Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Detta arbete har fått stöd av NIH-bidrag HL148068-04 och R44ES027703-02 (TJH).

hiPSC-användning i detta protokoll godkändes av University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialförteckningen för en lista över material och utrustning. Se tabell 1 för media och deras sammansättningar.
1. Upptining och plätering av kommersiellt tillgängliga kryokonserverade hiPSC-CM för mognad på en mognadsinducerande extracellulär matris (MECM)
<ol><li>Värm alla reagens til...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

Det finns flera olika metoder för in vitro kardiotoxicitet screening med hiPSC-CMs. Ett nyligen publicerat "Best Practices" -papper om användningen av hiPSC-CMs presenterade de olika in vitro-analyserna , deras primära avläsningar och viktigare, varje analyss granularitet för att kvantifiera human hjärtelektrofysiologisk funktion20. Förutom att använda membrangenomträngande elektroder tillhandahålls det mest direkta måttet på mänsklig hjärtelektrofysiologisk funktio...

Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har validerats på internationell nivå och är tillgängliga för in vitro-kardiotoxicitetsscreening1. Mycket rena hiPSC-CM kan genereras i praktiskt taget obegränsat antal, kryokonserveras och tinas. Vid omplätering återupplivas de också och börjar dra ihop sig med en rytm som påminner om det mänskliga hjärtat 2,3. Anmärkningsvärt är att enskilda hiPSC-CMs kopplas till varandra och bildar funktionell syncytia som slår som en enda vävnad. Numera härrör hiPSC rutinmässigt från patientens blodprover, så vem som helst kan representeras med hjälp av in vitro hiPSC-CM kardiotoxicitetsscreeninganalyser 4,5. Detta skapar möjlighet att utföra "kliniska prövningar i en maträtt", med betydande representation från olika populationer6.
En kritisk fördel jämfört med befintliga screeningmetoder för djur- och djurcellskardiotoxicitet är att hiPSC-CMs använder hela det mänskliga genomet och erbjuder ett in vitro-system med genetiska likheter med det mänskliga hjärtat. Detta är särskilt attraktivt för farmakogenomik och personlig medicin - användningen av hiPSC-CM för medicinering och annan terapiutveckling förutspås ge mer exakta, exakta och säkra läkemedelsrecept. Faktum är att tvådimensionella (2D) hiPSC-CM-monolageranalyser har visat sig vara prediktiva för läkemedelskardiotoxicitet, med hjälp av en panel av kliniskt använda läkemedel med känd risk att orsaka arytmier 1,7,8,9. Trots hiPSC-CMs stora potential och löftet att effektivisera och göra läkemedelsutveckling billigare, har det funnits en motvilja mot att använda dessa nya analyser10,11,12.
Hittills är en stor begränsning av utbredd adoption och acceptans av hiPSC-CM-screeninganalyser deras omogna, fosterliknande utseende, liksom deras funktion. Den kritiska frågan om hiPSC-CM-mognad har granskats och debatterats i den vetenskapliga litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samma sätt har många metoder använts för att främja hiPSC-CM-mognad, inklusive extracellulära matrismanipulationer (ECM) i 2D-monolager och utveckling av 3D-konstruerade hjärtvävnader (EHT)17,18. För närvarande finns det en utbredd tro på att användningen av 3D EHT kommer att ge överlägsen mognad i förhållande till 2D-monolagerbaserade metoder. 2D-monolager ger emellertid en högre effektivitet av cellutnyttjande och ökad framgång vid plätering jämfört med 3D EHT; 3D EHT använder ett större antal celler och kräver ofta inkludering av andra celltyper som kan förvirra resultat. Därför ligger fokus i denna artikel på att använda en enkel metod för att mogna hiPSC-CMs odlade som 2D-monolager av elektriskt och mekaniskt kopplade celler.
Avancerad hiPSC-CM-mognad kan uppnås i 2D-monolager med hjälp av en ECM. 2D-monolagren av hiPSC-CM kan mogna med hjälp av ett mjukt, flexibelt polydimetylsiloxantäckglas, belagt med basalmembranmatris utsöndrad av en Engelbreth-Holm-Swarm-mussarkomcell (mus-ECM). År 2016 visade rapporter att hiPSC-CMs odlade på detta mjuka ECM-tillstånd mognade funktionellt och visade verkningspotentialens ledningshastigheter nära vuxna hjärtvärden (~ 50 cm / s)18. Vidare uppvisade dessa mogna hiPSC-CMs många andra elektrofysiologiska egenskaper som påminner om det vuxna hjärtat, inklusive hyperpolariserad vilomembranpotential och uttryck av Kir2.1. Mer nyligen identifierade rapporter en human perinatal stamcellshärledd ECM-beläggning som främjar strukturell mognad av 2D hiPSC-CMs19. Här presenteras lättanvända metoder för strukturellt mogna 2D hiPSC-CM-monolager för användning i elektrofysiologiska skärmar med hög kapacitet. Vidare tillhandahåller vi validering av ett optiskt kartläggningsinstrument för automatiserad insamling och analys av 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologisk funktion, med hjälp av spänningskänsliga färgämnen (VSDs) och kalciumkänsliga sonder och proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

Humant inducerade stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) används för att ersätta och minska beroendet av djur och djurceller för preklinisk kardiotoxicitetstestning. I tvådimensionella monolagerformat rekapitulerar hiPSC-CMs strukturen och funktionen hos de vuxna mänskliga hjärtmuskelcellerna när de odlas på en optimal extracellulär matris (ECM). En human perinatal stamcellshärledd ECM (mognadsinducerande extracellulär matrix-MECM) mognar hiPSC-CM-strukturen, funktionen och det metaboliska tillståndet inom 7 dagar efter plätering. 
Mogna hiPSC-CM-monolager svarar också som förväntat på kliniskt relevanta läkemedel, med en känd risk att orsaka arytmier och kardiotoxicitet. Mognaden av hiPSC-CM-monolager var ett hinder för den utbredda användningen av dessa värdefulla celler för regulatorisk vetenskap och säkerhetsscreening, tills nu. Denna artikel presenterar validerade metoder för plätering, mognad och funktionell fenotypning med hög genomströmning av hiPSC-CM elektrofysiologisk och kontraktil funktion. Dessa metoder gäller kommersiellt tillgängliga renade kardiomyocyter, såväl som stamcellshärledda kardiomyocyter som genereras internt med högeffektiva, kammarspecifika differentieringsprotokoll. 
Elektrofysiologisk funktion med hög genomströmning mäts med antingen spänningskänsliga färgämnen (VSDs; emission: 488 nm), kalciumkänsliga fluoroforer (CSF) eller genetiskt kodade kalciumsensorer (GCaMP6). En optisk kartläggningsenhet med hög genomströmning används för optiska inspelningar av varje funktionell parameter, och anpassad dedikerad programvara används för elektrofysiologisk dataanalys. MECM-protokoll tillämpas för läkemedelsscreening med hjälp av en positiv inotrop (isoprenalin) och humana Ether-a-go-go-related gen (hERG) kanalspecifika blockerare. Dessa resurser kommer att göra det möjligt för andra utredare att framgångsrikt använda mogna hiPSC-CMs för hög genomströmning, preklinisk kardiotoxicitetsscreening, hjärtmedicineringseffektivitetstestning och kardiovaskulär forskning.

hiPSC-CM-mognad kännetecknad av faskontrast och immunofluorescerande konfokal avbildning Tidslinjen för ECM-medierad mognad av kommersiellt tillgängliga hiPSC-CMs med MECM-belagda 96-brunnsplattor presenteras i figur 1A. Dessa data samlas in med hjälp av kommersiellt tillgängliga kardiomyocyter som anländer till laboratoriet som kryokonserverade flaskor av celler. Varje injektionsflaska innehåller >5 × 106 livsdugliga kardiomyocyter. Cellerna är ~ 98% ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) erbjuder ett alternativ till att använda djur för preklinisk kardiotoxicitetsscreening. En begränsning för den utbredda användningen av hiPSC-CMs vid preklinisk toxicitetsscreening är cellernas omogna, fosterliknande fenotyp. Här presenteras protokoll för robust och snabb mognad av hiPSC-CM.

Kardiotoxicitetsscreening med hög kapacitet med mogna humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocytmonolager

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det gör det möjligt för forskare att mogna kommersiella eller internt tillverkade hiPSC-CMs till en vuxenliknande fenotyp som avsevärt förbättrar det prediktiva värdet av hiPSC-CMs vid kardiotoxicitetsscreening. Den största fördelen med detta protokoll är att det levererar mogna hiPSC-CMs i ett format med hög genomströmning för optisk kartläggning av kalcium- eller spänningsförändringar. Detta protokoll kan användas för att undersöka sjukdomsmekanismer eller för att screena läkemedel för kardiotoxicitet.Demonstrerar proceduren kommer att vara Jeffrey Creech, en forskningsassistent från mitt laboratorium. Börja med att tvätta den mognadsinducerande extracellulära matrisen, eller MECM, plattorna två gånger med 200 mikroliter av Hanks balanserade saltlösning, eller HBSS, 1 timme före kardiomyocytplätering. Håll brunnarna hydratiserade.Överför kardiomyocytrören från tanken med flytande kväve till torris och släpp trycket genom att öppna rörlocken något. Sätt sedan tillbaka rörlocken och tina dem i vattenbadet i 4 minuter. Efter upptining av cellerna, spraya rören med 70% etanol innan du öppnar dem.Överför cellerna till 15 ml koniska rör med en 1-milliliter pipett. Tillsätt 1 ml pläteringsmedium till kryovialen och överför tvätten till det 15 ml koniska röret. Droppa sedan långsamt 1 ml pläteringsmedium och agitera röret.Upprepa detta tills överföringen av 8 ml pläteringsmedium. Centrifugera 15-milliliterröret vid 300 x g i 5 minuter och suspendera pelleten igen i 1 ml av pläteringsmediet. Ta bort en alikvot och utför levande cellräkning med en hemocytometer innan du lägger till ett pläteringsmedium för att erhålla 7,5 x 10 till de 5: e cellerna per milliliter.Fördela 100 mikroliter av cellsuspensionen per brunn av en MECM-belagd 96-brunnsplatta med en flerkanalig pipett och inkubera cellerna i 2 dagar. Byt sedan ut mediet med 200 mikroliter underhållsmedium och behåll plattorna i 7 dagar, med byte av medium på dag 5. På dag 7, utför EP-analys, som beskrivs i texten.Se till att byta medium varannan dag när du väljer att förlänga cellkulturen. För att rena hiPSC-CM via magnetaktiverad cellsortering, eller MACS, aspirera cellodlingsmediet och tvätta cellerna med 1 milliliter HBSS-Dissera sedan cellerna genom att tillsätta 1 milliliter 0,25% trypsin-etylendiamintetraättik eller EDTA och inkubera cellerna i 10 minuter. Inaktivera sedan trypsin / EDTA genom att skicka om och singularisera cellerna med 2 ml pläteringsmedium.Från de sex brunnarna samlar cellerna i ett 50 ml koniskt rör med en 70 mikrometer sil. Efter tvättning av silen med 3 ml pläteringsmedium, räkna cellerna. Efter räkning, centrifugera och tvätta cellpelleten med 2 ml iskall MACS-separationsbuffert före pelletering och skicka cellerna igen i 80 mikroliter kall MACS-separationsbuffert per 5 x 10 till de 6: e cellerna.Tillsätt 20 mikroliter kall icke-kardiomyocytutarmningscocktail och blanda suspensionen innan du inkuberar på is i 10 minuter. Efter tvättning av cellerna med 4 ml kall MACS-separationsbuffert vid 300 x g i 5 minuter, återsuspendera pelleten i 80 mikroliter kall MACS-separationsbuffert. Tillsätt 20 mikroliter kalla anti-biotinmikrokulor per 5 x 10 till de 6: e cellerna och blanda försiktigt cellsuspensionen innan du inkuberar på is i 10 minuter.Medan proverna inkuberas, placera de positiva utarmningskolonnerna utrustade med 30 mikrometer förseparationsfilter på MACS-separatorn och placera de märkta 15-milliliter uppsamlingsrören under kolonnerna. Fyll sedan varje kolumn med 3 ml kall MACS-separationsbuffert. Blanda den antikroppsbehandlade cellsuspensionen med 2 ml MACS-separationsbuffert och lägg den i kolonnen.Tillsätt 2 ml MACS-separationsbuffert till varje kolumn och samla 12 ml flödeskardiomyocytsuspension. Centrifugera kardiomyocyterna och kassera supernatanten innan kardiomyocyterna suspenderas i ett 1 ml pläteringsmedium. För att bestämma koncentrationen, räkna cellerna och justera volymen till önskad sådddensitet innan du pläterar de renade kardiomyocytcellerna på MECM 96-brunnsplattorna.Aspirera och ersätt kardiomyocytunderhållsmediet med 100 mikroliter spänningskänsliga färgämnen, eller VSD, eller kalciumkänsliga fluoroforer, eller CSF, per brunn på en 96-brunnsplatta. Efter 30 minuters inkubation, ersätt färgämnena med ett analysmedium eller HBSS. Balansera cellerna vid 37 grader Celsius innan du hämtar optisk kartläggning av baslinjedata med hjälp av en optisk kartläggningsenhet med hög genomströmning.För att behandla cellerna med läkemedel för akut exponeringstestning eller kartlägga de celler som kroniskt exponeras för läkemedel av intresse, späd läkemedlen i dimetylsulfoxid eller DMSO och förvara dem som stamlösningar vid 20 grader Celsius innan de späds i HBSS till önskade koncentrationer. För kardiotoxicitetstestning i 96-brunnsplattor, tillsätt fyra doser av en förening med minst åtta brunnar per dos. Använd doser som sträcker sig från nedan till över den kliniskt effektiva terapeutiska plasmakoncentrationen, inklusive den effektiva dosen.I likhet med baslinjens elektrofysiologiska mätningar före läkemedelsapplikation, fånga elektrofysiologiska inspelningar minst 30 minuter efter läkemedelsbehandling för kroniska studier. Efter baslinjeregistreringar, applicera minst fyra doser av varje läkemedel på mogna hiPSC-CMs monolager som uttrycker GCaMP6m, med minst åtta brunnar per dos. Balansera medicinerna på cellerna i 30 minuter och värm cellerna till 37 grader Celsius före och under datainsamlingen.Efter baslinjeinspelningar av en hel platta, tillsätt 500 nanomolar isoproterenol till varje brunn för att möjliggöra robusta läkemedelsresponsdata och kvantifiera effekterna av isoproterenol på monolagers slaghastighet, kontraktionsamplitud och kalciumövergående varaktighet. För att hämta optiska kartdata, öppna den främre lådan och placera plattan på plattvärmaren. När du har öppnat förvärvsprogrammet och fastställt filsparningsplatsen i programvaran väljer du 10 till 30 sekunders varaktighet och bildhastighet för förvärv för högre tidsupplösning och klickar på Starta förvärv.Öppna analysprogrammet och välj antingen Bläddra efter en enskild fil eller Sida vid sida på fliken Importera filter för att rekonstruera en platta. Markera filerna och ange ett antal rader och kolumner och välj Automatisk. Välj sedan Uppdatera pixelstorlek, ange avstånd per pixel och använd brunnsguiden för att bestämma brunnarnas placering i bilden innan du klickar på Process Save och flyttar till nästa flik.Öppna fliken ROI, eller Regioner av intresse, och välj att rita ROI: erna manuellt, automatiskt eller inte använda ROI alls, vilket kommer att beaktas för analysen av hela plattan. När du har valt regionen i brunnen klickar du på knappen Process Save för att gå till nästa steg. Markera rutorna Dölj brunnar och Visa endast filtrerade för att visualisera avkastningen.Öppna fliken Analys, välj varje brunn eller ROI för att bekräfta noggrannheten för automatisk slagdetektering. Lägg till eller ta bort taktslag från spåren genom att välja ett enskilt slag och trycka på backstegstangenten på tangentbordet. När du är klar klickar du på Spara.Klicka sedan på knappen Tid-rymddiagram på fliken Analys och lägg till linjen för att bestämma tid-rymddiagrammet för att visualisera data för varje brunn eller ROI. När du har valt en horisontell eller vertikal linje klickar du på Generera diagram. När du har säkerställt korrekt taktdetektering, fortsätt till fliken Exportera och välj Filformat, ange alternativet Beat Statistic innan du klickar på Exportera.När du har exporterat, öppna datafiler och kör den valda statistiska analysrutinen. Faskontrastavbildning visade att hiPSC-CMs pläterade på MECM mognade och blev strukturellt distinkta från samma sats hiPSC-CMs ompläterade på musens ECM. Mogna celler blev stavformade, medan omogna celler behöll en cirkulär form.Kardiomyocyter färgade med alfa-aktininantikroppar visade den typiska formen av cellerna odlade på varje ECM-tillstånd. I överensstämmelse med TnI-färgningen indikerade alfa-aktininfärgningen att hiPSC-CMs mognade på MECM främjade en stavformad mogen fenotyp och inducerade större sarkomerorganisation. Mitokondriellt innehåll och aktivitet var distinkt mellan celler odlade på musens ECM och MECM.De elektrofysiologiska data för aktionspotentialer som registrerats med VSDs och det optiska kartläggningssystemet visade att de förmaksspecifika cellerna har en signifikant snabbare spontan slagfrekvens och kortare verkningspotentialduration, eller APD80, än de ventrikelspecifika cellerna. Helplåtsvärmekartor för parametrar som APD80 avslöjade reproducerbarheten av en given parameter i en platta. Typiska åtgärdspotentialer för mogna hiPSC-CM-monolager indikerade verkningspotentialmorfologin hos isolerade och testade vuxna kardiomyocyter.En typisk aktionspotential spontan rytm visades också. Som svar på isoproterenol orsakade aktivering av beta-1-adrenerga receptorer positiv kronotropi, positiv inotropi och positiv lusitropi. HiPSC-CM-svar på human Ether-a-go-go-relaterad gen, eller hERG, kanalblockerare, inklusive E-4031, domperidon, vandetanib och sotalol, studerades med GCaMP6m kalciumfluorescens för att övervaka rytmen.Studien visade detektering av tidiga efterdepolariseringar orsakade av E-4031 hERG-kanalblockaden. Arbeta snabbt med cellerna i suspension och undvik skjuvspänning genom att pipettera cellerna försiktigt. Dessutom utför mediebyte noggrant för att undvika att hiPS-syncytia skadas.Efter denna procedur är celler mottagliga för protein-, RNA-, DNA- och lipidinsamling för analys med utredarnas favoritteknik. Tekniken ger forskare möjlighet att undersöka sjukdomar och testa för kardiotoxicitet hos nya läkemedel med hjälp av vuxenliknande kardiomyocyter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utveckling, expansion och<em&gt; In vivo</em&gt; Övervakning av humana NK celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av vuxna humana dermal fibroblaster från buk hud och generering av inducerade pluripotenta stamceller med en icke-integrerande metod

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidad differentiering av mogna njurpodocyter från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller under kemiskt definierade förhållanden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Utvärdering av hjärtkontraktilitetsmoduleringsterapi i 2D-humana stamcellshärledda kardiomyocyter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...