 전위 전도 속도를 나타냅니다18. 또한, 이러한 성숙한 hiPSC-CM은 과분극 휴지막 전위 및Kir2.1의 발현을 포함하여 성인 심장을 연상시키는 많은 다른 전기생리학적 특성을 나타냈습니다. 보다 최근에, 보고된 바에 따르면, 2차원 hiPSC-CM의 구조적 성숙을 촉진하는 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM 코팅이 확인되었다19. 여기에서는 고처리량 전기생리학적 스크린에 사용하기 위해 구조적으로 성숙한 2D hiPSC-CM 단층에 사용하기 쉬운 방법을 제시합니다. 또한 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 프로브 및 단백질을 사용하여 2D hiPSC-CM 단층 전기생리학적 기능의 자동 획득 및 분석을 위한 광학 매핑 기기의 검증을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

인간 유도 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 전임상 심장 독성 시험을 위해 동물 및 동물 세포에 대한 의존도를 대체하고 감소시키는 데 사용됩니다. 2차원 단층 형식에서 hiPSC-CM은 최적의 세포외 기질(ECM)에서 배양할 때 성인 인간 심장 근육 세포의 구조와 기능을 요약합니다. 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM(성숙유도 세포외 기질-MECM)은 도금 후 7일 만에 hiPSC-CM의 구조, 기능 및 대사 상태를 성숙시킵니다. 
성숙한 hiPSC-CM 단층은 또한 부정맥 및 심장 독성을 유발할 위험이 있는 알려진 임상적으로 관련된 약물에 예상대로 반응합니다. hiPSC-CM 단층의 성숙은 지금까지 규제 과학 및 안전성 스크리닝을 위해 이러한 귀중한 세포를 널리 채택하는 데 걸림돌이었습니다. 이 기사에서는 hiPSC-CM 전기생리학적 및 수축 기능의 도금, 성숙 및 고처리량, 기능적 표현형에 대한 검증된 방법을 제시합니다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 정제된 심근 세포뿐만 아니라 매우 효율적인 챔버 특이적 분화 프로토콜을 사용하여 사내에서 생성된 줄기 세포 유래 심근 세포에도 적용됩니다. 
고처리량 전기생리학적 기능은 전압에 민감한 염료(VSD, 방출: 488nm), 칼슘 민감성 형광단(CSF) 또는 유전적으로 암호화된 칼슘 센서(GCaMP6)를 사용하여 측정됩니다. 고처리량 광학 매핑 장치는 각 기능 매개변수의 광학 기록에 사용되며 맞춤형 전용 소프트웨어는 전기생리학적 데이터 분석에 사용됩니다. MECM 프로토콜은 양성 수축 촉진제(이소프레날린) 및 인간 에테르-고-고-고-관련 유전자(hERG) 채널 특이적 차단제를 사용하여 약물 스크리닝에 적용됩니다. 이러한 리소스를 통해 다른 연구자는 고처리량, 전임상 심장 독성 스크리닝, 심장 약물 효능 테스트 및 심혈관 연구를 위해 성숙한 hiPSC-CM을 성공적으로 활용할 수 있습니다.

위상차 및 면역형광 공초점 이미징을 특징으로 하는 hiPSC-CM 성숙 MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM의 ECM 매개 성숙에 대한 타임라인은 그림 1A에 나와 있습니다. 이러한 데이터는 냉동 보존된 세포 바이알로 실험실에 도착하는 상업적으로 이용 가능한 심근 세포를 사용하여 수집됩니다. 각 바이알에는 >5 × 106 개의 생...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

이 프로토콜은 연구자들이 심장 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 예측 가치를 크게 향상시키는 성인과 유사한 표현형으로 상업용 또는 사내 제작 hiPSC-CM을 성숙시킬 수 있게 해주기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 칼슘 또는 전압 변화의 광학 매핑을 위해 고처리량 형식으로 성숙한 hiPSC-CM을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 질병 메커니즘을 조사하거나 심장 독성에 대한 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Jeffrey Creech가 될 것입니다. 심근 세포 도금 1 시간 전에 200 마이크로 리터의 행크 균형 염 용액 (HBSS)으로 성숙 유도 세포 외 기질 (MECM) 플레이트를 두 번 세척하는 것으로 시작하십시오. 우물에 수분을 공급하십시오.액체 질소 탱크에서 드라이 아이스로 심근 튜브를 옮기고 튜브 캡을 살짝 열어 압력을 해제합니다. 그런 다음 튜브 캡을 다시 밀봉하고 수조에서 4분 동안 해동합니다. 세포를 해동한 후 튜브를 열기 전에 튜브에 70% 에탄올을 뿌립니다.1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 극저온 혼합물에 1 밀리리터의 도금 매체를 첨가하고 세척액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 1 밀리리터의 도금 매체를 천천히 떨어 뜨리고 튜브를 저어줍니다.8 밀리리터의 도금 매체가 옮겨 질 때까지 이것을 반복하십시오. 15 밀리리터 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 도금 매체 1 밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 분취량을 제거하고, 도금 배지를 첨가하기 전에 혈구계로 살아있는 세포 계수를 수행하여 밀리리터당 7.5 x 10 내지 5번째 세포를 얻었다.MECM-코팅된 96-웰 플레이트의 웰 당 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 멀티채널 피펫을 사용하여 분주하고, 세포를 2일 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 배지를 200 마이크로리터의 유지 배지로 교체하고, 플레이트를 7일 동안 유지하고, 5일째에 배지를 교체한다. 7일째에 텍스트에 설명된 대로 EP 분석을 수행합니다.세포 배양 연장을 선택할 때 격일로 배지를 교체해야 합니다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 hiPSC-CM을 정제하려면 세포 배양 배지를 흡인하고 1밀리리터의 HBSS로 세포를 세척한 다음 1밀리리터의 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 또는 EDTA를 추가하여 세포를 해리하고 세포를 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 2밀리리터의 도금 매체로 세포를 재전송하고 특이화하여 트립신/EDTA를 비활성화합니다.6개의 웰에서 70마이크로미터 스트레이너를 사용하여 50밀리리터 원추형 튜브에 세포를 수집합니다. 3 밀리리터의 도금 매체로 여과기를 세척 한 후 세포를 세십시오. 계수 후, 펠릿화하기 전에 세포 펠릿을 2밀리리터의 얼음-차가운 MACS 분리 완충액으로 원심분리하고 세척하고, 세포를 5 x 10 당 80마이크로리터의 차가운 MACS 분리 완충액으로 6번째 세포로 재전송한다.차가운 비 심근 세포 고갈 칵테일 20 마이크로 리터를 추가하고 10 분 동안 얼음에서 배양하기 전에 현탁액을 혼합하십시오. 세포를 300 x g에서 5분 동안 4 밀리리터의 차가운 MACS 분리 완충액으로 세척한 후, 펠릿을 80 마이크로리터의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁시킨다. 5 x 10 당 20 마이크로 리터의 차가운 안티 비오틴 마이크로 비드를 6 번째 세포에 넣고 10 분 동안 얼음에서 배양하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.샘플이 배양되는 동안 MACS 분리기에 30마이크로미터 사전 분리 필터가 장착된 포지티브 공핍 컬럼을 배치하고 라벨이 부착된 15밀리리터 수집 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 다음으로, 3밀리리터의 콜드 MACS 분리 버퍼로 각 컬럼을 프라이밍합니다. 항체 처리된 세포 현탁액을 2밀리리터의 MACS 분리 완충액과 혼합하고 컬럼에 추가합니다.각 컬럼에 2 밀리리터의 MACS 분리 완충액을 첨가하고 12 밀리리터의 유동 심근 세포 현탁액을 수집한다. 심근 세포를 원심 분리하고 상층액을 버리고 심근 세포를 1 밀리리터 도금 매체에 재현 탁시킵니다. 농도를 결정하기 위해, 정제된 심근세포 세포를 MECM 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하기 전에 세포를 계수하고 원하는 파종 밀도로 부피를 조정한다.심근 세포 유지 배지를 96웰 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 전압에 민감한 염료(VSD) 또는 칼슘에 민감한 형광단(CSF)으로 흡인하고 교체합니다. 30분 배양 후 염료를 분석 배지 또는 HBSS로 교체합니다. 고처리량 광학 매핑 장치를 사용하여 기본 데이터 광학 매핑을 획득하기 전에 섭씨 37도에서 셀을 평형화합니다.급성 노출 테스트를 위해 약물을 사용하여 세포를 처리하거나 관심 약물에 만성적으로 노출된 세포를 매핑하려면 약물을 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 희석하고 섭씨 20도에서 원액으로 저장한 후 HBSS에서 원하는 농도로 희석합니다. 96 웰 플레이트에서 심장 독성 테스트를 위해 용량 당 최소 8 웰이있는 화합물을 4 회 추가합니다. 유효 용량을 포함하여 임상적으로 효과적인 치료 혈장 농도 아래에서 위 범위의 용량을 사용하십시오.약물 적용 전 기본 전기생리학 측정과 유사하게 만성 연구를 위해 약물 치료 후 최소 30분 후에 전기생리학 기록을 캡처합니다. 기준선 기록 후, 용량당 최소 8웰로 GCaMP6m을 발현하는 성숙한 hiPSC-CMs 단층에 각 약물을 최소 4회 투여합니다. 30분 동안 세포에서 약물을 평형화하고 데이터 수집 전과 도중에 세포를 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다.전체 플레이트의 기준선 기록에 따라 모든 웰에 500나노몰 이소프로테레놀을 추가하여 강력한 약물 반응 데이터를 가능하게 하고 단층 박동률, 수축 진폭 및 칼슘 과도 기간에 대한 이소프로테레놀의 효과를 정량화합니다. 광학 매핑 데이터를 수집하려면 전면 서랍을 열고 플레이트 히터에 플레이트를 배치합니다. 수집 소프트웨어를 열고 소프트웨어에서 파일 저장 위치를 결정한 후, 더 높은 시간 해상도를 위해 10-30초의 지속 시간과 수집 프레임 속도를 선택하고 수집 시작을 클릭합니다.해석 소프트웨어를 열고 필터 가져오기 탭에서 단일 파일 찾아보기 또는 다중 타일을 선택하여 플레이트를 재구성합니다. 파일을 선택하고 행과 열 수를 입력한 후 자동을 선택합니다. 그런 다음 픽셀 크기 업데이트를 선택하고 픽셀당 거리를 입력한 다음 Well Wizard를 사용하여 이미지에서 웰의 위치를 확인한 후 저장 처리를 클릭하고 다음 탭으로 이동합니다.ROI 또는 관심 영역 탭을 열고 ROI를 수동, 자동으로 그리거나 ROI를 전혀 사용하지 않도록 선택하여 전체 플레이트 분석에 고려됩니다. 웰에서 영역을 선택한 후 저장 처리 버튼을 클릭하여 다음 단계로 이동합니다. 웰 숨기기 및 필터링된 항목만 표시 상자를 선택하여 ROI를 시각화합니다.분석 탭을 열고 각 웰 또는 ROI를 선택하여 자동 박동 감지의 정확성을 확인합니다. 개별 비트를 선택하고 키보드에서 Delete 키를 눌러 추적에서 비트를 추가하거나 제거합니다. 완료되면 저장을 클릭합니다.그런 다음 분석 탭에서 시공간 플롯 버튼을 클릭하고 각 웰 또는 ROI에 대한 데이터를 시각화하기 위한 시공간 플롯을 결정하는 선을 추가합니다. 수평선 또는 수직선을 선택한 후 플롯 생성을 클릭합니다. 정확한 비트 감지를 확인한 후 내보내기 탭으로 이동하여 파일 형식을 선택하고 내보내기를 클릭하기 전에 비트 통계 옵션을 입력합니다.내보낸 후 데이터 파일을 열고 선택한 통계 분석 루틴을 실행합니다. 위상차 이미징은 MECM에 도금된 hiPSC-CM이 성숙하고 마우스 ECM에 재도금된 동일한 배치의 hiPSC-CM과 구조적으로 구별되는 것으로 나타났습니다. 성숙한 세포는 막대 모양이 된 반면 미성숙 세포는 원형을 유지했습니다.알파-액티닌 항체로 염색된 심근세포는 각 ECM 조건에서 배양된 세포의 전형적인 형태를 나타내었다. TnI 염색과 일치하게, 알파-액티닌 염색은 MECM에서 성숙한 hiPSC-CM이 막대 모양의 성숙 표현형을 촉진하고 더 큰 육종 조직을 유도했음을 나타냅니다. 미토콘드리아 함량 및 활성은 마우스 ECM과 MECM에서 배양된 세포 간에 구별되었다.VSDs 및 광학 매핑 시스템을 사용하여 기록된 활동 전위에 대한 전기생리학적 데이터는 심방 특이적 세포가 심실 특이적 세포보다 훨씬 더 빠른 자발적 박동 속도와 더 짧은 활동 전위 지속 시간(APD80)을 갖는 것으로 나타났습니다. APD80과 같은 매개변수에 대한 전체 플레이트 히트 맵은 플레이트 내에서 주어진 매개변수의 재현성을 보여주었습니다. 성숙한 hiPSC-CM 단층의 전형적인 활동 전위는 분리되고 테스트된 성인 심근 세포의 활동 전위 형태를 나타냅니다.전형적인 활동 전위 자발적인 리듬도 표시되었습니다. 이소프로테레놀에 대한 반응으로, 베타-1-아드레날린성 수용체의 활성화는 양성 크로노트로피, 양성 수축성 및 양성 윤활성을 유발하였다. E-4031, 돔페리돈, 반데타닙 및 소탈롤을 포함한 인간 Ether-a-go-go-go-관련 유전자 또는 hERG, 채널 차단제에 대한 HiPSC-CM 반응은 리듬을 모니터링하기 위해 GCaMP6m 칼슘 형광을 사용하여 연구되었습니다.이 연구는 E-4031 hERG 채널 차단으로 인한 초기 탈분극의 검출을 보여주었습니다. 현탁액에 있는 세포로 빠르게 작업하고 세포를 부드럽게 피펫팅하여 전단 응력을 피하십시오. 또한 hiPS syncytia가 손상되지 않도록 조심스럽게 미디어 교체를 수행하십시오.이 절차에 따라 세포는 연구자가 선호하는 기술로 분석하기 위해 단백질, RNA, DNA 및 지질 수집에 적합합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 성인과 같은 심근 세포를 사용하여 질병을 조사하고 신약의 심장 독성을 테스트 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...