Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).

O uso do hiPSC neste protocolo foi aprovado pelo Comitê HPSCRO da Universidade de Michigan (Comitê de Supervisão de Células-Tronco Pluripotentes Humanas). Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de materiais e equipamentos. Veja a Tabela 1 para mídias e suas composições.
1. Descongelamento e plaqueamento de hiPSC-CMs criopreservados comercialmente disponíveis para maturação em matriz extracelular indutora de maturação (MECM)</stro...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Existem várias abordagens diferentes para a triagem de cardiotoxicidade in vitro usando hiPSC-CMs. Um recente artigo de "Melhores Práticas" sobre o uso de hiPSC-CMs apresentou os vários ensaios in vitro , suas leituras primárias e, principalmente, a granularidade de cada ensaio para quantificar a função eletrofisiológica cardíaca humana20. Além de usar eletrodos perfurantes de membrana, a medida mais direta da função eletrofisiológica cardíaca humana é fornecida pel...

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (MC-hiPSC) foram validados em escala internacional e estão disponíveis para triagem de cardiotoxicidade in vitro 1. HiPSC-CMs altamente puros podem ser gerados em números virtualmente ilimitados, criopreservados e descongelados. Ao serem replaqueados, eles também reanimam e começam a se contrair com um ritmo que lembra o coração humano 2,3. Notavelmente, os hiPSC-CMs individuais se acoplam uns aos outros e formam sincícios funcionais que batem como um único tecido. Atualmente, as hiPSCs são rotineiramente derivadas de amostras de sangue de pacientes, de modo que qualquer pessoa pode ser representada usando ensaios in vitro de triagem de cardiotoxicidade com hiPSC-CM 4,5. Isso cria a oportunidade de realizar "Ensaios Clínicos em um Prato", com representação significativa de diversas populações6.
Uma vantagem crítica sobre as abordagens existentes de triagem de cardiotoxicidade animal e de células animais é que os hiPSC-CMs utilizam o genoma humano completo e oferecem um sistema in vitro com semelhanças genéticas com o coração humano. Isso é especialmente atraente para farmacogenômica e medicina personalizada - o uso de hiPSC-CMs para o desenvolvimento de medicamentos e outras terapias é previsto para fornecer prescrições de medicamentos mais precisas, precisas e seguras. De fato, ensaios bidimensionais (2D) de monocamada de hiPSC-CM provaram ser preditivos de cardiotoxicidade medicamentosa, utilizando um painel de medicamentos de uso clínico com risco conhecido de causar arritmias 1,7,8,9. Apesar do grande potencial dos MC-hiPSC e da promessa de agilizar e baratear o desenvolvimento de fármacos, tem havido uma relutância em utilizar esses novos ensaios10,11,12.
Até agora, uma grande limitação da ampla adoção e aceitação dos ensaios de rastreamento hiPSC-CM é sua aparência imatura e fetal, bem como sua função. A questão crítica da maturação da hiPSC-CM tem sido revista e debatida na literatura científica ad nauseum13,14,15,16. Da mesma forma, muitas abordagens têm sido empregadas para promover a maturação da hiPSC-CM, incluindo manipulações da matriz extracelular (MEC) em monocamadas 2D e o desenvolvimento de tecidos cardíacos (EHTs) projetados em 3D17,18. No momento, há uma crença amplamente difundida de que o uso de EHTs 3D proporcionará maturação superior em relação às abordagens baseadas em monocamadas 2D. No entanto, as monocamadas 2D proporcionam uma maior eficiência de utilização celular e maior sucesso no revestimento em comparação com os EHTs 3D; Os EHTs 3D utilizam um número maior de células e, muitas vezes, requerem a inclusão de outros tipos de células que podem confundir os resultados. Portanto, neste artigo, o foco está no uso de um método simples para amadurecer hiPSC-CMs cultivadas como monocamadas 2D de células acopladas elétrica e mecanicamente.
A maturação avançada do hiPSC-CM pode ser obtida em monocamadas 2D usando um ECM. As monocamadas 2D de hiPSC-CMs podem ser amadurecidas usando uma lamínula macia e flexível de polidimetilsiloxano, revestida com matriz de membrana basal secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo). Em 2016, relatos mostraram que os MC-hiPSC cultivados nessa condição de MEC mole amadureceram funcionalmente, exibindo velocidades de condução do potencial de ação próximas aos valores do coração adulto (~50 cm/s)18. Além disso, esses hiPSC-CMs maduros exibiram muitas outras características eletrofisiológicas que lembram o coração adulto, incluindo potencial de membrana de repouso hiperpolarizado e expressão de Kir2.1. Mais recentemente, relatos identificaram um revestimento de MEC derivado de células-tronco perinatais humanas que promove a maturação estrutural de HIPSC-CMs 2D19. Aqui, métodos fáceis de usar são apresentados para monocamadas hiPSC-CM 2D estruturalmente maduras para uso em telas eletrofisiológicas de alto rendimento. Além disso, fornecemos a validação de um instrumento de mapeamento óptico para a aquisição e análise automatizada da função eletrofisiológica da monocamada hiPSC-CM 2D, usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e sondas e proteínas sensíveis ao cálcio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco induzidas humanas (hiPSC-CMs) são usados para substituir e reduzir a dependência de animais e células animais para testes pré-clínicos de cardiotoxicidade. Em formatos bidimensionais de monocamada, os hiPSC-CMs recapitulam a estrutura e a função das células musculares cardíacas humanas adultas quando cultivadas em uma matriz extracelular (MEC) ótima. Uma MEC derivada de células-tronco perinatais humanas (matriz extracelular indutora de maturação-MECM) amadurece a estrutura, a função e o estado metabólico do hiPSC-CM em 7 dias após o plaqueamento. 
As monocamadas maduras de hiPSC-CM também respondem, como esperado, a medicamentos clinicamente relevantes, com risco conhecido de causar arritmias e cardiotoxicidade. A maturação das monocamadas hiPSC-CM foi um obstáculo à adoção generalizada dessas células valiosas para a ciência regulatória e triagem de segurança, até agora. Este artigo apresenta métodos validados para o plaqueamento, maturação e fenotipagem funcional de alto rendimento da função eletrofisiológica e contrátil hiPSC-CM. Esses métodos aplicam-se aos cardiomiócitos purificados comercialmente disponíveis, bem como aos cardiomiócitos derivados de células-tronco gerados internamente usando protocolos de diferenciação altamente eficientes e específicos da câmara. 
A função eletrofisiológica de alto rendimento é medida usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs; emissão: 488 nm), fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs) ou sensores de cálcio codificados geneticamente (GCaMP6). Um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento é usado para gravações ópticas de cada parâmetro funcional, e um software dedicado personalizado é usado para análise de dados eletrofisiológicos. Os protocolos MECM são aplicados para triagem de medicamentos usando um inotrópico positivo (isoprenaline) e bloqueadores de canal específicos do gene humano relacionado ao Ether-a-go-go (hERG). Esses recursos permitirão que outros pesquisadores utilizem com sucesso hiPSC-CMs maduros para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade de alto rendimento, testes de eficácia de medicamentos cardíacos e pesquisa cardiovascular.

Maturação hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imagem confocal imunofluorescente A linha do tempo para a maturação mediada por MEC de hiPSC-CMs comercialmente disponíveis usando placas de 96 poços revestidas com MECM é apresentada na Figura 1A. Esses dados são coletados usando cardiomiócitos disponíveis comercialmente que chegam ao laboratório como frascos criopreservados de células. Cada frasco para injetáveis contém >5 × 106 cardiomi?...

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Esse protocolo é significativo porque permite aos pesquisadores amadurecer os hiPSC-CMs comerciais ou internos para um fenótipo semelhante ao adulto que melhora significativamente o valor preditivo dos hiPSC-CMs no rastreamento de cardiotoxicidade. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece hiPSC-CMs maduros em um formato de alto rendimento para mapeamento óptico de cálcio ou mudança de tensão. Esse protocolo pode ser usado para investigar mecanismos de doença ou para rastrear drogas para cardiotoxicidade.Quem demonstrará o procedimento será Jeffrey Creech, pesquisador associado do meu laboratório. Comece lavando as placas da matriz extracelular indutora de maturação, ou MECM, duas vezes com 200 microlitros de solução salina balanceada de Hank, ou HBSS, 1 hora antes do plaqueamento dos cardiomiócitos. Mantenha os poços hidratados.Transfira os tubos de cardiomiócitos do tanque de nitrogênio líquido para o gelo seco e libere a pressão abrindo ligeiramente as tampas do tubo. Em seguida, feche novamente as tampas dos tubos e descongele-as em banho-maria por 4 minutos. Após o descongelamento das células, borrife os tubos com etanol 70% antes de abri-los.Transfira as células para tubos cônicos de 15 mililitros com uma pipeta de 1 mililitro. Adicione 1 mililitro de meio de chapeamento ao criovial e transfira a lavagem para o tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, goteje lentamente 1 mililitro de meio de chapeamento e agite o tubo.Repita até a transferência de 8 mililitros de meio de chapeamento. Centrifugar o tubo de 15 mililitros a 300 x g por 5 minutos e ressuspender o pellet em 1 mililitro do meio de chapeamento. Remova uma alíquota e realize a contagem de células vivas com um hemocitômetro antes de adicionar um meio de plaqueamento para obter 7,5 x 10 a 5ª células por mililitro.Dispensar 100 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 96 poços revestida com MECM usando uma pipeta multicanal e incubar as células por 2 dias. Em seguida, substitua o meio por 200 microlitros de meio de manutenção, e mantenha as placas por 7 dias, com troca de meio no dia 5. No 7º dia, realizar ensaio de EP, conforme descrito no texto.Certifique-se de trocar o meio a cada dois dias ao optar por estender a cultura celular. Para purificar o hiPSC-CM via triagem celular ativada por magnetismo, ou MACS, aspirar o meio de cultura celular e lavar as células com 1 mililitro de HBSS-Em seguida, dissociar as células adicionando 1 mililitro de 0,25% de tripsina-etilenodiaminotetracético, ou EDTA, e incubar as células por 10 minutos. Em seguida, inative a tripsina/EDTA reenviando e singularizando as células com 2 mililitros de meio de plaqueamento.Dos seis poços, colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros usando um filtro de 70 micrômetros. Depois de lavar o filtro com 3 mililitros de meio de chapeamento, conte as células. Após a contagem, centrifugar e lavar o pellet celular com 2 mililitros de tampão de separação MACS gelado antes de peletizar e reenviar as células em 80 microlitros de tampão de separação MACS frio por 5 x 10 para a 6ª célula.Adicione 20 microlitros de coquetel frio de depleção de cardiomiócitos e misture a suspensão antes de incubar no gelo por 10 minutos. Após lavar as células com 4 mililitros de tampão de separação MACS frio a 300 x g por 5 minutos, ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão de separação MACS frio. Adicione 20 microlitros de microesferas frias anti-biotina por 5 x 10 às 6ª células e misture suavemente a suspensão celular antes de incubar no gelo por 10 minutos.Enquanto as amostras estiverem incubando, coloque as colunas de depleção positiva equipadas com os filtros de pré-separação de 30 micrômetros no separador MACS e coloque os tubos de coleta de 15 mililitros rotulados abaixo das colunas. Em seguida, prima cada coluna com 3 mililitros de buffer de separação MACS frio. Misture a suspensão celular tratada com anticorpos com 2 mililitros de tampão de separação MACS e adicione-a à coluna.Adicione 2 mililitros de tampão de separação MACS a cada coluna e colete 12 mililitros de suspensão de cardiomiócitos flowthrough. Centrifugar os cardiomiócitos e descartar o sobrenadante antes de ressuspender os cardiomiócitos em meio plaqueado de 1 mililitro. Para determinar a concentração, conte as células e ajuste o volume para a densidade de semeadura desejada antes de plaquear as células purificadas de cardiomiócitos nas placas de 96 poços do MECM.Aspirar e substituir o meio de manutenção do cardiomiócito por 100 microlitros de corantes sensíveis à voltagem, ou CIV, ou fluoróforos sensíveis ao cálcio, ou LCR, por poço de uma placa de 96 poços. Após 30 minutos de incubação, substituir os corantes por meio de ensaio ou HBSS. Equilibre as células a 37 graus Celsius antes de adquirir o mapeamento óptico de dados de linha de base usando um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento.Para tratar as células com drogas para teste de exposição aguda ou mapear as células cronicamente expostas a drogas de interesse, diluir as drogas em dimetil sulfóxido, ou DMSO, e armazená-las como soluções estoque a 20 graus Celsius antes de diluí-las em HBSS para as concentrações desejadas. Para testes de cardiotoxicidade em placas de 96 poços, adicione quatro doses de um composto com pelo menos oito poços por dose. Use doses que variam de abaixo a acima da concentração plasmática terapêutica clinicamente eficaz, incluindo a dose efetiva.Semelhante às medidas eletrofisiológicas basais antes da aplicação da droga, os registros de eletrofisiologia de captura pelo menos 30 minutos após o tratamento medicamentoso para estudos crônicos. Após os registros basais, aplicar pelo menos quatro doses de cada medicamento em monocamadas maduras de hiPSC-CMs expressando GCaMP6m, com pelo menos oito poços por dose. Equilibre os medicamentos nas células por 30 minutos e aqueça as células a 37 graus Celsius antes e durante a aquisição de dados.Após os registros basais de uma placa inteira, adicione 500 isoproterenol nanomolar a cada poço para permitir dados robustos de resposta a drogas e quantificar os efeitos do isoproterenol na taxa de batimento da monocamada, amplitude de contração e duração transitória de cálcio. Para adquirir dados de mapeamento óptico, abra a gaveta frontal e posicione a placa no aquecedor de placas. Depois de abrir o software de aquisição e determinar o local de salvamento do arquivo no software, selecione a duração de 10 a 30 segundos e a taxa de quadros de aquisição para maior resolução temporal e clique em Iniciar aquisição.Abra o software de análise e, na guia Filtro de Importação, selecione Procurar um único arquivo ou Múltiplos de blocos para reconstruir uma placa. Selecione os arquivos e insira um número de linhas e colunas e selecione Automático. Em seguida, selecione Atualizar Tamanho do Pixel, insira a distância por pixel e use o Assistente de Poço para determinar a localização dos poços na imagem antes de clicar em Processar Salvar e passar para a próxima guia.Abra a aba ROIs, ou Regiões de Interesse, e opte por desenhar as ROIs manualmente, automaticamente ou não use ROIs, que serão consideradas para a análise de toda a placa. Depois de selecionar a região no poço, clique no botão Processar salvar para passar para a próxima etapa. Marque as caixas Ocultar poços e Mostrar somente filtrado para visualizar as ROIs.Abra a guia Análise, selecione cada poço ou ROI para confirmar a precisão da detecção automática de batidas. Adicione ou remova batidas dos rastreamentos selecionando uma batida individual e pressionando Delete no teclado. Uma vez feito, clique em Salvar.Em seguida, clique no botão Gráfico de Espaço-Tempo na guia Análise e adicione a linha para determinar o gráfico de espaço de tempo para visualizar os dados de cada poço ou do ROI. Depois de selecionar uma linha horizontal ou vertical, clique em Gerar Gráfico. Depois de garantir a detecção precisa de batidas, vá para a guia Exportar e selecione Formato de arquivo, insira a opção Estatística de batida antes de clicar em Exportar.Uma vez exportados, abra os arquivos de dados e execute a rotina de análise estatística escolhida. A imagem de contraste de fase mostrou que os hiPSC-CMs plaqueados no MECM amadureceram e se tornaram estruturalmente distintos do mesmo lote de hiPSC-CMs replaqueados no ECM de camundongos. As células maduras tornaram-se em forma de bastonete, enquanto as células imaturas mantiveram uma forma circular.Os cardiomiócitos corados com anticorpos alfa-actinina mostraram a forma típica das células cultivadas em cada condição da MEC. Consistente com a coloração TnI, a coloração alfa-actinina indicou que os MC-hiPSC amadurecidos na MECM promoveram um fenótipo maduro em forma de bastonete e induziram maior organização dos sarcômeros. O conteúdo e a atividade mitocondrial foram distintos entre as células cultivadas na MEC e na MECM de camundongos.Os dados eletrofisiológicos dos potenciais de ação registrados por meio de CIVs e do sistema de mapeamento óptico mostraram que as células atriais específicas têm uma taxa de batimento espontâneo significativamente mais rápida e menor duração do potencial de ação, ou APD80, do que as células ventricular-específicas. Mapas de calor de placas inteiras para parâmetros como APD80 revelaram a reprodutibilidade de um determinado parâmetro dentro de uma placa. Potenciais de ação típicos de monocamadas hiPSC-CM maduras indicaram a morfologia do potencial de ação de cardiomiócitos adultos isolados e testados.Um ritmo espontâneo típico de potencial de ação também foi exibido. Em resposta ao isoproterenol, a ativação dos receptores beta-1-adrenérgicos causou cronotropia positiva, inotropia positiva e lusitropia positiva. A resposta da HiPSC-CM ao gene humano relacionado ao Ether-a-go-go, ou bloqueador de canal hERG, incluindo E-4031, domperidona, vandetanibe e sotalol, foi estudada usando fluorescência de cálcio GCaMP6m para monitorar o ritmo.O estudo mostrou a detecção de pós-despolarizações precoces causadas pelo bloqueio do canal HERG E-4031. Trabalhe rapidamente com as células em suspensão e evite tensões de cisalhamento pipetando as células suavemente. Além disso, execute a troca de mídia cuidadosamente para evitar danificar a sincistica hiPS.Após esse procedimento, as células são passíveis de coleta de proteínas, RNA, DNA e lipídios para análise com a técnica favorita dos investigadores. A técnica capacita os pesquisadores a investigar doenças e testar a cardiotoxicidade de novas drogas usando cardiomiócitos semelhantes aos adultos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Bioengenharia

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

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Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

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To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

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Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

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