Name: high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibeleri HL148068-04 ve R44ES027703-02 (TJH) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokolde hiPSC kullanımı Michigan Üniversitesi HPSCRO Komitesi (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) tarafından onaylanmıştır. Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosu'na bakın. Medya ve kompozisyonları için Tablo 1'e bakınız.
1. Olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris (MECM) üzerinde olgunlaşma için ticari olarak temin edilebilen kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin çözülmesi ve kaplanması
<ol><li...

<ol>
	<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers.">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li><li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish:+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development.">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li><li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+a+dish.">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+in+a+dish:+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs.">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li><li>Blinova, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias.">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen.">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).</li><li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay.">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells:+how+far+have+we+come.">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+new+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biowire:+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li><li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function.">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).</li><li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes.">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).</li><li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models.">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li></ol>

HiPSC-CM'ler kullanılarak in vitro kardiyotoksisite taramasına birkaç farklı yaklaşım vardır. HiPSC-CM'lerin kullanımı ile ilgili yakın tarihli bir "En İyi Uygulamalar" makalesi, çeşitli in vitro tahlilleri, birincil okumalarını ve daha da önemlisi, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunu ölçmek için her bir tahlilin granülerliğini sunmuştur20. Membran delici elektrotların kullanılmasına ek olarak, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunun en d...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) uluslararası ölçekte doğrulanmıştır ve in vitro kardiyotoksisite taraması için mevcuttur1. Son derece saf hiPSC-CM'ler neredeyse sınırsız sayıda üretilebilir, kriyoprezerve edilebilir ve çözülebilir. Yeniden kaplama üzerine, aynı zamanda yeniden canlanırlar ve insan kalbini anımsatan bir ritimle büzülmeye başlarlar 2,3. Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hiPSC-CM'ler birbirleriyle çiftleşir ve tek bir doku olarak atan fonksiyonel sinsiti oluşturur. Günümüzde, hiPSC'ler rutin olarak hasta kan örneklerinden türetilmektedir, bu nedenle in vitro hiPSC-CM kardiyotoksisite tarama testleri 4,5 kullanılarak herhangi bir kişi temsil edilebilir. Bu, çeşitli popülasyonlardan önemli temsillerle "Bir Tabakta Klinik Çalışmalar" gerçekleştirme fırsatı yaratır6.
Mevcut hayvan ve hayvan hücresi kardiyotoksisitesi tarama yaklaşımlarına göre kritik bir avantaj, hiPSC-CM'lerin tüm insan genomunu kullanması ve insan kalbine genetik benzerliklere sahip bir in vitro sistem sunmasıdır. Bu özellikle farmakogenomik ve kişiselleştirilmiş tıp için caziptir - ilaç ve diğer tedavi geliştirme için hiPSC-CM'lerin kullanımının daha doğru, kesin ve güvenli ilaç reçeteleri sağlayacağı tahmin edilmektedir. Gerçekten de, iki boyutlu (2D) hiPSC-CM tek katmanlı testlerin, aritmilere neden olduğu bilinen bir klinik olarak kullanılan ilaç paneli kullanılarak ilaç kardiyotoksisitesinin öngörücü olduğu kanıtlanmıştır 1,7,8,9. HiPSC-CM'lerin geniş potansiyeline ve ilaç geliştirmeyi kolaylaştırma ve daha ucuz hale getirme vaadine rağmen, bu yeni tahlilleri kullanma konusunda isteksizlik olmuştur10,11,12.
Şimdiye kadar, hiPSC-CM tarama testlerinin yaygın olarak benimsenmesi ve kabul edilmesinin önemli bir sınırlaması, olgunlaşmamış, fetal benzeri görünümlerinin yanı sıra işlevleridir. HiPSC-CM olgunlaşmasının kritik konusu ad nauseum13,14,15,16 bilimsel literatüründe gözden geçirilmiş ve tartışılmıştır. Benzer şekilde, 2D monokatmanlarda hücre dışı matriks (ECM) manipülasyonları ve 3D mühendislik kalp dokularının (EHT'ler) geliştirilmesi de dahil olmak üzere hiPSC-CM olgunlaşmasını teşvik etmek için birçok yaklaşım kullanılmıştır17,18. Şu anda, 3D EHT'lerin kullanımının 2D tek katmanlı yaklaşımlara göre üstün olgunlaşma sağlayacağına dair yaygın bir inanç var. Bununla birlikte, 2D monolayer'lar, 3D EHT'lere kıyasla daha yüksek bir hücre kullanımı verimliliği ve kaplamada daha fazla başarı sağlar; 3D EHT'ler daha fazla sayıda hücre kullanır ve genellikle sonuçları karıştırabilecek diğer hücre tiplerinin dahil edilmesini gerektirir. Bu nedenle, bu makalede, elektriksel ve mekanik olarak bağlanmış hücrelerin 2D tek katmanları olarak kültürlenmiş hiPSC-CM'leri olgunlaştırmak için basit bir yöntem kullanmaya odaklanılmıştır.
Gelişmiş hiPSC-CM olgunlaşması, bir ECM kullanılarak 2D tek katmanlarda elde edilebilir. HiPSC-CM'lerin 2D monokatmanları, bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücresi (fare ECM) tarafından salgılanan bazal membran matrisi ile kaplanmış yumuşak, esnek bir polidimetilsiloksan örtü kayması kullanılarak olgunlaştırılabilir. 2016 yılında raporlar, bu yumuşak ECM koşulunda kültürlenen hiPSC-CM'lerin işlevsel olarak olgunlaştığını ve yetişkin kalp değerlerine (~ 50 cm / s) yakın aksiyon potansiyeli iletim hızları gösterdiğini göstermiştir18. Ayrıca, bu olgun hiPSC-CM'ler, hiperpolarize dinlenme zarı potansiyeli ve Kir2.1'in ekspresyonu da dahil olmak üzere yetişkin kalbini anımsatan birçok elektrofizyolojik özellik göstermiştir. Daha yakın zamanlarda, raporlar, 2D hiPSC-CM'lerin yapısal olgunlaşmasını destekleyen insan perinatal kök hücre kaynaklı bir ECM kaplaması tanımladı19. Burada, yüksek verimli elektrofizyolojik ekranlarda kullanılmak üzere yapısal olarak olgun 2D hiPSC-CM tek katmanlara kullanımı kolay yöntemler sunulmaktadır. Ayrıca, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) ve kalsiyuma duyarlı problar ve proteinler kullanarak 2D hiPSC-CM tek katmanlı elektrofizyolojik fonksiyonun otomatik olarak elde edilmesi ve analizi için optik bir haritalama cihazının doğrulanmasını sağlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &#181;mol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdGCaMP6m</td>
			<td>Vector biolabs</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9731-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha actinin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA1-22863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalBryte 520AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>20650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo MatrixPlus 96wp</td>
			<td>StemBiosys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>c-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Assay medium (fluorobrite)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>For adenovirus transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell CM maintenance media</td>
			<td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td>
			<td>M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell2 CMs</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Zoom&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF19-9-11T.H</td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CAS-51-30-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nautilus HTS Optical Mapping&#160;</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-separation filter</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-110-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse</td>
			<td>CuriBio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.curibio.com/products-overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS separator (Magnet)</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS iPS-Brew XF</td>
			<td>Miltenyii Biotec</td>
			<td>130-107-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnI antibody (pan TnI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB1691&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cardiotoxicity screening using mature human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte monolayers

İnsan kaynaklı kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite testi için hayvanlara ve hayvan hücrelerine olan bağımlılığı değiştirmek ve azaltmak için kullanılır. İki boyutlu tek katmanlı formatlarda, hiPSC-CM'ler, optimal bir hücre dışı matris (ECM) üzerinde kültürlendiğinde yetişkin insan kalp kası hücrelerinin yapısını ve işlevini özetler. İnsan perinatal kök hücre kaynaklı ECM (olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matriks-MECM), kaplamadan sonraki 7 gün içinde hiPSC-CM yapısını, işlevini ve metabolik durumunu olgunlaştırır. 
Olgun hiPSC-CM monokatmanları da klinik olarak ilgili ilaçlara beklendiği gibi yanıt verir ve aritmilere ve kardiyotoksisiteye neden olma riski vardır. HiPSC-CM monokatmanlarının olgunlaşması, şimdiye kadar düzenleyici bilim ve güvenlik taraması için bu değerli hücrelerin yaygın olarak benimsenmesinin önünde bir engeldi. Bu makalede, hiPSC-CM elektrofizyolojik ve kontraktil fonksiyonun kaplanması, olgunlaşması ve yüksek verimli, fonksiyonel fenotiplemesi için doğrulanmış yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış kardiyomiyositlerin yanı sıra, yüksek verimli, odaya özgü farklılaşma protokolleri kullanılarak şirket içinde üretilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler için de geçerlidir. 
Yüksek verimli elektrofizyolojik fonksiyon, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler; emisyon: 488 nm), kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri (GCaMP6) kullanılarak ölçülür. Her fonksiyonel parametrenin optik kayıtları için yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanılır ve elektrofizyolojik veri analizi için özel özel bir yazılım kullanılır. MECM protokolleri, pozitif inotrop (izoprenalin) ve insan Ether-a-go-go-ilişkili gen (hERG) kanalına özgü blokerler kullanılarak ilaç taraması için uygulanır. Bu kaynaklar, diğer araştırmacıların yüksek verimli, klinik öncesi kardiyotoksisite taraması, kardiyak ilaç etkinlik testi ve kardiyovasküler araştırmalar için olgun hiPSC-CM'leri başarıyla kullanmalarını sağlayacaktır.

faz kontrastı ve immünofloresan konfokal görüntüleme ile karakterize hiPSC-CM matürasyonu MECM kaplamalı 96 delikli plakalar kullanılarak ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'lerin ECM aracılı olgunlaşması için zaman çizelgesi Şekil 1A'da sunulmuştur. Bu veriler, laboratuvara kriyokorunmuş hücre şişeleri olarak gelen ticari olarak temin edilebilen kardiyomiyositler kullanılarak toplanır. Her flakon >5 × 106 canlı kardiyomiyosit içeri...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers at JoVE.com

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların ticari veya kurum içi hiPSC-CM'leri, kardiyotoksisite taramasında hiPSC-CM'lerin öngörücü değerini önemli ölçüde artıran yetişkin benzeri bir fenotipe olgunlaştırmalarını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, kalsiyum veya voltaj değişiminin optik haritalanması için yüksek verimli bir formatta olgun hiPSC-CM'ler sunmasıdır. Bu protokol, hastalık mekanizmalarını araştırmak veya ilaçları kardiyotoksisite açısından taramak için kullanılabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Jeffrey Creech olacak. Kardiyomiyosit kaplamadan 1 saat önce, olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris veya MECM plakalarını 200 mikrolitre Hank'in dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile iki kez yıkayarak başlayın. Kuyuları nemli tutun.Kardiyomiyosit tüplerini sıvı azot tankından kuru buza aktarın ve tüp kapaklarını hafifçe açarak basıncı serbest bırakın. Daha sonra, tüp kapaklarını tekrar kapatın ve 4 dakika boyunca su banyosunda çözün. Hücrelerin çözülmesinden sonra, tüpleri açmadan önce% 70 etanol ile püskürtün.Hücreleri 1 mililitrelik pipetle 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Kriyovyal malzemeye 1 mililitre kaplama ortamı ekleyin ve yıkamayı 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, yavaşça 1 mililitre kaplama ortamı damlatın ve tüpü çalkalayın.8 mililitre kaplama ortamının transferine kadar bunu tekrarlayın. 15 mililitrelik tüpü 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve peletleri kaplama ortamının 1 mililitresinde tekrar askıya alın. Bir aliquot'u çıkarın ve mililitre başına 5. hücrelere 7.5 x 10 elde etmek için bir kaplama ortamı eklemeden önce bir hemositometre ile canlı hücre sayımı yapın.Çok kanallı bir pipet kullanarak MECM kaplı 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın ve hücreleri 2 gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı 200 mikrolitre bakım ortamı ile değiştirin ve plakaları 7 gün boyunca koruyun, 5. günde ortam değişikliği yapın. 7. günde, metinde açıklandığı gibi EP testi yapın.Hücre kültürünü genişletmeyi tercih ederken ortamı her geçen gün değiştirdiğinizden emin olun. HiPSC-CM'yi manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama veya MACS yoluyla saflaştırmak için, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri 1 mililitre HBSS ile yıkayın-Daha sonra, 1 mililitre% 0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik veya EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 2 mililitre kaplama ortamı ile yeniden göndererek ve tekilleştirerek tripsin / EDTA'yı inaktive edin.Altı kuyucuktan, hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeç kullanarak 50 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Süzgeci 3 mililitre kaplama ortamı ile yıkadıktan sonra, hücreleri sayın. Sayımdan sonra, hücre peletini 2 mililitre buz gibi soğuk MACS ayırma tamponu ile santrifüj edin ve yıkayın, sonra peletleyin ve hücreleri 5 x 10 başına 80 mikrolitre soğuk MACS ayırma tamponunda 6. hücrelere yeniden gönderin.20 mikrolitre soğuk kardiyomiyosit olmayan tükenme kokteyli ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce süspansiyonu karıştırın. Hücreleri 300 x g'de 4 mililitre soğuk MACS ayırma tamponu ile 5 dakika yıkadıktan sonra, pelet 80 mikrolitre soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 6. hücrelere 5 x 10 başına 20 mikrolitre soğuk anti-biyotin mikroboncuk ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce hücre süspansiyonunu hafifçe karıştırın.Numuneler inkübe edilirken, 30 mikrometre ön ayırma filtreleriyle donatılmış pozitif tükenme sütunlarını MACS ayırıcısına yerleştirin ve etiketli 15 mililitrelik toplama tüplerini sütunların altına yerleştirin. Ardından, her sütunu 3 mililitre soğuk MACS ayırma arabelleği ile amortismana alın. Antikorla muamele edilmiş hücre süspansiyonunu 2 mililitre MACS ayırma tamponu ile karıştırın ve sütuna ekleyin.Her sütuna 2 mililitre MACS ayırma tamponu ekleyin ve 12 mililitre akışlı kardiyomiyosit süspansiyonu toplayın. Kardiyomiyositleri santrifüj edin ve kardiyomiyositleri 1 mililitrelik bir kaplama ortamında yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Konsantrasyonu belirlemek için, hücreleri sayın ve saflaştırılmış kardiyomiyosit hücrelerini MECM 96 kuyucuklu plakalara kaplamadan önce hacmi istenen tohumlama yoğunluğuna ayarlayın.Kardiyomiyosit bakım ortamını aspire edin ve 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 mikrolitre voltaja duyarlı boya veya VSD veya kalsiyuma duyarlı floroforlar veya CSF ile değiştirin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boyaları bir tahlil ortamı veya HBSS ile değiştirin. Yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanarak temel veri optik haritalamasını almadan önce hücreleri 37 santigrat derecede dengeleyin.Hücreleri akut maruziyet testi için ilaçlarla tedavi etmek veya kronik olarak ilgili ilaçlara maruz kalan hücreleri haritalamak için, ilaçları dimetil sülfoksit veya DMSO içinde seyreltin ve HBSS'de istenen konsantrasyonlara seyreltmeden önce 20 santigrat derecede stok çözeltileri olarak saklayın. 96 kuyucuklu plakalarda kardiyotoksisite testi için, doz başına en az sekiz kuyucuklu bir bileşiğin dört dozunu ekleyin. Etkili doz da dahil olmak üzere klinik olarak etkili terapötik plazma konsantrasyonunun altından üstüne kadar değişen dozları kullanın.İlaç uygulamasından önceki temel elektrofizyoloji ölçümlerine benzer şekilde, kronik çalışmalar için ilaç tedavisinden en az 30 dakika sonra elektrofizyoloji kayıtlarını yakalayın. Temel kayıtlardan sonra, GCaMP6m'yi ifade eden olgun hiPSC-CM'lerin monokatmanlarına, doz başına en az sekiz kuyucuk olacak şekilde, her ilacın en az dört dozunu uygulayın. Hücreler üzerindeki ilaçları 30 dakika boyunca dengeleyin ve veri toplama öncesinde ve sırasında hücreleri 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.Tüm plakanın temel kayıtlarını takiben, sağlam ilaç yanıt verilerini sağlamak ve izoproterenolün tek katmanlı atım hızı, kasılma genliği ve kalsiyum geçici süresi üzerindeki etkilerini ölçmek için her kuyucuğa 500 nanomolar izoproterenol ekleyin. Optik eşleme verilerini almak için ön çekmeceyi açın ve plakayı plakalı ısıtıcının üzerine yerleştirin. Edinme yazılımını açtıktan ve yazılımdaki dosya kaydetme konumunu belirledikten sonra, daha yüksek zamansal çözünürlük için 10 ila 30 saniye süreyi ve kare hızını seçin ve Almayı Başlat'ı tıklatın.Analiz yazılımını açın ve İçe Aktarma Filtresi sekmesinde, tek bir dosyaya gözat'ı veya bir plakayı yeniden oluşturmak için Birden Çok Döşeme'yi seçin. Dosyaları seçin, bir dizi satır ve sütun girin ve Otomatik'i seçin. Ardından, Piksel Boyutunu Güncelleştir'i seçin, piksel başına mesafe girin ve Kaydet'i İşleme'yi tıklatıp bir sonraki sekmeye geçmeden önce görüntüdeki kuyucukların konumunu belirlemek için Kuyu Sihirbazı'nı kullanın.YG'leri veya İlgi Çekici Bölgeler sekmesini açın ve YG'leri manuel, otomatik olarak çizmeyi veya tüm plakanın analizi için dikkate alınacak YG'leri hiç kullanmamayı seçin. Kuyudaki bölgeyi seçtikten sonra, bir sonraki adıma geçmek için İşlem Kaydet düğmesine tıklayın. YG'leri görselleştirmek için Kutuları Gizle ve Yalnızca Filtrelenmiş Olanları Göster kutularını işaretleyin.Analiz sekmesini açın, otomatik vuruş algılamanın doğruluğunu onaylamak için her bir kuyucuğu veya yatırım getirisini seçin. Tek bir vuruş seçip klavyede Delete tuşuna basarak izlemelere darbe ekleyin veya izlemelerden vuruşları kaldırın. İşiniz bittiğinde, Kaydet'e tıklayın.Ardından, Analiz sekmesindeki Zaman-Uzay Grafiği düğmesini tıklatın ve her bir kuyu veya YG için verileri görselleştirmek üzere zaman-uzay grafiğini belirlemek üzere çizgiyi ekleyin. Yatay veya dikey bir çizgi seçtikten sonra, Çizim Oluştur'a tıklayın. Doğru vuruş algılamasını sağladıktan sonra, Dışa Aktar sekmesine ilerleyin ve Dosya Biçimi'ni seçin, Dışa Aktar'ı tıklamadan önce Vuruş İstatistikleri seçeneğini girin.Dışa aktarıldıktan sonra, veri dosyalarını açın ve seçilen istatistiksel analiz rutinini çalıştırın. Faz kontrastlı görüntüleme, MECM üzerine kaplanmış hiPSC-CM'lerin olgunlaştığını ve fare ECM'sinde kaplanan aynı hiPSC-CM grubundan yapısal olarak farklı hale geldiğini göstermiştir. Olgun hücreler çubuk şeklinde olurken, olgunlaşmamış hücreler dairesel bir şekil aldı.Alfa-aktinin antikorları ile boyanmış kardiyomiyositler, her ECM koşulunda kültürlenen hücrelerin tipik şeklini göstermiştir. TnI boyaması ile tutarlı olarak, alfa-aktinin boyaması, MECM üzerinde olgunlaşan hiPSC-CM'lerin çubuk şeklinde olgun bir fenotipi teşvik ettiğini ve daha büyük sarkomer organizasyonunu indüklediğini göstermiştir. Mitokondriyal içerik ve aktivite, fare ECM'sinde kültürlenen hücreler ile MECM arasında farklıydı.VSD'ler ve optik haritalama sistemi kullanılarak kaydedilen aksiyon potansiyelleri için elektrofizyolojik veriler, atriyal spesifik hücrelerin ventriküler spesifik hücrelerden önemli ölçüde daha hızlı bir spontan vuruş hızına ve daha kısa aksiyon potansiyeli süresine veya APD80'e sahip olduğunu göstermiştir. APD80 gibi parametreler için tüm plaka ısı haritaları, belirli bir parametrenin bir plaka içinde tekrarlanabilirliğini ortaya çıkardı. Olgun hiPSC-CM monokatmanlarının tipik aksiyon potansiyelleri, izole edilmiş ve test edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli morfolojisini göstermiştir.Tipik bir aksiyon potansiyeli spontan ritim de görüntülendi. İzoproterenol'e yanıt olarak, beta-1-adrenerjik reseptörlerin aktivasyonu pozitif kronotropi, pozitif inotropi ve pozitif lusitropiye neden oldu. İnsan Ether-a-go-go ile ilişkili gen veya hERG, E-4031, domperidon, vandetanib ve sotalol dahil olmak üzere kanal blokerine HiPSC-CM yanıtı, ritmi izlemek için GCaMP6m kalsiyum floresansı kullanılarak incelenmiştir.Çalışma, E-4031 hERG kanal blokajının neden olduğu erken depolarizasyonların tespitini göstermiştir. Süspansiyondaki hücrelerle hızlı çalışın ve hücreleri nazikçe pipetleyerek kayma stresini önleyin. Ek olarak, hiPS sinsitisine zarar vermemek için ortam değişimini dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.Bu prosedürü takiben, hücreler araştırmacıların en sevdiği teknikle analiz için protein, RNA, DNA ve lipit toplanması için uygundur. Bu teknik, araştırmacıları hastalıkları araştırmak ve yetişkin benzeri kardiyomiyositler kullanarak yeni ilaçların kardiyotoksisitesini test etmek için güçlendirir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...