Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av NIH-stipendene HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).

hiPSC-bruk i denne protokollen ble godkjent av University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialfortegnelsen for en liste over materialer og utstyr. Se tabell 1 for medier og deres komposisjoner.
1. Tining og plating av kommersielt tilgjengelige kryopreserverte hiPSC-CMs for modning på en modningsinduserende ekstracellulær matriks (MECM)
<ol><li>Varm alle reagensene til romtemperatur og ...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Det finnes flere forskjellige tilnærminger til in vitro kardiotoksisitetsscreening ved bruk av hiPSC-CM. En nylig "Best Practices" -artikkel om bruk av hiPSC-CMs presenterte de forskjellige in vitro-analysene , deres primære avlesninger, og viktigere, hver analyses granularitet for å kvantifisere human hjerteelektrofysiologisk funksjon20. I tillegg til å bruke membranpiercingelektroder, leveres det mest direkte målet på human hjerteelektrofysiologisk funksjon av VSD-er. VSD...

Humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter (hiPSC-CM) er validert på internasjonal skala, og er tilgjengelige for in vitro kardiotoksisitetsscreening1. Svært rene hiPSC-CM-er kan genereres i nesten ubegrenset antall, kryopreserveres og tines. Ved replating gjenoppliver de også og begynner å trekke seg sammen med en rytme som minner om menneskets hjerte 2,3. Bemerkelsesverdig, individuelle hiPSC-CMs par til hverandre og danner funksjonell syncyti som slår som et enkelt vev. I dag er hiPSCs rutinemessig avledet fra pasientens blodprøver, slik at enhver person kan representeres ved hjelp av in vitro hiPSC-CM kardiotoksisitetsscreeningsanalyser 4,5. Dette skaper muligheten til å utføre "Clinical Trials in a Dish", med betydelig representasjon fra ulike populasjoner6.
En kritisk fordel i forhold til eksisterende kardiotoksisitetsscreeningsmetoder for dyre- og dyreceller er at hiPSC-CMs bruker hele det menneskelige genomet og tilbyr et in vitro-system med genetiske likheter med menneskets hjerte. Dette er spesielt attraktivt for farmakogenomikk og personlig medisin - bruk av hiPSC-CMs for medisinering og annen terapiutvikling antas å gi mer nøyaktige, presise og sikre medisineringsresepter. Faktisk har todimensjonale (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist seg å være prediktive for kardiotoksisitet av medisiner, ved bruk av et panel av klinisk brukte medisiner med kjent risiko for å forårsake arytmier 1,7,8,9. Til tross for det enorme potensialet til hiPSC-CMs og løftet om å effektivisere og gjøre legemiddelutvikling billigere, har det vært en motvilje mot å bruke disse nye analysene10,11,12.
Hittil er en stor begrensning av utbredt adopsjon og aksept av hiPSC-CM screeninganalyser deres umodne, fosterlignende utseende, så vel som deres funksjon. Det kritiske spørsmålet om hiPSC-CM modning har blitt gjennomgått og debattert i den vitenskapelige litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samme måte har mange tilnærminger blitt brukt for å fremme hiPSC-CM-modning, inkludert ekstracellulær matrise (ECM) manipulasjoner i 2D monolayers og utviklingen av 3D-konstruerte hjertevev (EHTs)17,18. For øyeblikket er det en utbredt oppfatning at bruken av 3D EHT-er vil gi overlegen modning i forhold til 2D monolayer-baserte tilnærminger. Imidlertid gir 2D monolayers en høyere effektivitet av celleutnyttelse og økt suksess i plating sammenlignet med 3D EHT-er; 3D EHT-er bruker større antall celler, og krever ofte inkludering av andre celletyper som kan forvirre resultater. Derfor er fokuset i denne artikkelen på å bruke en enkel metode for å modne hiPSC-CMs dyrket som 2D monolayers av elektrisk og mekanisk koblede celler.
Avansert hiPSC-CM-modning kan oppnås i 2D monolayers ved bruk av en ECM. 2D-monolagene av hiPSC-CMs kan modnes ved hjelp av et mykt, fleksibelt polydimetylsiloksandeksel, belagt med kjellermembranmatrise utskilt av en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (mus ECM). I 2016 viste rapporter at hiPSC-CMs dyrket på denne myke ECM-tilstanden modnet funksjonelt, og viste aksjonspotensielle ledningshastigheter nær voksne hjerteverdier (~ 50 cm / s) 18. Videre viste disse modne hiPSC-CMene mange andre elektrofysiologiske egenskaper som minner om det voksne hjertet, inkludert hyperpolarisert hvilemembranpotensial og ekspresjon av Kir2.1. Mer nylig identifiserte rapporter et humant perinatalt stamcelleavledet ECM-belegg som fremmer strukturell modning av 2D hiPSC-CMs19. Her presenteres brukervennlige metoder for strukturelt modne 2D hiPSC-CM monolayers for bruk i elektrofysiologiske skjermer med høy gjennomstrømning. Videre tilbyr vi validering av et optisk kartleggingsinstrument for automatisert innsamling og analyse av 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funksjon, ved bruk av spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) og kalsiumfølsomme sonder og proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Humane induserte stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) brukes til å erstatte og redusere avhengigheten av dyr og dyreceller for preklinisk kardiotoksisitetstesting. I todimensjonale monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CMs strukturen og funksjonen til de voksne menneskelige hjertemuskelcellene når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrise (ECM). En human perinatal stamcelleavledet ECM (modningsinduserende ekstracellulær matriks-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funksjonen og metabolsk tilstand i 7 dager etter plating. 
Modne hiPSC-CM monolayers responderer også som forventet på klinisk relevante medikamenter, med kjent risiko for å forårsake arytmier og kardiotoksisitet. Modningen av hiPSC-CM monolayers var et hinder for den utbredte adopsjonen av disse verdifulle cellene for regulatorisk vitenskap og sikkerhetsscreening, til nå. Denne artikkelen presenterer validerte metoder for plettering, modning og høy gjennomstrømning, funksjonell fenotyping av hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funksjon. Disse metodene gjelder for kommersielt tilgjengelige rensede kardiomyocytter, så vel som stamcelleavledede kardiomyocytter generert internt ved hjelp av svært effektive, kammerspesifikke differensieringsprotokoller. 
Elektrofysiologisk funksjon med høy gjennomstrømning måles ved hjelp av enten spenningsfølsomme fargestoffer (VSD; utslipp: 488 nm), kalsiumfølsomme fluoroforer (CSF) eller genetisk kodede kalsiumsensorer (GCaMP6). En optisk kartleggingsenhet med høy gjennomstrømning brukes til optiske opptak av hver funksjonsparameter, og tilpasset dedikert programvare brukes til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller brukes til medisineringsscreening ved bruk av et positivt inotropt (isoprenalin) og humant Ether-a-go-go-relatert gen (hERG) kanalspesifikke blokkere. Disse ressursene vil gjøre det mulig for andre etterforskere å utnytte modne hiPSC-CMs for høy gjennomstrømning, preklinisk kardiotoksisitetsscreening, hjertemedisineffektivitetstesting og kardiovaskulær forskning.

hiPSC-CM modning karakterisert ved fasekontrast og immunfluorescerende konfokal avbildning Tidslinjen for ECM-mediert modning av kommersielt tilgjengelige hiPSC-CMer ved bruk av MECM-belagte 96-brønnsplater er presentert i figur 1A. Disse dataene samles inn ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kardiomyocytter som ankommer laboratoriet som kryopreserverte hetteglass med celler. Hvert hetteglass inneholder >5 × 106 levedyktige kardiomyocytter. Cellene er ~ 98...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) tilbyr et alternativ til å bruke dyr til preklinisk kardiotoksisitetsscreening. En begrensning for den utbredte adopsjonen av hiPSC-CMs i preklinisk toksisitetsscreening er den umodne, fosterlignende fenotypen til cellene. Her presenteres protokoller for robust og rask modning av hiPSC-CM.

Kardiotoksisitetsscreening med høy gjennomstrømning ved bruk av modne humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocyttmonolag

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Denne protokollen er viktig fordi den gjør det mulig for forskere å modne kommersielle eller internt fremstilte hiPSC-CMs til en voksenlignende fenotype som betydelig forbedrer den prediktive verdien av hiPSC-CMs i kardiotoksisitetsscreening. Den største fordelen med denne protokollen er at den leverer modne hiPSC-CMs i et høyt gjennomstrømningsformat for optisk kartlegging av kalsium eller spenningsendring. Denne protokollen kan brukes til å undersøke sykdomsmekanismer eller for å screene legemidler for kardiotoksisitet.Demonstrere prosedyren vil være Jeffrey Creech, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt. Begynn med å vaske den modningsinduserende ekstracellulære matrisen, eller MECM, plater to ganger med 200 mikroliter Hanks balansert saltløsning, eller HBSS, 1 time før kardiomyocyttbelegg. Hold brønnene hydrert.Overfør kardiomyocytrørene fra tanken med flytende nitrogen til tørris, og slipp trykket ved å åpne slangehettene litt. Deretter forsegles rørhettene og tine dem i vannbadet i 4 minutter. Etter tining av cellene, spray rørene med 70% etanol før du åpner dem.Overfør cellene til 15 milliliter koniske rør med en 1 milliliter pipette. Tilsett 1 milliliter pletteringsmedium til kryovialet og overfør vasken til 15 milliliter konisk rør. Deretter drypper du sakte 1 milliliter pletteringsmedium og beveg røret.Gjenta dette til overføringen av 8 ml pletteringsmedium. Sentrifuge 15 milliliters røret ved 300 x g i 5 minutter og resuspender pelleten i 1 milliliter av pletteringsmediet. Fjern en alikot, og utfør levende celletelling med et hemocytometer før du legger til et pletteringsmedium for å oppnå 7,5 x 10 til 5. celler per milliliter.Dispenser 100 mikroliter av cellesuspensjonen per brønn i en MECM-belagt 96-brønnplate ved hjelp av en flerkanalspipett, og inkuber cellene i 2 dager. Deretter bytter du ut mediet med 200 mikroliter vedlikeholdsmedium, og vedlikeholder platene i 7 dager, med en endring av medium på dag 5. På dag 7, utfør EP-analyse, som beskrevet i teksten.Sørg for å bytte medium annenhver dag når du velger å utvide cellekulturen. For å rense hiPSC-CM via magnetisk-aktivert cellesortering, eller MACS, aspirer cellekulturmediet og vask cellene med 1 milliliter HBSS-Deretter dissosierer cellene ved å tilsette 1 milliliter 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre, eller EDTA, og inkubere cellene i 10 minutter. Deaktiver deretter trypsin / EDTA ved å sende og singularisere cellene med 2 milliliter pletteringsmedium.Fra de seks brønnene samles cellene i et 50 milliliter konisk rør ved hjelp av en 70 mikrometer sil. Etter vasking av silen med 3 ml plating medium, telle cellene. Etter telling, sentrifuger og vask cellepelleten med 2 milliliter iskald MACS separasjonsbuffer før pelletering og sender cellene på nytt i 80 mikroliter kald MACS separasjonsbuffer per 5 x 10 til 6.Tilsett 20 mikroliter kald ikke-kardiomyocyttuttømmingscocktail og bland suspensjonen før den ruges på is i 10 minutter. Etter vasking av cellene med 4 ml kald MACS separasjonsbuffer ved 300 x g i 5 minutter, resuspenderes pelleten i 80 mikroliter kald MACS separasjonsbuffer. Tilsett 20 mikroliter kalde anti-biotinmikroperler per 5 x 10 til de 6. cellene, og bland forsiktig cellesuspensjonen før du inkuberer på is i 10 minutter.Mens prøvene ruger, plasser de positive uttømmingskolonnene utstyrt med 30 mikrometer pre-separasjonsfiltre på MACS-separatoren, og plasser de merkede 15 milliliters oppsamlingsrørene under kolonnene. Deretter primer du hver kolonne med 3 milliliter kald MACS-separasjonsbuffer. Bland den antistoffbehandlede cellesuspensjonen med 2 ml MACS separasjonsbuffer og legg den til kolonnen.Tilsett 2 ml MACS separasjonsbuffer til hver kolonne og samle 12 ml gjennomstrømningskardiomyocyttsuspensjon. Sentrifuge kardiomyocyttene og kast supernatanten før du resuspenderer kardiomyocyttene i et 1 milliliter platingmedium. For å bestemme konsentrasjonen, tell cellene og juster volumet til ønsket såtetthet før plating av de rensede kardiomyocyttcellene på MECM 96-brønnplatene.Aspirer og erstatt kardiomyocytt vedlikeholdsmedium med 100 mikroliter spenningsfølsomme fargestoffer, eller VSD, eller kalsiumfølsomme fluoroforer, eller CSF, per brønn på en 96-brønnplate. Etter 30 minutters inkubasjon, erstatt fargestoffene med et analysemedium eller HBSS. Balanserer cellene ved 37 grader Celsius før du henter optisk kartlegging av grunnlinjedata ved hjelp av en optisk kartleggingsenhet med høy gjennomstrømning.For å behandle cellene med legemidler for akutt eksponeringstesting eller kartlegge cellene kronisk utsatt for legemidler av interesse, fortynn legemidlene i dimetylsulfoksid, eller DMSO, og lagre dem som stamløsninger ved 20 grader Celsius før de fortynnes i HBSS til de ønskede konsentrasjonene. For kardiotoksisitetstesting i 96-brønnplater, tilsett fire doser av en forbindelse med minst åtte brønner per dose. Bruk doser fra under og over den klinisk effektive terapeutiske plasmakonsentrasjonen, inkludert den effektive dosen.I likhet med baseline elektrofysiologi målinger før legemiddel søknad, fange elektrofysiologi registreringer minst 30 minutter etter medikamentell behandling for kroniske studier. Etter baselineregistreringer, bruk minst fire doser av hver medisin til modne hiPSC-CMs monolayers som uttrykker GCaMP6m, med minst åtte brønner per dose. Balanserer medisinene på cellene i 30 minutter, og varm cellene til 37 grader Celsius før og under datainnsamlingen.Etter baselineopptak av en hel plate, tilsett 500 nanomolar isoproterenol til hver brønn for å muliggjøre robuste legemiddelresponsdata og kvantifisere effekten av isoproterenol på monolagsslaghastighet, sammentrekningsamplitude og kalsiumforbigående varighet. For å skaffe optiske kartdata, åpne frontskuffen og plasser platen på platevarmeren. Etter å ha åpnet anskaffelsesprogramvaren og bestemt filsparingsstedet i programvaren, velg 10 til 30 sekunders varighet og bildefrekvens for anskaffelse for høyere tidsoppløsning, og klikk Start anskaffelse.Åpne analyseprogrammet, og i kategorien Importfilter velger du enten Bla gjennom etter én enkelt fil eller Flere side ved side for å rekonstruere en plate. Velg filene, skriv inn et antall rader og kolonner, og velg Automatisk. Velg deretter Oppdater pikselstørrelse, skriv inn avstand per piksel, og bruk brønnveiviseren til å bestemme brønnens plassering i bildet før du klikker på Behandle lagring og flytter til neste fane.Åpne kategorien ROIer, eller Regioner av interesse, og velg å tegne avkastningen manuelt, automatisk, eller ikke bruke avkastning i det hele tatt, som vil bli vurdert for analysen av hele platen. Etter å ha valgt regionen i brønnen, klikker du på Process Save knappen for å gå til neste trinn. Merk av for Skjul brønner og Vis bare filtrerte bokser for å visualisere avkastningen.Åpne kategorien Analyse, velg hver brønn eller avkastning for å bekrefte nøyaktigheten av automatisk taktdeteksjon. Legg til eller fjern slag fra sporene ved å velge en individuell takt og trykke på Slett på tastaturet. Når du er ferdig, klikker du på Lagre.Deretter klikker du på Tid-romplott-knappen i kategorien Analyse og legger til linjen for å bestemme tidsromplottet for å visualisere data for hver brønn eller avkastningen. Etter å ha valgt en horisontal eller vertikal linje, klikk på Generer tomt. Etter å ha sikret nøyaktig beatdeteksjon, fortsett til Eksport kategorien og velg Filformat, skriv inn Beat Statistic alternativet før du klikker Eksporter.Når de er eksportert, åpner du datafiler og kjører den valgte statistiske analyserutinen. Avbildning av fasekontrast viste at hiPSC-CM-ene belagt på MECM modnet og ble strukturelt forskjellig fra samme gruppe hiPSC-CM som ble replisert på musens ECM. Modne celler ble stavformede, mens umodne celler beholdt en sirkulær form.Kardiomyocytter farget med alfa-aktininantistoffer viste den typiske formen på cellene dyrket ved hver ECM-tilstand. I samsvar med TnI-fargingen indikerte alfa-aktininfargingen at hiPSC-CMene modnet på MECM fremmet en stavformet moden fenotype og induserte større sarkomerorganisasjon. Mitokondrieinnhold og aktivitet var forskjellig mellom celler dyrket på musens ECM og MECM.De elektrofysiologiske dataene for aksjonspotensialer registrert med VSD og det optiske kartleggingssystemet viste at de atriespesifikke cellene har signifikant raskere spontan slagfrekvens og kortere aksjonspotensialvarighet, eller APD80, enn de ventrikkelspesifikke cellene. Helplate varmekart for parametere som APD80 avslørte reproduserbarheten til en gitt parameter i en plate. Typiske aksjonspotensialer for modne hiPSC-CM monolayers indikerte aksjonspotensialmorfologien til isolerte og testede voksne kardiomyocytter.En typisk aksjonspotensiell spontan rytme ble også vist. Som respons på isoproterenol forårsaket aktivering av beta-1-adrenerge reseptorer positiv kronotropi, positiv inotropi og positiv lusitropi. HiPSC-CM-respons på humant Ether-a-go-go-relatert gen, eller hERG, kanalblokker, inkludert E-4031, domperidon, vandetanib og sotalol, ble studert ved bruk av GCaMP6m kalsiumfluorescens for å overvåke rytmen.Studien viste påvisning av tidlige etterdepolariseringer forårsaket av E-4031 hERG-kanalblokaden. Arbeid raskt med cellene i suspensjon og unngå skjærspenning ved å pipetere celler forsiktig. I tillegg må du utføre mediebytte nøye for å unngå å skade hiPS-syncytien.Etter denne prosedyren er celler mottagelige for protein-, RNA-, DNA- og lipidinnsamling for analyse med etterforskernes favorittteknikk. Teknikken gir forskere mulighet til å undersøke sykdommer og teste for kardiotoksisitet av nye stoffer ved hjelp av voksenlignende kardiomyocytter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for High-throughput antifungal Drug Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injiserbare regenerativ Therapy og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Veiledet differensiering av modne nyrekapocytter fra menneskeskapte pluripotente stamceller under kjemisk definerte forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen nyre glomerulus chip konstruert fra humant induserte pluripotente stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluering av hjertekontraktilitetsmodulasjonsterapi i 2D humane stamcelleavledede kardiomyocytter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...