Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende VALA-videnskaberne for Cyteseer-softwarepakken og optimering af den automatiserede 3D-calciumanalyse. Vi ønsker at anerkende tilskud fra PLN Foundation (RM). P.A.D. og F.S. støttes af CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. støttes af H2020-EVICARE (#725229) fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC). J.W.B. støttes af UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship og CVON-Dosis young talent grant; Nederlandske Heart Foundation (CVON-Dosis 2014-40). N.C. støttes af gravitationsprogrammet "Materials Driven Regeneration" af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (RegmedXB #024.003.013) og Marie Skłodowska-Curie-aktionerne (tilskudsaftale RESCUE #801540). V.S.-P. støttes af Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. er støttet af det EU-finansierede projekt BRAVE (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Opdagelse af hjertemedicin hæmmes af en afhængighed af ikke-menneskelige dyre- og cellulære modeller med utilstrækkelig gennemstrømning og fysiologisk troskab til nøjagtigt at udføre aflæsninger. hiPSC-CM-biologi kombineret med HT-instrumentering og fysiologiske sonder har potentialet til at genindføre humane modeller i de tidligste stadier af hjertesygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse. Vi udviklede en 3D-metode til generering af hjertevæv, der producerer funktionelle CS'er af høj kvalitet til en optimal hjertesygdomsmodellering og lægemiddelscreeningsplatform. Derudover giver kombinationen af sfæroidteknologien i 3D-bioreaktorsystemer til industriel EV-produktion mulighed for et nødvendigt skridt mod klinisk oversættelse af EV-baseret terapi. Metoden beskrevet her er afhængig af flere afgørende faktorer og er en variant af eksisterende protokoller 9,10,28,29. Disse metoder omfatter: 1) generering af 3D-vævskonstruktioner, 2) det optimale celleantal og timing før screeningen, 3) forbedring af instrumenternes følsomhed og høje gennemstrømningskapacitet og 4) at kunne fryse sfæroiderne før enhver funktionel analyse. I modsætning til tidligere beskrevne protokoller beskriver den foreslåede protokol generering af op til 1.500 sfæroider om dagen og egnetheden til HTS. Konventionel analyse af hundrede forbindelser over 6 x 0,5 logdoser til 10 replikater ved hjælp af eksisterende 96-brønds calciumbilleddannelsessystemer eller 24-godt multiplekset konstrueret hjertevæv kræver ca. 500 millioner til 3 milliarder hiPSC-CM'er31,32. Den foreslåede anvendelse gør hjertescreeninger billigere og tidseffektive sammenlignet med de konventionelle systemer, da pladerne med 96 brønde kun krævede 10% af såtætheden sammenlignet med den beskrevne metode. Sammenlignet med tidligere protokoller, såsom hængedråbemetoden, muliggør genereringen af sfæroider ved selvaggregering i ultralave fastgørelsesplader desuden automatiseret billeddannelse af enkelt mikrovæv af høj kvalitet33.
Denne lille 3D-model efterligner den biologiske og fysiologiske fænotype i in vivo kardiovaskulært miljø. Som tidligere påvist øges calciumtransienter dramatisk i 3D-hjertevævskonstruktioner sammenlignet med 2D-enkeltlagscellekulturer34.
Dernæst fandt vi, at såtætheden og korrekt dyrkningstid også er kritiske faktorer for en vellykket CS-screening. Tætheden af 10K-20K hiPSC-CM'er pr. sfæroid og screening mellem uge 2-3 efter generation var optimal, mens for små eller for gamle sfæroider viser forstyrret calciumhåndtering (figur 2 og figur 3). Derfor er det vigtigt at opretholde såtætheder så konsistente som muligt, da størrelsen påvirker de funktionelle parametre. Selvom denne optiske metode giver gode resultater for levende 3D-kulturer som et helt væv, er det udfordrende at indhente data inden for større sfæroider på (sub-) cellulært niveau uden at stole på tidskrævende histologimetoder. For nylig er der offentliggjort flere tilgange, der brugte "optisk clearing", som muliggør erhvervelse af hele 3D-sfæroider med mulighed for enkeltcellekvantificering af markører. Her tilpassede vi en 3-dages protokol fra CS-høst til billedanalyse, som er optimeret til 3D-billeddannelse ved hjælp af konfokalmikroskopi29 (figur 1C og figur 4D).
Endelig, med stigningen i 3D-hjertevævsapplikationer og kommercielle applikationer, stiger efterspørgslen efter langtidsopbevaring og patientspecifik biobank fra forskellige donorer. Kryopræservering er en effektiv strategi til at generere HTS-plader fra flere batcher over tid. Frysning af hiPSC-CM'er er beskrevet tidligere og adskiller sig ikke fra andre dyrkede celletyper 10,35,36. For nylig er tilgange til frysning af plader med 2D-celler blevet beskrevet37. Her fandt vi, at PSC-kryopræserveringssættet er den mest optimale tilstand sammenlignet med tre andre (data ikke vist) og brugte dette medium til effektiv frysning af sfæroider. Efter kryopræservering forbliver levedygtigheden høj (figur 4B, C), men CS'ernes elektrofysiologiske egenskaber påvirkes, og der kræves en inkubationsperiode efter optøning. Faktisk viste CS'er 1 uge efter optøning spontan slagaktivitet og calciumhåndtering. Det er imidlertid blevet beskrevet, at friske og genvundne hiPSC-CM'er ikke altid udviser identiske molekylære og fysiologiske egenskaber38. Denne begrænsning skal overvejes, når kryopræserverede hiPSC-CM'er anvendes til vurdering af lægemiddelinducerede hjerteaflæsninger. Selvom vi effektivt modulerer antallet af celler pr. sfæroid og den optimale timing af calciumtransient billeddannelse, kunne hjertesfæroiderne forbedres ved at blande hiPSC-afledte kardiomyocytceller med endotelceller, fibroblaster, cellecellekrydsninger og ekstracellulære matricer, såsom chitosan, kollagen IV, fibronectin, matrigel eller laminin, der efterligner in vivo-hjertemiljøet 39, 40. Samlet set foreslår vi en trinvis protokol til effektivt at generere CS'er, der er egnede til downstream-applikationer såsom sygdomsmodellering og HT-lægemiddelscreening.

Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er) gav hidtil usete muligheder for at studere menneskelig udvikling og sygdom på celleniveau. I løbet af det sidste årti er der ved hjælp af udviklingslektioner etableret forskellige protokoller for at sikre effektiv differentiering af hiPSC'er i kardiomyocytter (CM'er)1,2,3,4. hiPSC-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) kan tjene som en ressource til modellering af genetisk arvelige hjerte-kar-sygdomme (CVD'er), test af hjertesikkerhed for nye lægemidler og hjerteregenerative strategier 5,6,7,8. På trods af den rettede hjertedifferentiering af hiPSC'er forbliver ubestemte CM-numre en udfordring inden for hjerteområdet, da modne hiPSC-CM'er generelt er ikke-proliferative, og primære humane celler ikke er tilgængelige i store mængder.
For nylig beskrev vi, at samtidig Wnt-signalaktivering med kultur med lav celletæthed resulterede i et massivt proliferativt respons (op til 250 gange) af hiPSC-CM'er 9,10. Denne omkostningseffektive strategi for massiv udvidelse af hiPSC-CM'er via seriel passaging i kulturkolbeformat letter standardisering og kvalitetskontrol af et stort antal funktionelle hiPSC-CM'er. For at holde trit med efterspørgslen efter store partier hiPSC-CM'er fra forskellige donorer er biobanking af hiPSC-CM'er desuden blevet beskrevet10. Imidlertid er kardiomyocytmonolag, der er podet i disse standardkulturretter, ikke repræsentative for den komplekse 3D-struktur, der findes i hjertet. Desuden er hiPSC-CM'ernes umodenhed forblevet en hindring og har således ikke efterlignet den biologiske og fysiologiske fænotype i in vivo-kardiovaskulærmiljøet.
Nye 3D in vitro-modeller er blevet udviklet, hvor hiPSC-CM'er viser tættere fysiologisk adfærd såsom selvorganisering 11,12, ekstracellulær matrix (ECM) remodellering 13, forbedret modning 14,15,16 og synkroniseret sammentrækning17,18,19 . 3D-modeller er blevet brugt til lægemiddelopdagelse, test af lægemiddelkardiotoksicitet, sygdomsmodellering, regenerative terapier og endda de første kliniske forsøg 20,21,22,23,24. En af de mest anvendte modeller er det fibrinbaserede konstruerede hjertevæv (EHT), som udviser et vævslignende arrangement og hjertekontraktilitet13,17,25. Tidligere viste vi, at EHT'er genereret fra udvidede hiPSC-CM'er viste sammenlignelig kontraktilitet med dem fra uudvidede hiPSC-CM'er, hvilket demonstrerede kompromisløs cellulær funktionalitet efter ekspansion9. Selv om genereringen af EHT'er fra hiPSC-CM'er er veletableret, forventes der ikke desto mindre yderligere udvikling med hensyn til oprettelsen af en HT-vurderingsplatform. Her muliggør den hurtige generering af et stort antal selvaggregerende hjertesfæroider (CS'er) i 96-brøndformat en forbedring af 3D-betingelserne til HTS-formål (high-throughput screening).
Samlet set er fordelen ved CS'er som 3D-cellekultur deres høje reproducerbarhed og skalerbarhed. Især kan CS'er kombineret med robotprøvehåndtering standardisere og automatisere CS-kultur, lægemiddelbehandling og analyse af højt indhold20. Her beskriver vi optimerede protokoller til generering af CS'er af høj renhed og høj kvalitet, som effektivt kan kryopræserveres og screenes for hjertefunktion ved at udføre Ca2+ forbigående målinger ved hjælp af et optisk calciumoptagelses- og analysesystem. Denne model giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til at udføre skærme med høj kapacitet på hundreder til tusinder af sfæroider17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Human-induceret pluripotent stamcelle-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er af afgørende betydning for human hjertesygdom modellering og terapi. Vi offentliggjorde for nylig en omkostningseffektiv strategi for den massive udvidelse af hiPSC-CM'er i to dimensioner (2D). To store begrænsninger er celle umodenhed og mangel på tredimensionelt (3D) arrangement og skalerbarhed i high-throughput screening (HTS) platforme. For at overvinde disse begrænsninger udgør de udvidede kardiomyocytter en ideel cellekilde til generering af 3D-hjertecellekultur og vævstekniske teknikker. Sidstnævnte har et stort potentiale på det kardiovaskulære område og giver mere avanceret og fysiologisk relevant HTS. Her beskriver vi en HTS-kompatibel arbejdsgang med nem skalerbarhed til generering, vedligeholdelse og optisk analyse af hjertesfæroider (CS'er) i et 96-brøndsformat. Disse små CS'er er afgørende for at udfylde hullet i nuværende in vitro-sygdomsmodeller og / eller generering til 3D-vævstekniske platforme. CS'erne præsenterer en meget struktureret morfologi, størrelse og cellulær sammensætning. Desuden viser hiPSC-CM'er, der dyrkes som CS'er, øget modning og flere funktionelle træk ved det menneskelige hjerte, såsom spontan calciumhåndtering og kontraktil aktivitet. Ved automatisering af hele arbejdsgangen, fra generering af CS'er til funktionel analyse, øger vi intra- og interbatchreproducerbarheden som demonstreret ved high-throughput (HT) billeddannelse og calciumhåndteringsanalyse. Den beskrevne protokol muliggør modellering af hjertesygdomme og vurdering af lægemiddel/terapeutiske virkninger på enkeltcelleniveau i et komplekst 3D-cellemiljø i en fuldautomatisk HTS-arbejdsgang. Derudover beskriver undersøgelsen en enkel procedure til langsigtet konservering og biobanking af helsfæroider, hvilket giver forskere mulighed for at skabe næste generations funktionelle vævsopbevaring. HTS kombineret med langtidsopbevaring vil bidrage væsentligt til translationel forskning på en lang række områder, herunder lægemiddelopdagelse og testning, regenerativ medicin og udvikling af personaliserede terapier.

Protokollen vist i figur 1A beskriver genereringen af CS'er fra tidligere udvidede hiPSC-CM'er. CS'erne får en 3D-struktur på dag 1 efter såning i ultralave fastgørelsesplader med rundbund og kan dyrkes i op til 6 uger (figur 1B). Som vurderet ved immunofluorescensfarvning udtrykte størstedelen af cellerne i 3 uger gamle CS'er sarkomeriske proteiner såsom α-actinin og troponin T og viste regelmæssig sarkomerorganisation (figur 1C). Til kvantificering af α-actininpositive celler blev flowcytometrianalyse udført. I overensstemmelse med immunofluorescensresultaterne viste flowcytometridataene sammenlignelige høje niveauer af α-actinin i både dag 0 (76,9% ± 16,6%) og 3 uger gamle CS'er (71,1% ± 22,7%) (figur 1D), hvilket indikerer en konstant og meget ren cellulær sammensætning under dyrkning. Der var en øget ekspression af hjertegenerne for kryds (GJA1, JPH2 og PKP2), desmosomer (DES) og mitokondrier (ATP5A) i hiPSC-CM-afledte sfæroider (dag 42) versus hiPSC-CM'er dyrket i 2D i 90 dage (figur 1E). Ekspressionen af disse gener er et kendetegn ved celle-celle interaktion og modning30.
Derefter blev CS'ernes funktionelle egenskaber, nemlig slaghastighed og Ca2+-håndtering, vurderet på forskellige tidspunkter (figur 2). Calciumtransiente parametre såsom stigningstid, spidsbelastningstid, henfaldstid og calciumtransient varighed (CTD90) blev evalueret som angivet i figur 2A,B. Procentdelen af at slå CS'er er den samme i de første 3 uger efter generationen, men faldt signifikant i uge 6 (Wk6) CS'er (figur 2C). Slagfrekvensen blev signifikant reduceret ved Wk3 sammenlignet med Wk1 og, svarende til procentdelen af slag-CS'er, faldt dramatisk ved Wk6 (figur 2D). Ved Wk6 blev CS-forringelse observeret, hvilket kan forklare faldet i både slagfrekvensen og antallet af slag-CS'er. Måling af calciumtransiente parametre indikerede en signifikant højere topværdi ved Wk2 (figur 2E), mens stigningstid, henfaldstid og CTD90 blev signifikant øget ved Wk3 sammenlignet med Wk1 (figur 2F-H ). Samlet set viser disse resultater, at hiPSC-CM-afledte sfæroider er funktionelt optimale omkring uge 2 og 3 efter generation.
Figur 3 viser effekten af sfærisk størrelse på slagfrekvensen og calciumhåndteringen. CS'er blev genereret ved såning af 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 og 20 x 10 4 hiPSC-CM'er i en brønd på en 96-brøndplade til i alt 24 CS'er / brønde pr. Tilstand (figur 3A). Som forventet steg sfæroidstørrelsen, da antallet af anvendte celler steg, fra 178 ± 36 μm til 351 ± 65 μm (figur 3A, højre panel). Ca2+ transienter blev målt i 3 uger gamle CS'er ved de fire forskellige såtætheder (figur 3B). Målinger af at slå CS'er viste, at kun ca. 50% af de mindre størrelse-CS'er (2.5K- og 5K-CS'er) slog, mens procentdelen af større størrelsesbankende CS'er (10K- og 20K-CS'er) var signifikant højere (ca. 85%) (figur 3C). En lignende slaghastighed (ca. 28 bpm) blev vist ved 5K-, 10K- og 20K-CS'er, hvilket var signifikant højere sammenlignet med 2.5K-CS'er (figur 3D). Topværdierne for calciumbilleder var ens under alle testede forhold (figur 3E), men stigningstiden (figur 3F), henfaldstiden (figur 3G) og CTD90 (figur 3H) blev signifikant øget i større størrelses-CS'er (10K- og 20K-CS'er) sammenlignet med de mindre (2,5K- og 5K-CS'er). Samlet set viser disse resultater, at hiPSC-CM-afledte sfæroider er optimale til screening af calciumhåndtering, når der anvendes en såtæthed mellem 10K- og 20K hiPSC-CM'er / brønd.
Dernæst evaluerede vi kryopræserveringens indvirkning på CS' levedygtighed og funktion. Før analysen blev optøede CS'er opretholdt i kultur i 1 uge (figur 4A). Som det fremgår af både flowcytometri (figur 4B) og Calcein-AM (figur 4C) cellelevedygtighedstest, påvirkede kryopræservering ikke cellelevedygtigheden inden for CS'erne. Derudover viste optøede CS'er lignende ekspressionsniveauer af sarkomeriske proteiner sammenlignet med de friske aldersmatchede CS'er (figur 4D). Disse data indikerer, at CS'er effektivt kan kryopræserveres til efterfølgende hjertefunktionsanalyse og screening med høj kapacitet.
Endelig blev slagaktiviteten og Ca2+-håndteringen målt i både friske og kryopræserverede CS'er (figur 5). Procentdelen af at slå CS'er blev målt på forskellige tidspunkter efter optøning henholdsvis ved 2, 5 og 7 dage. Mens de fleste af de friske CS'er viste slagaktivitet over tid, havde de kryopræserverede CS'er tydeligvis brug for op til 1 uges dyrkning for at genvinde deres slagaktivitet (figur 5B). Der var ingen signifikant ændring i slåraten for optøede CS'er versus friske; Der blev imidlertid ikke observeret nogen spontan slagaktivitet i nogle frosne CS'er (figur 5C). Selv om topværdierne blev signifikant reduceret i frosne/optøede CS'er sammenlignet med friske (figur 5D), blev der ikke observeret signifikante ændringer i stigningstid, henfaldstid og CTD90 for frosne/optøede CS'er sammenlignet med friske CS'er (figur 5E-G). Disse data indikerer, at det efter optøning er vigtigt at lade CS'erne komme sig i inkubatoren i mindst 1 uge, før de måler slagaktivitet og Ca2+ forbigående.
Samlet set viser disse resultater, at kryopræservering af hiPSC-CM-afledte sfæroider bevarer kardiomyocytlevedygtigheden, den sarkomeriske struktur og deres funktionelle egenskaber såsom spontan slagaktivitet og calciumhåndtering. Således repræsenterer hiPSC-CM-afledte sfæroider en passende model til nøjagtigt at rekapitulere hjerteelektrofysiologi in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figur 1: Generering af hjertesfæroider . (A) Skematisk repræsentation af Wnt-baseret rettet hjertedifferentiering, den efterfølgende udvidelse af hiPSC-CM'er og generering af CS'er. Oprettet med biorender.com. (B) Bright-field billeder på forskellige tidspunkter af CS dyrkning. Vægtstang, 200 μm. Wk repræsenterer uge. C) Repræsentative immunfluorescensbilleder for hjertesarkomeriske proteiner α-actinin og troponin T i 3 uger gamle CS'er. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-actinin (grøn) og troponin T (rød). Vægtstang, 200 μm. Det zoomede flettede billede til højre viser sarkomerorganisationen. Skalabjælke, 50 μm. (D) Flowcytometrikvantificering af α-actinin-positive celler før (dag 0) og 3 uger efter dannelsen af CS'er. (n = 14-23 pr. Tilstand. E) RT-qPCR udført på hiPSC-CM'er dyrket i 90 dage (2D) og sfæroidprøver dyrket i 42 dage for at fastslå ekspressionsniveauer af forskellige hjertegener relateret til cellekryds, mellemliggende filamenter og mitokondrier. (n = 1-3 partier). Data repræsenteres som gennemsnit ± SD. NS (ikke-signifikant) beregnet ved en uparret t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figur 2: Slaghastighed og calciumhåndtering i CS'er i forskellige uger efter generering. (A) Eksempler på calciumtransiente parametre beregnet af Vala sciences-analysealgoritmen i Cyteseer Software. B) Repræsentative calciumtransientspor og timelapse-billeder af CS'erne på forskellige tidspunkter (uger) efter generationen. Skalabjælke, 200 μm. (C) Tidsforløbskvantificering af spontan slagaktivitet udtrykkes som procentdelen af slag-CS'er. (D) Slagfrekvens for CS'er i dyrkningstiden. (E-H) Kvantificering af calciumtransienterne, der viser topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90. De viste data er gennemsnitlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = henholdsvis 38, 50, 66 og 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser; CTD = calcium forbigående varighed, Wk = uge, CS'er = humane hjertesfæroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figur 3: Slaghastighed og calciumhåndtering i CS'er genereret ved hjælp af forskellige cellesåningstætheder. (A) Bright-field imaging (venstre) og størrelsesmålinger (højre) af CS'er genereret ved hjælp af forskellige antal hiPSC-CM'er. Skalabjælke, 200 μm. (B) Repræsentative calciumtransientspor og time-lapse-billeder af 2,5K-20K-CS'erne. (C,D) Slå procent og slå sats på 2.5K-20K-CS'er. (E-H) Topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90 i 2.5K-20K-CS'er. Data er gennemsnitlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser: CTD = calcium transient varighed, Wk = uge, k = x 1.000 celler, CS'er = hjertesfæroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Figur 4. Effekt af kryopræservering på hjertesfæroiders levedygtighed og struktur. (A) Skematisk repræsentation af CS-generering, efterfølgende biobank og optøning. (B) Flowcytometricellelevedygtighedstest i både friske og kryopræserverede CS'er. Som en positiv kontrol blev der anvendt en behandling med 10% Triton-X opløsning i 5 min. (n = 4 pr. betingelse). Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD. ** **p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. (C) Calcein-AM-cellelevedygtighedstest i friske versus optøede CS'er efter 7 dages dyrkning (n = 15-17 pr. tilstand, *** *p < 0,001, ved parret t-test; skalastang, 200 μm). D) Repræsentativ bright-field (venstre) og immunofluorescensfarvning for α-actinin og troponin T-ekspression i friske og optøede CS'er. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-actinin (grøn) og troponin T (rød). De flettede billeder til højre viser sarkomerstriber i CS'erne. Skalabjælke, 50 μm. Forkortelser: X = optøningsdag efter eget valg, PI = propidiumiodid, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figur 5: Calciumtransienter i friske versus optøede CS'er. (A) Repræsentative calciumtransientspor og timelapse-billeder af CS'erne før kryopræservering og 1 uge efter optøning. (B) Slagprocent af friske og frosne/optøede hjertesfæroider. Søjler repræsenterer individuelle eksperimenter. (C) Slagrate for friske og frosne/optøede hjertesfæroider. (D-G) Kvantificering af calciumtransiente parametre: topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90. Data er gennemsnitlige ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser; CTD = calcium forbigående varighed, CS'er = hjertesfæroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Repræsentative gatingstrategier til flowcytometrianalyse. (A) Repræsentativ gating-strategi for α-actininpositive hiPSC-CM'er i en ren population versus negativ kontrol og isotypekontrol. Antallet af α-actinin-positive analyserede celler er 25 x 105. Forkortelser; SSC = sidespredning, PI+ = propidiumiodid positiv. (B) Repræsentativ gating-strategi for rentabilitetsanalysen i både frisk, optøet, positiv kontrol (Triton-X) og negativ kontrol (ufarvet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Præsenteret her er et sæt protokoller til generering og kryopræservering af hjertesfæroider (CS'er) fra menneskeinducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter dyrket i et multidimensionelt format med høj kapacitet. Denne tredimensionelle model fungerer som en robust platform til sygdomsmodellering, screeninger med høj kapacitet og opretholder sin funktionalitet efter kryopræservering.

Generering, high-throughput screening og biobanking af menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte hjertesfæroider

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Denne protokol beskriver en arbejdsgang til generering, vedligeholdelse og optisk analyse af hjertesfæroider. Disse hjertesfæroider er afgørende for at udfylde hullet i nuværende in vitro sygdomsmodeller. Denne teknik giver forskere mulighed for at skabe næste generation, high-throughput screening og funktionel opbevaring af hjertesfæroider.Begynd med at tilføje en milliliter pr. Centimeter kvadrat steril hjerteløsrivelsesopløsning til hver brønd i en kulturplade, der indeholder sammenflydende menneskeinducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Bekræft frigørelsen af celler ved at observere hvide og rundformede celler under 4x forstørrelse af et lysfeltmikroskop.Brug en fem-milliliter pipette til mekanisk at adskille cellerne ved at skylle dem med to ml varmt basalmedium for at forberede en enkelt cellesuspension. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør, og centrifuger i tre minutter ved 300 g. Derefter aspireres supernatanten, og cellerne resuspenderes i en milliliter hiPSC-CM-genbelægningsmedier.Brug en pipettespids på 1.000 mikroliter til at adskille cellepelleten. Efter tre eller fire blandinger, da opløsningen ser homogen ud, lægges den i en kassette for at tælle cellerne og overføres den passende mængde celler i 100 mikroliter genbelægningsmedium til hver brønd i en ultra-lav fastgørelse, rundbundet, 96-brøndplade. Placer hjertesfæroidpladen på en orbitalryster i inkubatoren ved 70 o / min med en temperatur på 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, 21% ilt og 90% fugtighed i 24 timer.For at undgå sfærisk brud skal du kun aspirere 50 mikroliter medium fra hver brønd og tilføje 100 mikroliter RPMI plus B27 medium pr. Brønd i de første 48 timer. Derefter aspireres 100 mikroliter af mediet fra hver brønd, og der tilsættes 100 mikroliter modningsmedium pr. Brønd. Bevar cellerne i modningsmediet, og opdater mediet hver anden til tredje dag.Læg kuglepladen på is i 10 minutter til forkøling, inden pladen centrifugeres i tre minutter ved 70 g. Fjern mediet, indtil 50 mikroliter forbliver i brønden. Derefter tilsættes 200 mikroliter iskold hiPSC-frysemedium pr. Brønd.Forsegl pladen med en pladeforseglingsfilm. For at forberede siliciumformen blandes komponenterne i siliceroselastomersættet i forholdet 10 til 1, og opløsningen tilsættes inde i den nederste del af brøndpladen. De-boble opløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe i 15 til 20 minutter.Placer formen i en ovn, og hærd den ved 60 grader Celsius i otte timer for at opnå en halvfleksibel elastomer, der skrælles af pladen. Anbring den forseglede plade forsigtigt i en silikoneform, hvilket sikrer ensartet varmeudveksling mellem brøndpladen og fryseren. Frys pladen ved 80 grader Celsius i mindst fire timer i den forberedte silikoneform, inden pladen overføres til en flydende nitrogentank eller en 150 grader Celsius fryser til langtidsopbevaring.For at sikre en hurtig optøning af hjertesfæroider skal du samle en celleplade med hjertesfæroider ad gangen fra det flydende nitrogen og placere det i inkubatoren i 15 minutter ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, 21% ilt og 90% fugtighed. Fjern tætningsfilmen fra pladen, og aspirer 150 mikroliter af hver brønd, inden der tilsættes 200 mikroliter af et varmt basalmedium til hver brønd. Centrifuger pladen ved 70 g i tre minutter, og gentag den varme basale mediumvask.Når du er færdig, fjern 150 mikroliter af mediet, og tilsæt 200 mikroliter kardiomyocytter, der tøer medium op i hver brønd. Gentag derefter RPMI-vasken som nævnt under hjertesfæroidgenerering, efterfulgt af opretholdelse af cellerne i modningsmediet. Efter en uges kultur er de optøede hjertesfæroider optimale til calciumhåndtering optisk billeddannelse.Aspirer 150 mikroliter af hver brønd. Behandl de optøede hjertesfæroider med 100 mikroliter Cal-520 AM calciumfarvemedium pr. Brønd under mørke forhold, og inkuber pladen i 60 minutter. Forbered et calciumopkøbs- og analysesystem ved at tænde mikroskopet og sikre, at miljøkontrolindstillingen er tændt.Juster kameraets og indramningens blændedimensioner for at minimere baggrundsområdet. For at måle calciumsignalet ved hjælp af en 488-nanometer laser skal du indstille kontrasten til en sort baggrund med et lysegrønt signal under calciumfrigivelse. Optag en video med en ensartet strøm på 2 til 10 toppe inden for 10 sekunder.Optag en 10-sekunders video, og scan hen over 96-brøndpladen, først bevæger du dig til venstre og derefter nedad på en zigzag-måde for at dække hele pladen. Efter at have erhvervet calciumtransienterne, skal du analysere dataene ved hjælp af fluorescenssporanalysesoftware. Hjertesfæroiderne erhvervede en 3D-struktur ved dag et efter såning, som kunne dyrkes i op til seks uger.Størstedelen af tre uger gamle hjertesfæroider udtrykte regelmæssig sarkomerorganisering med alfa-actinin og troponin T.Høje niveauer af alfa-actinin på dag nul og tre uger gamle hjertesfæroider indikerede en konstant og meget ren cellulær sammensætning under dyrkning. En øget ekspression af hjertegener, desmosomer og mitokondrier blev observeret i sfæroider end hiPSC-CM'er dyrket i 2D i 90 dage. Slåprocenten af hjertesfæroider var den samme i de første tre uger efter generationen og faldt markant i uge seks på grund af forringelse af hjertesfæroider.Slagfrekvensen blev signifikant reduceret i uge tre sammenlignet med og faldt i uge seks som følge af forværring. Calciumtransiente parametre indikerede en højere topværdi i uge to, mens stigningstiden, henfaldstiden og calciumtransientvarigheden ved 90 % af henfaldet blev signifikant øget i uge tre, hvilket viser, at hiPSC-CM-afledte sfæroider var funktionelt optimale i uge to og tre efter generation. Den sfæroide størrelse steg med antallet af celler, der blev brugt til såning.I større størrelse, gamle sfæroider, var slagene betydeligt højere. En lignende og signifikant højere slaghastighed blev vist ved 5k, 10k og 20k sfæroider sammenlignet med 2.5k sfæroider. Kryopræservering påvirkede ikke cellelevedygtigheden i hjertesfæroiderne.Lignende ekspression af sarkomeriske proteiner i de optøede og friske aldersmatchede sfæroider indikerede kryopræserveringseffektivitet. Der var ingen signifikant ændring i slagfrekvensen for optøede eller friske hjertesfæroider. Der blev ikke observeret signifikante ændringer i stigningstid, henfaldstid og CTD90 af optøet eller frisk CS. Ved siden af sygdomsmodellering og lægemiddelscreeninger med høj kapacitet kan disse sfæroider også anvendes til bioreaktorer af ekstracellulær vesikelproduktion og ekstracellulære vesikelrelaterede terapier.Biobanken af disse sfæroider kan også bruges som en ny kardiomyocytforsyning til regenerative strategier. Akkumulerende beviser tyder på, at biobanker af patientafledte stamcellemodeller for cystisk fibrose, kræft og hjertesfæroider har stort potentiale for at optrævle molekylære mekanismer til lægemiddelscreeninger og til personlig medicin.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for Højkapacitetsforskning Antifungisk Drug Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injicerbare regenerativ terapi og høj overførselshastighed stof Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidet differentiering af modne nyre podocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller under kemisk definerede forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Mikrofluidisk fremstilling af kerneskalmikrokapsler, der bærer humane pluripotente stamcellesfæroider

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen nyre glomerulus chip konstrueret fra humaninducerede pluripotente stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluering af hjertekontraktilitetsmodulationsterapi i 2D humane stamcelleafledte kardiomyocytter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...