Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH HL148068-04 и R44ES027703-02 (TJH).

Использование hiPSC в этом протоколе было одобрено комитетом HPSCRO Мичиганского университета (Комитет по надзору за плюрипотентными стволовыми клетками человека). Список материалов и оборудования см. в таблице материалов . В таблице 1 приведены носители и их составы.
<p c...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Существует несколько различных подходов к скринингу кардиотоксичности in vitro с использованием hiPSC-CM. В недавнем документе «Передовая практика» по использованию hiPSC-CM были представлены различные анализы in vitro , их первичные показания и, что важно, детализация каждого анализа для...

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CM), были валидированы в международном масштабе и доступны дляскрининга кардиотоксичности in vitro1. Высокочистые hiPSC-CM могут генерироваться практически в неограниченном количестве, криоконсервироваться и размораживаться. После перекладывания они также реанимируются и начинают сокращаться с ритмом, напоминающим человеческое сердце 2,3. Примечательно, что отдельные hiPSC-CM соединяются друг с другом и образуют функциональные синцитии, которые бьются как единая ткань. В настоящее время ИПСК обычно получают из образцов крови пациентов, поэтому любой человек может быть представлен с помощью скрининговых анализов кардиотоксичности hiPSC-CM in vitro 4,5. Это создает возможность для проведения «клинических испытаний в блюде» со значительным представительством различных групп населения6.
Одним из важнейших преимуществ по сравнению с существующими подходами к скринингу кардиотоксичности клеток животных и животных является то, что hiPSC-CM используют полный геном человека и предлагают систему in vitro с генетическим сходством с человеческим сердцем. Это особенно привлекательно для фармакогеномики и персонализированной медицины - прогнозируется, что использование hiPSC-CM для разработки лекарств и других методов лечения обеспечит более точные, точные и безопасные назначения лекарств. Действительно, двумерные (2D) монослойные анализы hiPSC-CM доказали свою эффективность прогнозирования кардиотоксичности лекарств с использованием панели клинически используемых лекарств с известным риском возникновения аритмий 1,7,8,9. Несмотря на огромный потенциал hiPSC-CM и обещание упростить и удешевить разработку лекарств, существует нежелание использовать эти новые анализы10,11,12.
До сих пор одним из основных ограничений широкого внедрения и принятия скрининговых анализов hiPSC-CM является их незрелый, похожий на плод внешний вид, а также их функция. Критический вопрос созревания hiPSC-CM был рассмотрен и обсужден в научной литературе до тошноты13,14,15,16. Аналогичным образом, для стимулирования созревания hiPSC-CM было использовано множество подходов, включая манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM) в 2D-монослоях и разработку 3D-инженерных тканей сердца (EHT)17,18. В настоящее время широко распространено мнение, что использование 3D EHT обеспечит превосходное созревание по сравнению с подходами на основе 2D монослоя. Однако 2D-монослои обеспечивают более высокую эффективность использования ячеек и больший успех в нанесении покрытия по сравнению с 3D-EHT; 3D EHT используют большее количество клеток и часто требуют включения других типов клеток, которые могут исказить результаты. Поэтому в этой статье основное внимание уделяется использованию простого метода созревания hiPSC-CM, культивируемых в виде 2D-монослоев электрически и механически связанных клеток.
Усовершенствованное созревание hiPSC-CM может быть достигнуто в 2D-монослоях с помощью ECM. 2D-монослои hiPSC-CM могут созревать с использованием мягкого, гибкого полидиметилсилоксанового покровного стекла, покрытого матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши). В 2016 году отчеты показали, что hiPSC-CM, культивируемые в этом мягком состоянии ECM, функционально созревают, демонстрируя скорости проводимости потенциала действия вблизи значений сердца взрослого человека (~ 50 см / с)18. Кроме того, эти зрелые hiPSC-CM проявляли многие другие электрофизиологические характеристики, напоминающие сердце взрослого человека, включая гиперполяризованный мембранный потенциал покоя и экспрессию Kir2.1. Совсем недавно в отчетах было идентифицировано покрытие ECM, полученное из перинатальных стволовых клеток человека, которое способствует структурному созреванию 2D hiPSC-CMs19. Здесь представлены простые в использовании методы структурно зрелых 2D-монослоев hiPSC-CM для использования в высокопроизводительных электрофизиологических экранах. Кроме того, мы проводим валидацию оптического картографического прибора для автоматического сбора и анализа 2D монослойной электрофизиологической функции hiPSC-CM с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и чувствительных к кальцию зондов и белков.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CM), используются для замены и снижения зависимости от животных и клеток животных для доклинических испытаний на кардиотоксичность. В двумерных монослойных форматах hiPSC-CM повторяют структуру и функцию клеток сердечной мышцы взрослого человека при культивировании на оптимальном внеклеточном матриксе (ECM). ECM, полученный из перинатальных стволовых клеток человека (индуцирующий созревание внеклеточный матрикс-MECM-MECM), созревает структуру, функцию и метаболическое состояние hiPSC-CM через 7 дней после нанесения покрытия. 
Зрелые монослои hiPSC-CM также реагируют, как и ожидалось, на клинически значимые лекарства с известным риском возникновения аритмий и кардиотоксичности. Созревание монослоев hiPSC-CM до сих пор было препятствием для широкого внедрения этих ценных клеток для нормативной науки и скрининга безопасности. В этой статье представлены валидированные методы нанесения покрытия, созревания и высокопроизводительного функционального фенотипирования электрофизиологической и сократительной функции hiPSC-CM. Эти методы применимы к коммерчески доступным очищенным кардиомиоцитам, а также к кардиомиоцитам, полученным из стволовых клеток, полученным собственными силами с использованием высокоэффективных протоколов камерно-специфической дифференцировки. 
Высокопроизводительная электрофизиологическая функция измеряется с помощью чувствительных к напряжению красителей (VSD; излучение: 488 нм), кальций-чувствительных флуорофоров (CSF) или генетически кодируемых кальциевых датчиков (GCaMP6). Для оптической записи каждого функционального параметра используется высокопроизводительное оптическое картографическое устройство, а для анализа электрофизиологических данных используется специальное программное обеспечение. Протоколы MECM применяются для скрининга лекарств с использованием положительного инотропа (изопреналин) и блокаторов канала, связанных с эфиром (hERG) человека. Эти ресурсы позволят другим исследователям успешно использовать зрелые hiPSC-CM для высокопроизводительного доклинического скрининга кардиотоксичности, тестирования эффективности сердечных препаратов и сердечно-сосудистых исследований.

Созревание hiPSC-CM, характеризующееся фазовым контрастом и иммунофлюоресцентной конфокальной визуализацией График ECM-опосредованного созревания коммерчески доступных hiPSC-CM с использованием 96-луночных планшетов с покрытием MECM представлен на рисунке 1A. Эти дан...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), предлагают альтернативу использованию животных для доклинического скрининга кардиотоксичности. Ограничением для широкого внедрения hiPSC-CM в доклиническом скрининге токсичности является незрелый, эмбрионоподобный фенотип клеток. Здесь представлены протоколы для надежного и быстрого созревания hiPSC-CM.

Высокопроизводительный скрининг кардиотоксичности с использованием зрелых монослоев кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Этот протокол имеет большое значение, поскольку он позволяет исследователям сообразовывать коммерческие или собственные hiPSC-CM до взрослого фенотипа, что значительно повышает прогностическую ценность hiPSC-CM при скрининге кардиотоксичности. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он доставляет зрелые hiPSC-CM в формате с высокой пропускной способностью для оптического картирования кальция или изменения напряжения. Этот протокол может быть использован для исследования механизмов заболевания или для скрининга лекарств на кардиотоксичность.Продемонстрирует процедуру Джеффри Крич, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с двухкратного промывания планшетов внеклеточного матрикса, вызывающего созревание, или MECM, 200 микролитрами сбалансированного солевого раствора Хэнка, или HBSS, за 1 час до покрытия кардиомиоцитов. Следите за тем, чтобы лунки были увлажнены.Перенесите кардиомиоцитарные пробирки из резервуара с жидким азотом в сухой лед и сбросьте давление, слегка приоткрыв крышки пробирок. Затем снова запечатайте крышки тюбиков и разморозьте их на водяной бане в течение 4 минут. После оттаивания ячеек опрыскайте пробирки 70% этанолом, прежде чем открывать их.Перенесите клетки в конические пробирки объемом 15 миллилитров с помощью пипетки объемом 1 миллилитр. Добавьте 1 миллилитр гальванической среды в криовиал и перенесите промывку в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем медленно капните 1 миллилитр гальванической среды и перемешайте трубку.Повторяйте это до тех пор, пока не перенесут 8 миллилитров гальванической среды. Центрифугируйте 15-миллилитровую пробирку при 300 x g в течение 5 минут и ресуспендируйте гранулу в 1 миллилитре гальванической среды. Удалите аликвоту и выполните подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра перед добавлением гальванической среды, чтобы получить 7,5 x 10 к 5-м клеткам на миллилитр.Распределите 100 микролитров клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с покрытием MECM с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте клетки в течение 2 дней. Затем замените среду на 200 микролитров поддерживающей среды и выдержите пластины в течение 7 дней, со сменой среды на 5-й день. На 7-й день проведите анализ ЭП, как описано в тексте.Убедитесь, что вы меняете среду через день, когда выбираете расширение клеточной культуры. Чтобы очистить hiPSC-CM с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток, или MACS, аспирируйте среду для культивирования клеток и промойте клетки 1 миллилитром HBSS-Затем диссоциируйте клетки, добавив 1 миллилитр 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусного или ЭДТА и инкубируя клетки в течение 10 минут. Затем инактивируйте трипсин / ЭДТА, повторно отправив и сингуляризировав клетки 2 миллилитрами гальванической среды.Из шести лунок соберите клетки в коническую трубку объемом 50 миллилитров с помощью 70-микрометрового ситечка. Промыв ситечко 3 миллилитрами гальванической среды, посчитайте ячейки. После подсчета центрифугируют и промывают гранулы клеток 2 миллилитрами ледяного разделительного буфера MACS перед гранулированием и повторной отправкой клеток в 80 микролитров холодного разделительного буфера MACS на 5 x 10 в 6-ю ячейку.Добавьте 20 микролитров холодного коктейля без истощения кардиомиоцитов и перемешайте суспензию перед инкубацией на льду в течение 10 минут. После промывки ячеек 4 миллилитрами холодного разделительного буфера MACS при 300 x g в течение 5 минут ресуспендируйте гранулу в 80 микролитрах холодного разделительного буфера MACS. Добавьте 20 микролитров холодных микрогранул антибиотина в 5 x 10 к 6-й ячейке и аккуратно перемешайте клеточную суспензию перед инкубацией на льду в течение 10 минут.Во время инкубации образцов поместите колонны положительного истощения, оснащенные 30-микрометровыми фильтрами предварительного разделения, на сепаратор MACS и поместите маркированные 15-миллилитровые сборные пробирки под колонны. Затем заправьте каждую колонку 3 миллилитрами холодного разделительного буфера MACS. Смешайте клеточную суспензию, обработанную антителами, с 2 миллилитрами разделительного буфера MACS и добавьте его в колонку.Добавьте 2 миллилитра разделительного буфера MACS в каждую колонку и соберите 12 миллилитров проточной суспензии кардиомиоцитов. Центрифугируйте кардиомиоциты и выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием кардиомиоцитов в 1-миллилитровой гальванической среде. Чтобы определить концентрацию, подсчитайте клетки и отрегулируйте объем до желаемой плотности посева перед нанесением очищенных клеток кардиомиоцитов на 96-луночные планшеты MECM.Аспирируйте и замените поддерживающую среду кардиомиоцитов 100 микролитрами чувствительных к напряжению красителей, или VSD, или кальций-чувствительных флуорофоров, или CSF, на лунку 96-луночной пластины. После 30 минут инкубации замените красители анализирующей средой или HBSS. Уравновесьте ячейки при 37 градусах Цельсия перед получением оптического картирования исходных данных с помощью высокопроизводительного оптического картографического устройства.Чтобы обработать клетки лекарствами для тестирования на острое воздействие или составить карту клеток, хронически подвергающихся воздействию интересующих лекарств, разбавьте лекарства диметилсульфоксидом или ДМСО и храните их в виде исходных растворов при температуре 20 градусов Цельсия, прежде чем разбавлять их в HBSS до желаемых концентраций. Для тестирования кардиотоксичности в 96-луночных планшетах добавьте четыре дозы соединения, по крайней мере, с восемью лунками на дозу. Используйте дозы в диапазоне от ниже до выше клинически эффективной терапевтической концентрации в плазме, включая эффективную дозу.Подобно базовым электрофизиологическим измерениям до применения препарата, запишите электрофизиологические записи не менее чем через 30 минут после лечения препаратом для хронических исследований. После исходной регистрации применяйте не менее четырех доз каждого лекарства к зрелым монослоям hiPSC-CM, экспрессирующим GCaMP6m, по крайней мере, с восемью лунками на дозу. Уравновесьте лекарства на клетках в течение 30 минут и нагрейте клетки до 37 градусов по Цельсию до и во время сбора данных.После базовых записей всей пластины добавьте 500 наномолярных изопротеренолов в каждую лунку, чтобы получить надежные данные об ответе на лекарство и количественно оценить влияние изопротеренола на частоту биений монослоя, амплитуду сжатия и продолжительность переходного процесса кальция. Чтобы получить данные оптического картографирования, откройте передний ящик и установите пластину на нагреватель. Открыв программное обеспечение для сбора данных и определив место сохранения файла в программном обеспечении, выберите продолжительность сбора от 10 до 30 секунд и частоту кадров для более высокого временного разрешения и нажмите «Начать сбор».Откройте программное обеспечение для анализа и на вкладке «Импорт фильтра» выберите «Обзор одного файла» или «Несколько плиток», чтобы восстановить пластину. Выберите файлы, введите несколько строк и столбцов и выберите Автоматически. Затем выберите «Обновить размер пикселя», введите расстояние на пиксель и используйте мастер скважин, чтобы определить местоположение скважин на изображении, прежде чем нажать «Сохранить процесс» и перейти на следующую вкладку.Откройте вкладку ROI или «Области интереса» и выберите, рисовать ли ROI вручную, автоматически или вообще не использовать ROI, которые будут учитываться при анализе всей тарелки. После выбора области в колодце нажмите кнопку «Сохранить процесс», чтобы перейти к следующему шагу. Установите флажки «Скрыть колодцы» и «Показывать только отфильтрованные», чтобы визуализировать рентабельность инвестиций.Откройте вкладку «Анализ», выберите каждую скважину или ROI, чтобы подтвердить точность автоматического определения ударов. Добавьте или удалите удары из трассировок, выбрав отдельный бит и нажав клавишу Delete на клавиатуре. После этого нажмите «Сохранить».Затем нажмите кнопку «Пространственно-временной график» на вкладке «Анализ» и добавьте строку для определения пространственно-временного графика для визуализации данных для каждой скважины или окупаемости инвестиций. Выбрав горизонтальную или вертикальную линию, нажмите «Создать график». Убедившись в точном обнаружении ударов, перейдите на вкладку «Экспорт» и выберите «Формат файла», введите параметр «Статистика ударов», прежде чем нажимать «Экспорт».После экспорта откройте файлы данных и запустите выбранную процедуру статистического анализа. Фазово-контрастная визуализация показала, что hiPSC-CM, нанесенные на MECM, созрели и стали структурно отличаться от той же партии hiPSC-CM, нанесенных на ECM мыши. Зрелые клетки приобретали палочковидную форму, в то время как незрелые сохраняли круглую форму.Кардиомиоциты, окрашенные антителами альфа-актинина, показали типичную форму клеток, культивируемых при каждом состоянии ECM. В соответствии с окрашиванием TnI, окрашивание альфа-актинина указывало на то, что hiPSC-CM, созревшие на MECM, способствовали палочковидному зрелому фенотипу и индуцировали большую организацию саркомера. Содержание и активность митохондрий были различны между клетками, культивируемыми на ECM мыши и MECM.Электрофизиологические данные о потенциалах действия, записанные с использованием VSD и системы оптического картирования, показали, что предсердные клетки имеют значительно более высокую частоту спонтанных ударов и более короткую продолжительность потенциала действия, или APD80, чем желудочково-специфические клетки. Тепловые карты всей пластины для таких параметров, как APD80, показали воспроизводимость заданного параметра в пластине. Типичные потенциалы действия зрелых монослоев hiPSC-CM указывают на морфологию потенциала действия выделенных и протестированных кардиомиоцитов взрослого человека.Также был показан типичный спонтанный ритм потенциала действия. В ответ на изопротеренол активация бета-1-адренорецепторов вызывала положительную хронотропию, положительную инотропию и положительную лузитропию. Реакция HiPSC-CM на человеческий ген, связанный с Ether-a-go-go, или hERG, блокатор каналов, включая E-4031, домперидон, вандетаниб и соталол, была изучена с использованием флуоресценции кальция GCaMP6m для мониторинга ритма.Исследование показало обнаружение ранних постдеполяризаций, вызванных блокадой канала Е-4031 hERG. Быстро работайте с клетками в суспензии и избегайте напряжения сдвига, аккуратно пипетируя клетки. Кроме того, выполняйте смену носителя осторожно, чтобы не повредить синцитию hiPS.После этой процедуры клетки поддаются сбору белков, РНК, ДНК и липидов для анализа с помощью любимой техники исследователей. Этот метод позволяет исследователям исследовать заболевания и проверять кардиотоксичность новых лекарств с использованием взрослых кардиомиоцитов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Изогенный чип почечного клубочка, разработанный из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Оценка терапии модуляции сократимости сердца в 2D кардиомиоцитах, полученных из стволовых клеток человека

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...