Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Este trabajo ha sido apoyado por las subvenciones de los NIH HL148068-04 y R44ES027703-02 (TJH).

El uso de hiPSC en este protocolo fue aprobado por el Comité HPSCRO de la Universidad de Michigan (Comité de Supervisión de Células Madre Pluripotentes Humanas). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales y equipos. Ver Tabla 1 para los medios y sus composiciones.
1. Descongelación y recubrimiento de hiPSC-CM criopreservados disponibles comercialmente para la maduración en una matriz extracelular inductora de maduración (...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Existen varios enfoques diferentes para la detección de cardiotoxicidad in vitro utilizando hiPSC-CM. Un reciente documento de "Mejores prácticas" sobre el uso de hiPSC-CM presentó los diversos ensayos in vitro , sus lecturas primarias y, lo que es más importante, la granularidad de cada ensayo para cuantificar la función electrofisiológica cardíaca humana20. Además de usar electrodos perforadores de membrana, la medida más directa de la función electrofisiológica card...

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) han sido validados a escala internacional y están disponibles para el cribado de cardiotoxicidad in vitro 1. Los hiPSC-CM de alta pureza pueden generarse en cantidades prácticamente ilimitadas, criopreservarse y descongelarse. Al rechapar, también se reaniman y comienzan a contraerse con un ritmo que recuerda al corazón humano 2,3. Sorprendentemente, los hiPSC-CM individuales se acoplan entre sí y forman una sincitia funcional que late como un solo tejido. Hoy en día, las hiPSCs se derivan rutinariamente de muestras de sangre de pacientes, por lo que cualquier persona puede ser representada utilizando ensayos de detección de cardiotoxicidad hiPSC-CM in vitro 4,5. Esto crea la oportunidad de realizar "Ensayos Clínicos en un Plato", con representación significativa de diversas poblaciones6.
Una ventaja crítica sobre los enfoques existentes de detección de cardiotoxicidad de células animales y animales es que los hiPSC-CM utilizan el genoma humano completo y ofrecen un sistema in vitro con similitudes genéticas con el corazón humano. Esto es especialmente atractivo para la farmacogenómica y la medicina personalizada: se prevé que el uso de hiPSC-CM para el desarrollo de medicamentos y otras terapias proporcionará prescripciones de medicamentos más precisas, precisas y seguras. De hecho, los ensayos bidimensionales (2D) de monocapa hiPSC-CM han demostrado ser predictivos de cardiotoxicidad de medicamentos, utilizando un panel de medicamentos clínicamente utilizados con un riesgo conocido de causar arritmias 1,7,8,9. A pesar del vasto potencial de los hiPSC-CM y la promesa de racionalizar y abaratar el desarrollo de fármacos, ha habido una renuencia a utilizar estos nuevos ensayos10,11,12.
Hasta ahora, una limitación importante de la adopción y aceptación generalizadas de los ensayos de detección de hiPSC-CM es su apariencia inmadura, similar a la fetal, así como su función. El tema crítico de la maduración de hiPSC-CM ha sido revisado y debatido en la literatura científica hasta la saciedad13,14,15,16. Del mismo modo, se han empleado muchos enfoques para promover la maduración de hiPSC-CM, incluyendo manipulaciones de matriz extracelular (ECM) en monocapas 2D y el desarrollo de tejidos cardíacos diseñados en 3D (EHT)17,18. Por el momento, existe la creencia generalizada de que el uso de EHT 3D proporcionará una maduración superior en relación con los enfoques basados en monocapa 2D. Sin embargo, las monocapas 2D proporcionan una mayor eficiencia de utilización celular y un mayor éxito en el recubrimiento en comparación con los EHT 3D; Los EHT 3D utilizan un mayor número de células y, a menudo, requieren la inclusión de otros tipos de células que pueden confundir los resultados. Por lo tanto, en este artículo, la atención se centra en el uso de un método simple para madurar hiPSC-CM cultivados como monocapas 2D de células acopladas eléctrica y mecánicamente.
La maduración avanzada de hiPSC-CM se puede lograr en monocapas 2D utilizando un ECM. Las monocapas 2D de hiPSC-CM pueden madurarse utilizando un cubreobjetos de polidimetilsiloxano suave y flexible, recubierto con una matriz de membrana basal secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón). En 2016, los informes mostraron que los hiPSC-CM cultivados en esta condición de ECM blanda maduraron funcionalmente, mostrando velocidades de conducción potenciales de acción cercanas a los valores cardíacos adultos (~ 50 cm / s)18. Además, estos hiPSC-CM maduros mostraron muchas otras características electrofisiológicas que recuerdan al corazón adulto, incluido el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado y la expresión de Kir2.1. Más recientemente, los informes identificaron un recubrimiento ECM derivado de células madre perinatales humanas que promueve la maduración estructural de 2D hiPSC-CMs19. Aquí, se presentan métodos fáciles de usar para monocapas 2D hiPSC-CM estructuralmente maduras para su uso en pantallas electrofisiológicas de alto rendimiento. Además, proporcionamos validación de un instrumento de mapeo óptico para la adquisición y análisis automatizados de la función electrofisiológica monocapa 2D hiPSC-CM, utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y sondas y proteínas sensibles al calcio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Los cardiomiocitos derivados de células madre inducidas humanas (hiPSC-CM) se utilizan para reemplazar y reducir la dependencia de animales y células animales para pruebas preclínicas de cardiotoxicidad. En formatos monocapa bidimensionales, los hiPSC-CM recapitulan la estructura y función de las células del músculo cardíaco humano adulto cuando se cultivan en una matriz extracelular óptima (ECM). Una ECM (matriz extracelular inductora de maduración-MECM) derivada de células madre perinatales humanas madura la estructura, función y estado metabólico de hiPSC-CM en 7 días después de la placa. 
Las monocapas maduras de hiPSC-CM también responden como se espera a los medicamentos clínicamente relevantes, con un riesgo conocido de causar arritmias y cardiotoxicidad. La maduración de las monocapas hiPSC-CM fue un obstáculo para la adopción generalizada de estas valiosas células para la ciencia regulatoria y la detección de seguridad, hasta ahora. Este artículo presenta métodos validados para el recubrimiento, la maduración y el fenotipado funcional de alto rendimiento de la función electrofisiológica y contráctil de hiPSC-CM. Estos métodos se aplican a los cardiomiocitos purificados disponibles comercialmente, así como a los cardiomiocitos derivados de células madre generados internamente utilizando protocolos de diferenciación altamente eficientes y específicos de la cámara. 
La función electrofisiológica de alto rendimiento se mide utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD; emisión: 488 nm), fluoróforos sensibles al calcio (CSF) o sensores de calcio codificados genéticamente (GCaMP6). Se utiliza un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento para las grabaciones ópticas de cada parámetro funcional, y se utiliza un software dedicado personalizado para el análisis de datos electrofisiológicos. Los protocolos MECM se aplican para la detección de medicamentos utilizando un inotrópico positivo (isoprenalina) y bloqueadores específicos del canal del gen humano relacionado con Ether-a-go-go (hERG). Estos recursos permitirán a otros investigadores utilizar con éxito hiPSC-CM maduros para la detección de cardiotoxicidad preclínica de alto rendimiento, pruebas de eficacia de medicamentos cardíacos e investigación cardiovascular.

Maduración de hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imágenes confocales inmunofluorescentes La línea de tiempo para la maduración mediada por ECM de hiPSC-CM disponibles comercialmente utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM se presenta en la Figura 1A. Estos datos se recopilan utilizando cardiomiocitos disponibles comercialmente que llegan al laboratorio como viales criopreservados de células. Cada vial contiene >5 × 106 cardiomioc...

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Este protocolo es significativo porque permite a los investigadores madurar hiPSC-CM comerciales o de fabricación interna a un fenotipo similar al de un adulto que mejora significativamente el valor predictivo de los hiPSC-CM en la detección de cardiotoxicidad. La principal ventaja de este protocolo es que ofrece hiPSC-CM maduros en un formato de alto rendimiento para el mapeo óptico de calcio o cambio de voltaje. Este protocolo se puede utilizar para investigar los mecanismos de la enfermedad o para detectar cardiotoxicidad en los medicamentos.Demostrando el procedimiento estará Jeffrey Creech, un investigador asociado de mi laboratorio. Comience lavando las placas de la matriz extracelular que induce la maduración, o MECM, dos veces con 200 microlitros de la solución salina balanceada de Hank, o HBSS, 1 hora antes del recubrimiento de cardiomiocitos. Mantenga los pozos hidratados.Transfiera los tubos de cardiomiocitos del tanque de nitrógeno líquido al hielo seco y libere la presión abriendo ligeramente las tapas del tubo. A continuación, vuelva a sellar las tapas del tubo y descongélelas en el baño de agua durante 4 minutos. Después de la descongelación de las células, rocíe los tubos con etanol al 70% antes de abrirlos.Transfiera las células a tubos cónicos de 15 mililitros con una pipeta de 1 mililitro. Agregue 1 mililitro de medio de recubrimiento al criovial y transfiera el lavado al tubo cónico de 15 mililitros. Luego, gotee lentamente 1 mililitro de medio de recubrimiento y agite el tubo.Repita esto hasta la transferencia de 8 mililitros de medio de chapado. Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 300 x g durante 5 minutos y volver a suspender el pellet en 1 mililitro del medio de recubrimiento. Retire una alícuota y realice el recuento de células vivas con un hemocitómetro antes de agregar un medio de recubrimiento para obtener 7.5 x 10 a las 5 células por mililitro.Dispensar 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con MECM usando una pipeta multicanal e incubar las células durante 2 días. A continuación, sustituya el medio por 200 microlitros de medio de mantenimiento, y mantenga las placas durante 7 días, con un cambio de medio el día 5. El día 7, realice el ensayo de EP, como se describe en el texto.Asegúrese de cambiar el medio cada dos días cuando opte por extender el cultivo celular. Para purificar hiPSC-CM a través de la clasificación celular activada magnéticamente, o MACS, aspire el medio de cultivo celular y lave las células con 1 mililitro de HBSS-Luego, disocie las células agregando 1 mililitro de 0.25% de tripsina-etilendiaminotetraacético, o EDTA, e incubando las células durante 10 minutos. Luego, inactive la tripsina / EDTA reenviando y singularizando las células con 2 mililitros de medio de recubrimiento.De los seis pocillos, recolecte las células en un tubo cónico de 50 mililitros usando un colador de 70 micrómetros. Después de lavar el colador con 3 mililitros de medio de recubrimiento, cuente las células. Después de contar, centrifugar y lavar el pellet de celda con 2 mililitros de tampón de separación MACS helado antes de peletizar y reenviar las celdas en 80 microlitros de tampón de separación MACS frío por 5 x 10 a la 6ª celda.Agregue 20 microlitros de cóctel frío de agotamiento de no cardiomiocitos y mezcle la suspensión antes de incubar en hielo durante 10 minutos. Después de lavar las celdas con 4 mililitros de tampón de separación MACS frío a 300 x g durante 5 minutos, vuelva a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón de separación MACS frío. Agregue 20 microlitros de microperlas frías de antibiotina por 5 x 10 a las 6ª células, y mezcle suavemente la suspensión celular antes de incubar en hielo durante 10 minutos.Mientras las muestras se están incubando, coloque las columnas de agotamiento positivo equipadas con los filtros de preseparación de 30 micrómetros en el separador MACS y coloque los tubos de recolección de 15 mililitros etiquetados debajo de las columnas. A continuación, prepare cada columna con 3 mililitros de tampón de separación MACS frío. Mezcle la suspensión celular tratada con anticuerpos con 2 mililitros de tampón de separación MACS y agréguelo a la columna.Agregue 2 mililitros de tampón de separación MACS a cada columna y recoja 12 mililitros de suspensión de cardiomiocitos de flujo. Centrifugar los cardiomiocitos y desechar el sobrenadante antes de resuspender los cardiomiocitos en un medio de recubrimiento de 1 mililitro. Para determinar la concentración, cuente las células y ajuste el volumen a la densidad de siembra deseada antes de colocar las células de cardiomiocitos purificadas en las placas de 96 pocillos MECM.Aspirar y reemplazar el medio de mantenimiento de cardiomiocitos con 100 microlitros de colorantes sensibles al voltaje, o VSD, o fluoróforos sensibles al calcio, o LCR, por pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de 30 minutos de incubación, reemplace los tintes con un medio de ensayo o HBSS. Equilibre las celdas a 37 grados centígrados antes de adquirir el mapeo óptico de datos de referencia utilizando un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento.Para tratar las células con medicamentos para pruebas de exposición aguda o mapear las células expuestas crónicamente a medicamentos de interés, diluir los medicamentos en dimetilsulfóxido, o DMSO, y almacenarlos como soluciones madre a 20 grados centígrados antes de diluirlos en HBSS a las concentraciones deseadas. Para las pruebas de cardiotoxicidad en placas de 96 pocillos, agregue cuatro dosis de un compuesto con al menos ocho pocillos por dosis. Use dosis que van de abajo a por encima de la concentración plasmática terapéutica clínicamente efectiva, incluida la dosis efectiva.Similar a las mediciones de electrofisiología de referencia antes de la aplicación del fármaco, capture los registros de electrofisiología al menos 30 minutos después del tratamiento farmacológico para estudios crónicos. Después de los registros basales, aplique al menos cuatro dosis de cada medicamento a monocapas maduras de hiPSC-CMs que expresen GCaMP6m, con al menos ocho pocillos por dosis. Equilibre los medicamentos en las células durante 30 minutos y caliente las células a 37 grados centígrados antes y durante la adquisición de datos.Después de los registros de referencia de una placa completa, agregue 500 isoproterenol nanomolares a cada pocillo para permitir datos sólidos de respuesta al fármaco y cuantificar los efectos del isoproterenol en la tasa de latido monocapa, la amplitud de contracción y la duración transitoria del calcio. Para adquirir datos de mapeo óptico, abra el cajón frontal y coloque la placa en el calentador de placas. Después de abrir el software de adquisición y determinar la ubicación de guardado del archivo en el software, seleccione de 10 a 30 segundos de duración y velocidad de fotogramas de adquisición para una mayor resolución temporal, y haga clic en Iniciar adquisición.Abra el software de análisis y, en la pestaña Importar filtro, seleccione Buscar un solo archivo o Mosaico múltiple para reconstruir una placa. Seleccione los archivos e introduzca un número de filas y columnas y seleccione Automático. A continuación, seleccione Actualizar tamaño de píxel, introduzca la distancia por píxel y utilice el Asistente para pozos para determinar la ubicación de los pozos en la imagen antes de hacer clic en Procesar guardar y pasar a la siguiente pestaña.Abra la pestaña ROIs, o Regiones de interés, y elija dibujar los ROIs manualmente, automáticamente, o no usar ROIs en absoluto, que se considerarán para el análisis de toda la placa. Después de seleccionar la región en el pozo, haga clic en el botón Procesar guardar para pasar al siguiente paso. Marque las casillas Ocultar pozos y Mostrar solo filtros para visualizar los ROI.Abra la pestaña Análisis, seleccione cada pozo o ROI para confirmar la precisión de la detección automática de latidos. Agregue o elimine ritmos de los seguimientos seleccionando un ritmo individual y presionando Eliminar en el teclado. Una vez hecho esto, haga clic en Guardar.A continuación, haga clic en el botón Gráfico de tiempo y espacio en la pestaña Análisis y agregue la línea para determinar el gráfico de espacio-tiempo para visualizar los datos de cada pozo o el ROI. Después de seleccionar una línea horizontal o vertical, haga clic en Generar parcela. Después de asegurarse de la detección precisa del ritmo, vaya a la pestaña Exportar y seleccione Formato de archivo, ingrese a la opción Estadística de ritmo antes de hacer clic en Exportar.Una vez exportado, abra los archivos de datos y ejecute la rutina de análisis estadístico elegida. Las imágenes de contraste de fase mostraron que los hiPSC-CM chapados en el MECM maduraron y se volvieron estructuralmente distintos del mismo lote de hiPSC-CM rechapados en el ECM del ratón. Las células maduras se volvieron en forma de bastón, mientras que las células inmaduras conservaron una forma circular.Los cardiomiocitos teñidos con anticuerpos alfa-actinina mostraron la forma típica de las células cultivadas en cada condición de ECM. Consistente con la tinción de TnI, la tinción de alfa-actinina indicó que los hiPSC-CM madurados en el MECM promovieron un fenotipo maduro en forma de bastón e indujeron una mayor organización del sarcómero. El contenido mitocondrial y la actividad fueron distintos entre las células cultivadas en la ECM de ratón y el MECM.Los datos electrofisiológicos para los potenciales de acción registrados utilizando VSD y el sistema de mapeo óptico mostraron que las células específicas de la auricular tienen una frecuencia de latido espontánea significativamente más rápida y una duración del potencial de acción más corta, o APD80, que las células específicas del ventrículo. Los mapas de calor de placa completa para parámetros como APD80 revelaron la reproducibilidad de un parámetro dado dentro de una placa. Los potenciales de acción típicos de las monocapas maduras de hiPSC-CM indicaron la morfología del potencial de acción de los cardiomiocitos adultos aislados y probados.También se mostró un ritmo espontáneo potencial de acción típico. En respuesta al isoproterenol, la activación de los receptores beta-1-adrenérgicos causó cronotropía positiva, inotropía positiva y lusitropía positiva. La respuesta HiPSC-CM al gen humano relacionado con el éter, o hERG, bloqueador de canales, incluyendo E-4031, domperidona, vandetanib y sotalol, se estudió utilizando la fluorescencia de calcio GCaMP6m para monitorear el ritmo.El estudio mostró la detección de despolarizaciones tempranas posteriores causadas por el bloqueo del canal hERG E-4031. Trabaje rápidamente con las células en suspensión y evite el esfuerzo cortante pipeteando las células suavemente. Además, realice el cambio de medios con cuidado para evitar dañar la sincitia hiPS.Después de este procedimiento, las células son susceptibles de recolección de proteínas, ARN, ADN y lípidos para su análisis con la técnica favorita de los investigadores. La técnica permite a los investigadores investigar enfermedades y probar la cardiotoxicidad de nuevos medicamentos utilizando cardiomiocitos similares a los adultos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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