Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

We willen graag VALA-wetenschappen erkennen voor het Cyteseer-softwarepakket en de optimalisatie van de geautomatiseerde 3D-calciumanalyse. We willen de subsidiesteun van de stichting PLN (RM) erkennen. P.A.D. en F.S. worden ondersteund door CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. wordt ondersteund door H2020-EVICARE (#725229) van de European Research Council (ERC). J.W.B. wordt ondersteund door het UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship en CVON-Dosis young talent grant; Hartstichting Nederland (CVON-Dosis 2014-40). N.C. wordt ondersteund door het Zwaartekrachtprogramma "Materials Driven Regeneration" van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (RegmedXB #024.003.013) en de Marie Skłodowska-Curie Acties (Subsidieovereenkomst RESCUE #801540). V.S.-P. wordt ondersteund door het Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. wordt ondersteund door het door de EU gefinancierde project BRAVE (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontdekking van cardiale geneesmiddelen wordt belemmerd door een afhankelijkheid van niet-menselijke dierlijke en cellulaire modellen met onvoldoende doorvoer en fysiologische betrouwbaarheid om nauwkeurig uitlezingen uit te voeren. hiPSC-CM-biologie in combinatie met HT-instrumentatie en fysiologische sondes heeft het potentieel om menselijke modellen opnieuw te introduceren in de vroegste stadia van hartziektemodellering en medicijnontdekking. We hebben een 3D-methode voor het genereren van hartweefsel ontwikkeld die hoogwaardige en functionele CS's produceert voor een optimaal platform voor het modelleren van hartziekten en het screenen van geneesmiddelen. Bovendien maakt het combineren van de sferoïde technologie in 3D-bioreactorsystemen voor industriële EV-productie een noodzakelijke stap mogelijk in de richting van de klinische vertaling van EV-gebaseerde therapie. De hier beschreven methode is gebaseerd op verschillende cruciale factoren en is een variant van bestaande protocollen 9,10,28,29. Deze methoden omvatten: 1) het genereren van 3D-weefselconstructies, 2) het optimale celnummer en de timing vóór de screening, 3) het verbeteren van de gevoeligheid en hoge doorvoercapaciteit van instrumenten, en 4) het kunnen bevriezen van de sferoïden vóór elke functionele analyse. In tegenstelling tot eerder beschreven protocollen, beschrijft het voorgestelde protocol de generatie van maximaal 1.500 sferoïden per dag en de geschiktheid voor HTS. Conventionele analyse van honderd verbindingen over 6 x 0,5 logdoses voor 10 replicaties met behulp van bestaande 96-well calciumbeeldvormingssystemen of 24-well multiplexed engineered hartweefsels vereisen ongeveer 500 miljoen tot 3 miljard hiPSC-CMs31,32. De voorgestelde toepassing maakt hartscreenings minder duur en tijdeffectief in vergelijking met de conventionele systemen, omdat de 96-putplaten slechts 10% van de zaaidichtheid nodig hadden in vergelijking met de beschreven methode. Bovendien maakt het genereren van sferoïden door zelfaggregatie in ultralage bevestigingsplaten, in vergelijking met eerdere protocollen, zoals de hanging-drop-methode, hoogwaardige geautomatiseerde beeldvorming van afzonderlijke microtissues mogelijk33.
Dit kleine 3D-model bootst het biologische en fysiologische fenotype van de in vivo cardiovasculaire omgeving na. Zoals eerder aangetoond, nemen calciumtransiënten dramatisch toe in 3D-hartweefselconstructies in vergelijking met 2D-monolaagse celculturen34.
Vervolgens ontdekten we dat de zaaidichtheid en de juiste kweektijd ook kritische factoren zijn voor een succesvolle CS-screening. De dichtheden van 10K-20K hiPSC-CMs per sferoïde en screening tussen week 2-3 na generatie waren optimaal, terwijl te kleine of te oude sferoïden een verstoorde calciumbehandeling vertonen (figuur 2 en figuur 3). Daarom is het van belang om de zaaidichtheden zo consistent mogelijk te houden, omdat de grootte de functionele parameters beïnvloedt. Hoewel deze optische methode goede resultaten oplevert voor levende 3D-culturen als geheel weefsel, is het verkrijgen van gegevens binnen grotere sferoïden op (sub-)cellulair niveau een uitdaging zonder te vertrouwen op tijdrovende histologische methoden. Onlangs zijn verschillende benaderingen gepubliceerd die "optisch clearing" gebruiken, wat de verwerving van hele 3D-sferoïden mogelijk maakt met de mogelijkheid voor eencellige kwantificering van markers. Hier hebben we een 3-daags protocol aangepast van CS-oogst naar beeldanalyse, dat is geoptimaliseerd voor 3D-beeldvorming met behulp van confocale microscopie29 (figuur 1C en figuur 4D).
Ten slotte, met de toename van 3D-hartweefseltoepassingen en commerciële toepassingen, stijgt de vraag naar langdurige opslag en patiëntspecifieke biobanking van verschillende donoren. Cryopreservatie is een effectieve strategie om HTS-platen te genereren uit meerdere batches in de loop van de tijd. Het invriezen van hiPSC-CMs is eerder beschreven en verschilt niet van andere gekweekte celtypen 10,35,36. Onlangs zijn benaderingen voor het bevriezen van platen met 2D-cellen beschreven37. Hier vonden we dat de PSC-cryopreservatiekit de meest optimale conditie is in vergelijking met drie andere (gegevens niet getoond) en gebruikten we dit medium voor het efficiënt invriezen van sferoïden. Na cryopreservatie blijft de levensvatbaarheid hoog (figuur 4B,C), maar de elektrofysiologische eigenschappen van CSs worden aangetast en een periode van incubatie na ontdooien is vereist. Inderdaad, 1 week na het ontdooien vertoonden CSs spontane klopactiviteit en calciumbehandeling. Er is echter beschreven dat verse en teruggewonnen hiPSC-CM's niet altijd identieke moleculaire en fysiologische eigenschappen vertonen38. Met deze beperking moet rekening worden gehouden wanneer gecryopreserveerde hiPSC-CM's worden gebruikt voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde cardiale uitlezingen. Bovendien, hoewel we het aantal cellen per sferoïde en de optimale timing van de calciumtransiënte beeldvorming effectief moduleren, kunnen de cardiale sferoïden worden verbeterd door hiPSC-afgeleide cardiomyocytcellen te mengen met endotheelcellen, fibroblasten, celcelverbindingen en extracellulaire matrices, zoals chitosan, collageen IV, fibronectine, matrigel of laminine, waarbij de in vivo cardiale omgeving wordt nagebootst39, 40. Over het algemeen stellen we een stapsgewijs protocol voor om efficiënt CS'en te genereren die geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals ziektemodellering en HT-medicijnscreening.

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) bood ongekende mogelijkheden om de menselijke ontwikkeling en ziekte op cellulair niveau te bestuderen. In het afgelopen decennium zijn met behulp van ontwikkelingslessen verschillende protocollen opgesteld om de efficiënte differentiatie van hiPSC's in cardiomyocyten (CMs)1,2,3,4 te waarborgen. hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) kunnen dienen als een hulpmiddel voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's), het testen van cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen en cardiale regeneratieve strategieën 5,6,7,8. Ondanks de gerichte cardiale differentiatie van hiPSC's, blijven onbepaalde CM-nummers een uitdaging op hartgebied, omdat gerijpte hiPSC-CM's over het algemeen niet-proliferatief zijn en primaire menselijke cellen niet in grote hoeveelheden beschikbaar zijn.
Onlangs hebben we beschreven dat gelijktijdige Wnt-signaleringsactivering met een cultuur met lage celdichtheid resulteerde in een massale proliferatieve respons (tot 250-voudig) van hiPSC-CMs 9,10. Deze kosteneffectieve strategie voor de enorme uitbreiding van hiPSC-CMs via seriële passaging in kweekflesformaat vergemakkelijkt de standaardisatie en kwaliteitscontrole van grote aantallen functionele hiPSC-CMs. Bovendien, om de vraag naar grote partijen hiPSC-CMs van verschillende donoren bij te houden, is de biobanking van hiPSC-CMs beschreven10. Cardiomyocytenmonolagen die in deze standaardkweekschalen zijn gezaaid, zijn echter niet representatief voor de complexe 3D-structuur die in het hart aanwezig is. Bovendien is de onvolwassenheid van hiPSC-CMs een obstakel gebleven, waardoor het tekortschiet in het nabootsen van het biologische en fysiologische fenotype van de in vivo cardiovasculaire omgeving.
Er zijn nieuwe 3D in vitro modellen ontwikkeld waarbij hiPSC-CMs nauwer fysiologisch gedrag vertonen, zoals zelforganisatie 11,12, extracellulaire matrix (ECM) remodellering13, verbeterde rijping 14,15,16 en gesynchroniseerde contractie17,18,19 . 3D-modellen zijn gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen, het testen van cardiotoxiciteit van geneesmiddelen, ziektemodellering, regeneratieve therapieën en zelfs de eerste klinische onderzoeken 20,21,22,23,24. Een van de meest gebruikte modellen is het op fibrine gebaseerde gemanipuleerde hartweefsel (EHT), dat een weefselachtige opstelling en cardiale contractiliteit vertoont13,17,25. Eerder toonden we aan dat EHTs gegenereerd uit uitgebreide hiPSC-CMs een vergelijkbare contractiliteit vertoonden als die van niet-uitgebreide hiPSC-CMs, wat een compromisloze cellulaire functionaliteit na expansie9 aantoonde. Hoewel de generatie van EHT's uit hiPSC-CMs goed is ingeburgerd, worden echter verdere ontwikkelingen verwacht met betrekking tot de oprichting van een HT-beoordelingsplatform. Hier zorgt de snelle generatie van grote aantallen zelfaggregerende cardiale sferoïden (CSs) in 96-well-formaat voor een verbetering van 3D-omstandigheden voor high-throughput screening (HTS) -doeleinden.
Over het algemeen is het voordeel van CSs als 3D-celcultuur hun hoge reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. In het bijzonder kunnen CS'en in combinatie met robotische monsterverwerking de CS-cultuur, medicamenteuze behandeling en analyse met een hoog gehalte standaardiseren en automatiseren20. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om zeer zuivere en hoogwaardige CS'en te genereren, die efficiënt kunnen worden gecryopreserveerd en gescreend op hartfunctie door Ca2+ transiënte metingen uit te voeren met behulp van een optisch calciumacquisitie- en analysesysteem. Dit model biedt een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel om schermen met hoge doorvoer uit te voeren op honderden tot duizenden sferoïden17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn van het grootste belang voor het modelleren en therapeutisch maken van menselijke hartaandoeningen. We hebben onlangs een kosteneffectieve strategie gepubliceerd voor de enorme uitbreiding van hiPSC-CMs in twee dimensies (2D). Twee belangrijke beperkingen zijn celonvolwassenheid en een gebrek aan driedimensionale (3D) opstelling en schaalbaarheid in high-throughput screening (HTS) platforms. Om deze beperkingen te overwinnen, vormen de uitgebreide cardiomyocyten een ideale celbron voor het genereren van 3D-hartcelkweek en weefselmanipulatietechnieken. De laatste heeft een groot potentieel op cardiovasculair gebied en biedt meer geavanceerde en fysiologisch relevante HTS. Hier beschrijven we een HTS-compatibele workflow met eenvoudige schaalbaarheid voor het genereren, onderhouden en optisch analyseren van cardiale sferoïden (CS's) in een 96-well-formaat. Deze kleine CS'en zijn essentieel om de leemte op te vullen die aanwezig is in de huidige in vitro ziektemodellen en/of generatie voor 3D tissue engineering platforms. De CSs vertonen een zeer gestructureerde morfologie, grootte en cellulaire samenstelling. Bovendien vertonen hiPSC-CMs gekweekt als CSs een verhoogde rijping en verschillende functionele kenmerken van het menselijk hart, zoals spontane calciumbehandeling en contractiele activiteit. Door automatisering van de volledige workflow, van het genereren van CSs tot functionele analyse, verhogen we de intra- en inter-batch reproduceerbaarheid, zoals aangetoond door high-throughput (HT) imaging en calcium handling analyse. Het beschreven protocol maakt het mogelijk om hartaandoeningen te modelleren en de effecten van geneesmiddelen / therapeuten op eencellig niveau binnen een complexe 3D-celomgeving te beoordelen in een volledig geautomatiseerde HTS-workflow. Bovendien beschrijft de studie een eenvoudige procedure voor langetermijnbehoud en biobanking van hele sferoïden, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om functionele weefselopslag van de volgende generatie te creëren. HTS in combinatie met langdurige opslag zal aanzienlijk bijdragen aan translationeel onderzoek op een breed scala van gebieden, waaronder het ontdekken en testen van geneesmiddelen, regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën.

Het protocol in figuur 1A beschrijft het genereren van CSs uit eerder uitgebreide hiPSC-CMs. De CS'en krijgen een 3D-structuur op dag 1 na het zaaien in ultralage aanhechtingsplaten met ronde bodem en kunnen tot 6 weken worden gekweekt (figuur 1B). Zoals beoordeeld door immunofluorescentiekleuring, drukte de meerderheid van de cellen in 3 weken oude CSs sarcomerische eiwitten zoals α-actinine en troponine T uit en vertoonde een regelmatige sarcomeerorganisatie (figuur 1C). Voor de kwantificering van α-actininepositieve cellen werd flowcytometrie-analyse uitgevoerd. In overeenstemming met de immunofluorescentieresultaten toonden de flowcytometriegegevens vergelijkbare hoge niveaus van α-actinine in zowel dag 0 (76,9% ± 16,6%) als 3 weken oude CSs (71,1% ± 22,7%) (figuur 1D), wat wijst op een constante en zeer zuivere cellulaire samenstelling tijdens het kweken. Er was een verhoogde expressie van de cardiale genen voor junctions (GJA1, JPH2 en PKP2), desmosomen (DES) en mitochondriën (ATP5A) in hiPSC-CM afgeleide sferoïden (dag 42) versus hiPSC-CMs gekweekt in 2D gedurende 90 dagen (figuur 1E). De expressie van deze genen is een kenmerk van cel-cel interactie en rijping30.
Vervolgens werden de functionele eigenschappen van CS'en, namelijk slagsnelheid en Ca2+ handling, op verschillende tijdstippen beoordeeld (figuur 2). Calciumtransiënte parameters zoals stijgingstijd, piektijd, vervaltijd en calciumtransiënte duur (CTD90) werden geëvalueerd zoals aangegeven in figuur 2A, B. Het percentage verslaande CSs is vergelijkbaar in de eerste 3 weken na de generatie, maar daalde aanzienlijk in week 6 (Wk6) CSs (Figuur 2C). Het slagpercentage was aanzienlijk verminderd bij Wk3 in vergelijking met Wk1 en, vergelijkbaar met het percentage verslaande CS's, dramatisch gedaald bij Wk6 (Figuur 2D). Bij Wk6 werd CS-verslechtering waargenomen, wat de daling van zowel de slagsnelheid als het aantal kloppende CS'en kan verklaren. Meting van calciumtransiënte parameters wees op een significant hogere piekwaarde bij Wk2 (figuur 2E), terwijl de stijgingstijd, vervaltijd en CTD90 significant waren toegenomen bij Wk3 in vergelijking met Wk1 (figuur 2F-H ). Samen laten deze resultaten zien dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden functioneel optimaal zijn rond week 2 en 3 na generatie.
Figuur 3 toont het effect van de sferoïde grootte op de klopsnelheid en calciumbehandeling. CSs werden gegenereerd door 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 en 20 x 10 4 hiPSC-CMs in een put van een 96-well plaat te zaaien voor een totaal van 24 CSs / putten per conditie (figuur 3A). Zoals verwacht nam de sferoïde grootte toe naarmate het aantal gebruikte cellen toenam, variërend van 178 ± 36 μm tot 351 ± 65 μm (figuur 3A, rechterpaneel). Ca2+ transiënten werden gemeten in 3 weken oude CSs bij de vier verschillende zaaidichtheden (figuur 3B). Metingen van het verslaan van CSs gaven aan dat slechts ongeveer 50% van de kleinere size-CSs (2.5K- en 5K-CSs) werden geslagen, terwijl het percentage grotere size-beating CSs (10K- en 20K-CSs) significant hoger was (ongeveer 85%) (Figuur 3C). Een vergelijkbare slagsnelheid (ongeveer 28 bpm) werd getoond door 5K-, 10K- en 20K-CSs, wat significant hoger was in vergelijking met 2.5K-CSs (Figuur 3D). De piekwaarden van calciumbeelden waren vergelijkbaar in alle geteste omstandigheden (figuur 3E), maar de stijgingstijd (figuur 3F), de vervaltijd (figuur 3G) en CTD90 (figuur 3H) waren significant verhoogd in grotere cs's (10K- en 20K-CSs) in vergelijking met de kleinere (2,5K- en 5K-CSs). Samen tonen deze resultaten aan dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden optimaal zijn voor calciumbehandelingsscreening wanneer een zaaidichtheid tussen 10K- en 20K hiPSC-CMs / put wordt gebruikt.
Vervolgens evalueerden we de impact van cryopreservatie op de levensvatbaarheid en functie van CS. Vóór de analyse werden ontdooide CSs gedurende 1 week in cultuur gehouden (figuur 4A). Zoals blijkt uit zowel flowcytometrie (figuur 4B) als calceïne-AM (figuur 4C) cel levensvatbaarheidstests, had cryopreservatie geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen binnen de CSs. Bovendien vertoonden ontdooide CSs vergelijkbare expressieniveaus van sarcomerische eiwitten in vergelijking met de verse leeftijdsgematchte CSs (figuur 4D). Deze gegevens geven aan dat CSs efficiënt kunnen worden gecryopreserveerd voor daaropvolgende hartfunctieanalyse en high-throughput screening.
Ten slotte werden de klopactiviteit en Ca2+ handling gemeten in zowel verse als gecryopreserveerde CSs (figuur 5). Het percentage kloppende CSs werd gemeten op verschillende tijdstippen na het ontdooien, respectievelijk na 2, 5 en 7 dagen. Terwijl de meeste verse CSs in de loop van de tijd klopactiviteit vertoonden, hadden de gecryopreserveerde CSs duidelijk tot 1 week kweken nodig om hun kloppende activiteit te herstellen (figuur 5B). Er was geen significante verandering in de slagsnelheid van ontdooide CSs versus vers; er werd echter geen spontane klopactiviteit waargenomen in sommige bevroren CSs (figuur 5C). Hoewel de piekwaarden significant waren verlaagd in bevroren/ontdooide CSs in vergelijking met vers (figuur 5D), werden er geen significante veranderingen waargenomen in stijgingstijd, vervaltijd en de CTD90 van bevroren/ontdooide CSs in vergelijking met verse (figuur 5E-G). Deze gegevens geven aan dat het na het ontdooien belangrijk is om de CS'en minstens 1 week in de couveuse te laten herstellen voordat de klopactiviteit en Ca2+ van voorbijgaande aard worden gemeten.
Samen tonen deze resultaten aan dat cryopreservatie van hiPSC-CM-afgeleide sferoïden de levensvatbaarheid van cardiomyocyten, de sarcomerische structuur en hun functionele kenmerken zoals spontane klopactiviteit en calciumbehandeling behoudt. HiPSC-CM-afgeleide sferoïden vormen dus een geschikt model om de cardiale elektrofysiologie in vitro nauwkeurig samen te vatten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figuur 1: Generatie van cardiale sferoïden. (A) Schematische weergave van op Wnt gebaseerde gerichte cardiale differentiatie, de daaropvolgende uitbreiding van hiPSC-CMs en het genereren van CSs. Gemaakt met biorender.com. (B) Bright-field beelden op verschillende tijdstippen van CS kweek. Schaalbalk, 200 μm. Wk staat voor week. (C) Representatieve immunofluorescentiebeelden voor cardiale sarcomerische eiwitten α-actinine en troponine T in 3 weken oude CSs. Immunofluorescentie: Hoechst (blauw), α-actinine (groen) en troponine T (rood). Schaalbalk, 200 μm. De ingezoomde samengevoegde afbeelding aan de rechterkant toont de sarcomeerorganisatie. Schaalbalk, 50 μm. (D) Flowcytometriekwantificering van α-actininepositieve cellen vóór (dag 0) en 3 weken na de vorming van CSs. (n = 14-23 per aandoening. (E) RT-qPCR uitgevoerd op hiPSC-CMs gekweekt gedurende 90 dagen (2D) en sferoïde monsters gekweekt gedurende 42 dagen om expressieniveaus vast te stellen van verschillende hartgenen gerelateerd aan celverbindingen, intermediaire filamenten en mitochondriën. (n = 1-3 batches). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. NS (niet-significant) zoals berekend door een ongepaarde t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figuur 2: Slagsnelheid en calciumbehandeling in CSs op verschillende weken na generatie. (A) Voorbeelden van calciumtransiënte parameters berekend door het Vala sciences analysealgoritme in Cyteseer Software. (B) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse-beelden van de CSs op verschillende tijdstippen (weken) na de generatie. Schaalbalk, 200 μm. (C) De kwantificering van het tijdsverloop van spontane klopactiviteit wordt uitgedrukt als het percentage kloppende CS'en. (D) Slagsnelheid van CSs tijdens kweektijd. (E-H) Kwantificering van de calciumtransiënten met piekwaarde, stijgingstijd, vervaltijd en CTD90. De getoonde gegevens zijn gemiddeld ± SD. Biologische replicaties = drie, technische replicaties = respectievelijk 38, 50, 66 en 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen; CTD = calcium voorbijgaande duur, Wk = week, CSs = menselijke cardiale sferoïden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figuur 3: Slagsnelheid en calciumbehandeling in CSs gegenereerd met behulp van verschillende celzaaidichtheden. (A) Bright-field imaging (links) en groottemetingen (rechts) van CSs gegenereerd met behulp van verschillende aantallen hiPSC-CMs. Schaalbalk, 200 μm. (B) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse beelden van de 2.5K-20K-CSs. (C,D) Slagpercentage en slagpercentage van 2.5K-20K-CSs. (E-H) Piekwaarde, stijgtijd, vervaltijd en CTD90 in 2.5K-20K-CSs. De gegevens zijn gemiddeld ± SD. Biologische replicaties = drie, technische replicaties = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen: CTD = calcium transient duration, Wk = week, k = x 1.000 cellen, CSs = cardiale sferoïden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Figuur 4. Effect van cryopreservatie op de levensvatbaarheid en structuur van cardiale sferoïden. (A) Schematische weergave van CS-generatie, daaropvolgende biobanking en ontdooiing. (B) Levensvatbaarheidstest van flowcytometriecellen in zowel verse als gecryopreserveerde CSs. Als positieve controle werd een behandeling met 10% Triton-X-oplossing gedurende 5 minuten gebruikt. (n = 4 per voorwaarde). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. * ***p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. (C) Calceïne-AM cel levensvatbaarheidstest in verse versus ontdooide CSs na 7 dagen kweken (n = 15-17 per aandoening, ** **p < 0,001, door gepaarde t-test; schaalbalk, 200 μm). (D) Representatieve bright-field (links) en immunofluorescentiekleuring voor α-actinine en troponine T-expressie in verse en ontdooide CSs. Immunofluorescentie: Hoechst (blauw), α-actinine (groen) en troponine T (rood). De samengevoegde afbeeldingen aan de rechterkant tonen sarcomeerstrepen in de CSs. Schaalbalk, 50 μm. Afkortingen: X = ontdooidag naar keuze, PI = propidiumjodide, Cal-AM = calceïne-AM, EthD-I = Ethidium Homodimeer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figuur 5: Calciumtransiënten in verse versus ontdooide CSs. (A) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse beelden van de CSs vóór cryopreservatie en 1 week na ontdooiing. (B) Klopppercentage verse en bevroren/ontdooide hartsferoïden. Balken vertegenwoordigen individuele experimenten. (C) Kloppsnelheid van verse en bevroren/ontdooide hartsferoïden. (D-G) Kwantificering van calciumtransiënte parameters: piekwaarde, stijgingstijd, vervaltijd en CTD90. De gegevens zijn gemiddeld ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen; CTD = calcium voorbijgaande duur, CSs = cardiale sferoïden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Representatieve gatingstrategieën voor flowcytometrie-analyse. (A) Representatieve gatingstrategie voor α-actininepositieve hiPSC-CMs in een zuivere populatie versus negatieve controle en isotypecontrole. Het aantal α-actinine positief geanalyseerde cellen is 25 x 105. Afkortingen; SSC = side scatter, PI+ = propidiumjodide positief. (B) Representatieve gatingstrategie voor de levensvatbaarheidsanalyse in zowel verse, ontdooide, de positieve controle (Triton-X) als de negatieve controle (niet-gekleurd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het genereren en cryopreservatie van cardiale sferoïden (CSs) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gekweekt in een multidimensionaal formaat met hoge doorvoer. Dit driedimensionale model functioneert als een robuust platform voor ziektemodellering, high-throughput screenings en behoudt zijn functionaliteit na cryopreservatie.

Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Dit protocol beschrijft een workflow voor het genereren, onderhouden en optisch analyseren van cardiale sferoïden. Deze cardiale sferoïden zijn essentieel om de leemte in de huidige in vitro ziektemodellen op te vullen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om next-generation, high-throughput screening en functionele opslag van cardiale sferoïden te creëren.Begin met het toevoegen van één milliliter per vierkante centimeter steriele hartloslatingsoplossing aan elke put van een kweekplaat met confluente door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bevestig het loslaten van cellen door witte en ronde cellen te observeren onder 4x vergroting van een helderveldmicroscoop.Gebruik een pipet van vijf milliliter om de cellen mechanisch te scheiden door ze te spoelen met twee milliliter warm basaal medium om een enkele celsuspensie te bereiden. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende drie minuten op 300 g. Zuig vervolgens het supernatant op en resuspensie de cellen in één milliliter hiPSC-CM-replatingmedia.Gebruik een pipetpunt van 1.000 microliter om de celpellet te dissociëren. Na drie of vier mengsels, als de oplossing homogeen lijkt, laadt u deze in een cassette om de cellen te tellen en brengt u de juiste hoeveelheid cellen in 100 microliter replatingmedium over naar elke put van een ultralage aanhechting, ronde bodem, 96-putplaat. Plaats de cardiale sferoïdenplaat op een orbitale schudder in de couveuse bij 70 tpm met een temperatuur van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, 21% zuurstof en 90% vochtigheid gedurende 24 uur.Om sferoïde ruptuur te voorkomen, zuigt u slechts 50 microliter medium uit elke put en voegt u de eerste 48 uur 100 microliter RPMI plus B27-medium per put toe. Zuig vervolgens 100 microliter van het medium uit elke put en voeg 100 microliter van het rijpingsmedium per put toe. Houd de cellen in het rijpingsmedium en ververs het medium om de twee tot drie dagen.Plaats de sferoïde plaat gedurende 10 minuten op ijs voor het voorkoelen voordat u de plaat gedurende drie minuten op 70 g centrifugeert. Verwijder het medium totdat er 50 microliter in de put overblijft. Voeg vervolgens 200 microliter ijskoud hiPSC vriesmedium per put toe.Sluit de plaat af met een plaatafdichtingsfolie. Om de siliconen mal voor te bereiden, mengt u de componenten van de siliciumelastomeerkit in een verhouding van 10 op 1 en voegt u de oplossing toe in het onderste deel van de putplaat. De-bubbel de oplossing met behulp van een vacuümpomp gedurende 15 tot 20 minuten.Plaats de vorm in een oven en laat deze acht uur lang uitharden bij 60 graden Celsius om een semi-flexibel elastomeer te verkrijgen dat van de plaat wordt gepeld. Plaats de verzegelde plaat voorzichtig in een siliconen mal en zorg voor een gelijkmatige warmte-uitwisseling tussen de putplaat en de vriezer. Vries de plaat minimaal vier uur in op 80 graden Celsius in de voorbereide siliconenvorm voordat u de plaat overbrengt naar een tank met vloeibare stikstof of een vriezer van 150 graden Celsius voor langdurige opslag.Om een snelle ontdooiing van cardiale sferoïden te garanderen, verzamelt u één celplaat met cardiale sferoïden tegelijk uit de vloeibare stikstof en plaatst u deze gedurende 15 minuten in de couveuse bij 37 graden Celsius, met 5% koolstofdioxide, 21% zuurstof en 90% vochtigheid. Verwijder de afdichtingsfilm van de plaat en zuig 150 microliter van elke put op voordat u 200 microliter van een warm basaal medium aan elke put toevoegt. Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten op 70 g en herhaal de warme basale medium was.Als u klaar bent, verwijdert u 150 microliter van het medium en voegt u 200 microliter cardiomyocyten toe aan het ontdooien van het medium in elke put. Herhaal vervolgens de RPMI-wassing zoals vermeld tijdens het genereren van cardiale sferoïden, gevolgd door het onderhouden van de cellen in de rijpingsmedia. Na een week van de kweek zijn de ontdooide hartsferoïden optimaal voor calciumverwerking van optische beeldvorming.Zuig 150 microliter van elke put op. Behandel de ontdooide hartsferoïden met 100 microliter Cal-520 AM calciumkleurstofmedium per put in donkere omstandigheden en incubeer de plaat gedurende 60 minuten. Bereid een calciumacquisitie- en analysesysteem voor door de microscoop aan te drijven en ervoor te zorgen dat de omgevingscontroleoptie is ingeschakeld.Pas de afmetingen van de camera en het diafragma aan om het achtergrondgebied te minimaliseren. Om het calciumsignaal te meten, met behulp van een laser van 488 nanometer, stelt u het contrast in op een zwarte achtergrond met een helder groen signaal tijdens de calciumafgifte. Neem een video op met een consistente stream van 2 tot 10 pieken binnen 10 seconden.Neem een video van 10 seconden op en scan over de 96-putplaat, eerst naar links en vervolgens zigzaggend naar beneden om de hele plaat te bedekken. Na het verkrijgen van de calciumtransiënten, analyseert u de gegevens met behulp van fluorescentiesporenanalysesoftware. De cardiale sferoïden kregen op dag één na het zaaien een 3D-structuur, die tot zes weken kon worden gekweekt.De meerderheid van de drie weken oude cardiale sferoïden drukte regelmatige sarcomeerorganisatie uit met alfa-actinine en troponine T. Hoge niveaus van alfa-actinine op dag nul en drie weken oude cardiale sferoïden wezen op een constante en zeer zuivere cellulaire samenstelling tijdens het kweken. Een verhoogde expressie van de cardiale genen, desmosomen en mitochondriën werden waargenomen in sferoïden dan hiPSC-CMs gekweekt in 2D gedurende 90 dagen. Het slagpercentage van cardiale sferoïden was vergelijkbaar in de eerste drie weken na de generatie en daalde aanzienlijk in week zes als gevolg van verslechtering van de cardiale sferoïden.Het slagpercentage was aanzienlijk verminderd in week drie in vergelijking met en daalde in week zes als gevolg van verslechtering. Calciumtransiënte parameters wezen op een hogere piekwaarde in week twee, terwijl de stijgingstijd, vervaltijd en de calciumtransiënte duur bij 90% van het verval significant waren toegenomen in week drie, wat aantoont dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden functioneel optimaal waren in week twee en drie na generatie. De sferoïde grootte nam toe met het aantal cellen dat werd gebruikt voor het zaaien.In grotere omvang, oude sferoïden, was het kloppen aanzienlijk hoger. Een vergelijkbare en significant hogere slagsnelheid werd getoond door 5k, 10k en 20k sferoïden in vergelijking met 2,5k sferoïden. Cryopreservatie had geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen in de cardiale sferoïden.Vergelijkbare expressie van sarcomerische eiwitten in de ontdooide en verse leeftijdsgematchte sferoïden duidde op cryopreservatie-efficiëntie. Er was geen significante verandering in de slagsnelheid van ontdooide of verse cardiale sferoïden. Er werden geen significante veranderingen waargenomen in stijgingstijd, vervaltijd en de CTD90 van ontdooid of vers CS. Naast ziektemodellering en high-throughput medicijnscreenings, kunnen deze sferoïden ook worden gebruikt voor bioreactoren van extracellulaire blaasjesproductie en extracellulaire blaasje-gerelateerde therapieën.Ook kan de biobanking van deze sferoïden worden gebruikt als een nieuwe cardiomyocytenvoorziening voor regeneratieve strategieën. Accumulerend bewijs suggereert dat biobanken van patiënt-afgeleide stamcelmodellen voor cystische fibrose, kanker en cardiale sferoïden een groot potentieel hebben voor het ontrafelen van moleculaire mechanismen voor medicijnscreenings en voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...