Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La découverte de médicaments cardiaques est entravée par le recours à des modèles animaux et cellulaires non humains avec un débit et une fidélité physiologique insuffisants pour effectuer des lectures avec précision. La biologie hiPSC-CM couplée à l’instrumentation HT et aux sondes physiologiques a le potentiel de réintroduire des modèles humains dans les premières étapes de la modélisation des maladies cardiaques et de la découverte de médicaments. Nous avons développé une méthode de génération de tissu cardiaque 3D qui produit des CS fonctionnels et de haute qualité pour une plateforme optimale de modélisation des maladies cardiaques et de dépistage de médicaments. De plus, la combinaison de la technologie sphéroïde dans des systèmes de bioréacteurs 3D pour la production industrielle de véhicules électriques permet une étape nécessaire vers la traduction clinique de la thérapie à base de véhicules électriques. La méthode décrite ici repose sur plusieurs facteurs cruciaux et est une variante des protocoles existants 9,10,28,29. Ces méthodes comprennent: 1) la génération de constructions tissulaires 3D, 2) le nombre optimal de cellules et le moment avant le criblage, 3) l’amélioration de la sensibilité et de la capacité à haut débit des instruments, et 4) la possibilité de congeler les sphéroïdes avant toute analyse fonctionnelle. Contrairement aux protocoles décrits précédemment, le protocole proposé décrit la génération de jusqu’à 1 500 sphéroïdes par jour et la pertinence du HTS. L’analyse conventionnelle d’une centaine de composés sur 6 x 0,5 log doses pour 10 répétitions à l’aide de systèmes d’imagerie calcique existants à 96 puits ou de tissus cardiaques modifiés multiplexés à 24 puits nécessite environ 500 millions à 3 milliards de hiPSC-CM31,32. L’application proposée rend les dépistages cardiaques moins coûteux et moins rapides que les systèmes conventionnels puisque les plaques à 96 puits ne nécessitaient que 10 % de la densité d’ensemencement par rapport à la méthode décrite. De plus, par rapport aux protocoles précédents, tels que la méthode de la goutte suspendue, la génération de sphéroïdes par auto-agrégation dans des plaques de fixation ultra-basses permet une imagerie automatisée de haute qualité de microtissus uniques33.
Ce petit modèle 3D imite le phénotype biologique et physiologique de l’environnement cardiovasculaire in vivo . Comme démontré précédemment, les transitoires de calcium augmentent considérablement dans les constructions de tissus cardiaques 3D par rapport aux cultures cellulaires monocouches2D 34.
Ensuite, nous avons constaté que la densité de semis et le temps de culture approprié sont également des facteurs critiques pour un dépistage CS réussi. Les densités de 10K-20K hiPSC-CM par sphéroïde et le dépistage entre les semaines 2 et 3 après la génération étaient optimales, tandis que les sphéroïdes trop petits ou trop âgés présentent une manipulation perturbée du calcium (Figure 2 et Figure 3). Par conséquent, il est important de maintenir des densités de semis aussi cohérentes que possible, car la taille influence les paramètres fonctionnels. De plus, bien que cette méthode optique fournisse de bons résultats pour les cultures 3D vivantes en tant que tissu entier, il est difficile d’obtenir des données au sein de sphéroïdes plus grands au niveau (sous-)cellulaire sans recourir à des méthodes histologiques fastidieuses. Récemment, plusieurs approches ont été publiées qui utilisaient le « nettoyage optique », qui permet l’acquisition de sphéroïdes 3D entiers avec la possibilité de quantifier des marqueurs à cellule unique. Ici, nous avons adapté un protocole de 3 jours allant de la récolte CS à l’analyse d’images, optimisée pour l’imagerie 3D par microscopie confocale29 (Figure 1C et Figure 4D).
Enfin, avec l’augmentation des applications de tissus cardiaques 3D et des applications commerciales, la demande de stockage à long terme et de biobanque spécifique au patient de la part de divers donneurs augmente. La cryoconservation est une stratégie efficace pour générer des plaques HTS à partir de plusieurs lots au fil du temps. La congélation des hiPSC-CM a été décrite précédemment et n’est pas différente de celle des autres types de cellules cultivées 10,35,36. Récemment, des approches pour congeler des plaques avec des cellules 2D ont été décrites37. Ici, nous avons constaté que le kit de cryoconservation PSC est la condition la plus optimale par rapport à trois autres (données non présentées) et utilisé ce milieu pour la congélation efficace des sphéroïdes. Après cryoconservation, la viabilité reste élevée (Figure 4B,C), mais les propriétés électrophysiologiques des CS sont affectées et une période d’incubation après décongélation est nécessaire. En effet, 1 semaine après la décongélation, les CS ont montré une activité de battement spontanée et une manipulation du calcium. Cependant, il a été décrit que les hiPSC-CM fraîches et récupérées ne présentent pas toujours des propriétés moléculaires et physiologiques identiques38. Cette limitation doit être prise en compte lorsque des CM-HiPSC cryoconservés sont utilisés pour évaluer les lectures cardiaques induites par le médicament. De plus, bien que nous modulions efficacement le nombre de cellules par sphéroïde et le moment optimal de l’imagerie transitoire du calcium, les sphéroïdes cardiaques pourraient être améliorés en mélangeant des cellules cardiomyocytaires dérivées de l’hiPSC avec des cellules endothéliales, des fibroblastes, des jonctions cellule-cellule et des matrices extracellulaires, telles que le chitosane, le collagène IV, la fibronectine, la matrigel ou la laminine, imitant l’environnement cardiaque in vivo 39, 40. Dans l’ensemble, nous proposons un protocole étape par étape pour générer efficacement des CS adaptés aux applications en aval telles que la modélisation des maladies et le dépistage de médicaments HT.

La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) a offert des possibilités sans précédent d’étudier le développement humain et la maladie au niveau cellulaire. Au cours de la dernière décennie, à l’aide de leçons de développement, divers protocoles ont été établis pour assurer la différenciation efficace des CSPhi en cardiomyocytes (CM)1,2,3,4. Les cardiomyocytes dérivés des hiPSC (hiPSC-CM) peuvent servir de ressource pour modéliser les maladies cardiovasculaires génétiquement héréditaires (MCV), tester la sécurité cardiaque pour de nouveaux médicaments et les stratégies de régénération cardiaque 5,6,7,8. Malgré la différenciation cardiaque dirigée des CSPhi, le nombre indéfini de CM reste un défi dans le domaine cardiaque, car les HIPSC-CM matures ne sont généralement pas prolifératifs et les cellules humaines primaires ne sont pas disponibles en grande quantité.
Récemment, nous avons décrit que l’activation concomitante de la signalisation Wnt avec une culture à faible densité cellulaire entraînait une réponse proliférative massive (jusqu’à 250 fois) des hiPSC-CMs 9,10. Cette stratégie rentable pour l’expansion massive des CM-CSPh via le passage en série dans le format flacon de culture facilite la normalisation et le contrôle de la qualité d’un grand nombre de CM-CSP fonctionnels. De plus, pour répondre à la demande de grands lots de CM-CSPhi de divers donateurs, la biobanque de CM-HIPSC a été décrite10. Cependant, les monocouches de cardiomyocytes ensemencées dans ces boîtes de culture standard ne sont pas représentatives de la structure 3D complexe présente dans le cœur. De plus, l’immaturité des hiPSC-CM est restée un obstacle, ne permettant donc pas d’imiter le phénotype biologique et physiologique de l’environnement cardiovasculaire in vivo.
De nouveaux modèles in vitro 3D ont été développés où les hiPSC-CM montrent un comportement physiologique plus étroit tel que l’auto-organisation 11,12, le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) 13, la maturation améliorée 14,15,16 et la contraction synchronisée17,18,19 . Les modèles 3D ont été utilisés pour la découverte de médicaments, les tests de cardiotoxicité des médicaments, la modélisation de maladies, les thérapies régénératives et même les premiers essais cliniques 20,21,22,23,24. L’un des modèles les plus utilisés est le tissu cardiaque modifié à base de fibrine (EHT), qui présente un arrangement tissulaire et une contractilité cardiaque13,17,25. Auparavant, nous avons montré que les EHT générés à partir de hiPSC-CM étendus présentaient une contractilité comparable à celles des hiPSC-CM non développés, démontrant une fonctionnalité cellulaire sans compromis après l’expansion9. Néanmoins, même si la génération d’EHT à partir de CM-CSP a été bien établie, d’autres développements sont attendus concernant la mise en place d’une plate-forme d’évaluation de l’HT. Ici, la génération rapide d’un grand nombre de sphéroïdes cardiaques (CS) auto-agrégés au format 96 puits permet une amélioration des conditions 3D à des fins de criblage à haut débit (HTS).
Dans l’ensemble, l’avantage des CS en tant que culture cellulaire 3D est leur reproductibilité et leur évolutivité élevées. En particulier, les CS combinés à la manipulation robotisée des échantillons peuvent normaliser et automatiser la culture CS, le traitement de la toxicomanie et l’analyse à haut contenu20. Ici, nous décrivons des protocoles optimisés pour générer des CS de haute pureté et de haute qualité, qui peuvent être efficacement cryoconservés et criblés pour la fonction cardiaque en effectuant des mesures transitoires Ca2+ à l’aide d’un système optique d’acquisition et d’analyse du calcium. Ce modèle fournit un outil simple mais puissant pour effectuer des criblages à haut débit sur des centaines à des milliers de sphéroïdes17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont d’une importance primordiale pour la modélisation et la thérapeutique des maladies cardiaques humaines. Nous avons récemment publié une stratégie rentable pour l’expansion massive des CM-HISP en deux dimensions (2D). Deux limitations majeures sont l’immaturité cellulaire et le manque d’arrangement tridimensionnel (3D) et d’évolutivité dans les plates-formes de criblage à haut débit (HTS). Pour surmonter ces limitations, les cardiomyocytes expansés forment une source cellulaire idéale pour la génération de cultures cellulaires cardiaques 3D et de techniques d’ingénierie tissulaire. Ce dernier présente un grand potentiel dans le domaine cardiovasculaire, fournissant un HTS plus avancé et physiologiquement pertinent. Ici, nous décrivons un flux de travail compatible HTS avec une évolutivité facile pour la génération, la maintenance et l’analyse optique des sphéroïdes cardiaques (CS) dans un format de 96 puits. Ces petits CS sont essentiels pour combler les lacunes présentes dans les modèles actuels de maladies in vitro et/ou la génération de plateformes d’ingénierie tissulaire 3D. Les CS présentent une morphologie, une taille et une composition cellulaire très structurées. De plus, les hiPSC-CM cultivés en tant que CS présentent une maturation accrue et plusieurs caractéristiques fonctionnelles du cœur humain, telles que la manipulation spontanée du calcium et l’activité contractile. En automatisant l’ensemble du flux de travail, de la génération de CS à l’analyse fonctionnelle, nous augmentons la reproductibilité intra et inter-lots, comme le démontrent l’imagerie à haut débit (HT) et l’analyse de la manipulation du calcium. Le protocole décrit permet de modéliser les maladies cardiaques et d’évaluer les effets médicamenteux / thérapeutiques au niveau de la cellule unique dans un environnement cellulaire 3D complexe dans un flux de travail HTS entièrement automatisé. En outre, l’étude décrit une procédure simple pour la préservation à long terme et la biobanque de sphéroïdes entiers, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité de créer un stockage de tissus fonctionnels de nouvelle génération. Le HTS, combiné au stockage à long terme, contribuera de manière substantielle à la recherche translationnelle dans un large éventail de domaines, notamment la découverte et les essais de médicaments, la médecine régénérative et le développement de thérapies personnalisées.

Le protocole illustré à la figure 1A décrit la génération de CS à partir de hiPSC-CM précédemment développés. Les CS acquièrent une structure 3D au jour 1 après l’ensemencement dans des plaques à fond rond à très faible fixation et peuvent être cultivés jusqu’à 6 semaines (Figure 1B). Comme évalué par coloration par immunofluorescence, la majorité des cellules des CS âgés de 3 semaines exprimaient des protéines sarcomériques telles que la α-actinine et la troponine T et présentaient une organisation sarcomère régulière (Figure 1C). Pour la quantification des cellules positives à la α-actinine, une analyse par cytométrie de flux a été effectuée. Conformément aux résultats de l’immunofluorescence, les données de cytométrie en flux ont démontré des niveaux élevés comparables de α-actinine dans les CS du jour 0 (76,9% ± 16,6%) et des CS âgés de 3 semaines (71,1% ± 22,7%) (Figure 1D), indiquant une composition cellulaire constante et très pure pendant la culture. Il y avait une expression accrue des gènes cardiaques pour les jonctions (GJA1, JPH2 et PKP2), les desmosomes (DES) et les mitochondries (ATP5A) chez les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM (jour 42) par rapport aux hiPSC-CM cultivés en 2D pendant 90 jours (Figure 1E). L’expression de ces gènes est une caractéristique de l’interaction cellule-cellule et de la maturation30.
Par la suite, les propriétés fonctionnelles des CS, à savoir le taux de battement et la manipulation du Ca2+, ont été évaluées à différents moments (figure 2). Les paramètres transitoires du calcium, comme le temps de montée, le temps de pointe, le temps de désintégration et la durée transitoire du calcium (CTD90), ont été évalués comme l’indiquent les figures 2A, B. Le pourcentage de CS battus est similaire au cours des 3 premières semaines post-génération, mais a considérablement diminué au cours de la semaine 6 (Wk6) CS (Figure 2C). Le taux de battement a été significativement réduit à Wk3 par rapport à Wk1 et, comme le pourcentage de CS battus, a chuté de façon spectaculaire à Wk6 (Figure 2D). Au Wk6, une détérioration du CS a été observée, ce qui peut expliquer la baisse à la fois du taux de battement et du nombre de CS battants. La mesure des paramètres transitoires calciques a indiqué une valeur de pointe significativement plus élevée à Wk2 (Figure 2E), tandis que le temps de montée, le temps de désintégration et CTD90 ont été significativement augmentés à Wk3 par rapport à Wk1 (Figure 2F-H ). Pris ensemble, ces résultats montrent que les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM sont fonctionnellement optimaux vers les semaines 2 et 3 post-génération.
La figure 3 montre l’effet de la taille des sphéroïdes sur la vitesse de battement et la manipulation du calcium. Les CS ont été générés par l’ensemencement de 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 et 20 x 10 4 hiPSC-CM dans un puits d’une plaque de 96 puits, pour un total de 24 CS/puits par condition (figure 3A). Comme prévu, la taille des sphéroïdes a augmenté à mesure que le nombre de cellules utilisées augmentait, allant de 178 ± 36 μm à 351 ± 65 μm (figure 3A, panneau de droite). Les transitoires de Ca2+ ont été mesurés dans des CS âgés de 3 semaines aux quatre densités de semis différentes (figure 3B). Les mesures des CS battants ont indiqué que seulement environ 50 % des CS de plus petite taille (2,5K et 5K-CS) battaient, tandis que le pourcentage de CS de plus grande taille battant (10K et 20K-CS) était significativement plus élevé (environ 85 %) (figure 3C). Un taux de battement similaire (environ 28 bpm) a été montré par les 5K-, 10K-et 20K-CS, ce qui était significativement plus élevé que les 2,5K-CS (Figure 3D). Les valeurs maximales des images de calcium étaient similaires dans toutes les conditions testées (figure 3E), mais le temps de montée (figure 3F), le temps de désintégration (figure 3G) et CTD90 (figure 3H) ont été significativement augmentés dans les CS de plus grande taille (10K et 20K-CS) par rapport aux plus petits (2,5K et 5K-CS). Pris ensemble, ces résultats montrent que les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM sont optimaux pour le criblage de la manipulation du calcium lorsqu’une densité de semis comprise entre 10K et 20K hiPSC-CM/puits est utilisée.
Ensuite, nous avons évalué l’impact de la cryoconservation sur la viabilité et la fonction du CS. Avant l’analyse, les CS décongelés ont été maintenus en culture pendant 1 semaine (figure 4A). Comme l’ont montré les tests de viabilité cellulaire de cytométrie en flux (figure 4B) et de calcéine-AM (figure 4C), la cryoconservation n’a pas affecté la viabilité cellulaire dans les CS. De plus, les CS décongelés ont montré des niveaux d’expression similaires des protéines sarcomériques par rapport aux CS appariés par l’âge frais (Figure 4D). Ces données indiquent que les CS peuvent être cryoconservés efficacement pour une analyse ultérieure de la fonction cardiaque et un dépistage à haut débit.
Enfin, l’activité de battement et la manipulation du Ca2+ ont été mesurées dans des CS frais et cryoconservés (Figure 5). Le pourcentage de CS battus a été mesuré à différents moments après la décongélation, respectivement, à 2, 5 et 7 jours. Alors que la plupart des CS frais ont montré une activité de battement au fil du temps, il est clair que les CS cryoconservés ont eu besoin de jusqu’à 1 semaine de culture pour récupérer leur activité de battement (Figure 5B). Il n’y avait pas de changement significatif dans le taux de battement des CS décongelés par rapport aux frais; toutefois, aucune activité spontanée de battement n’a été observée chez certains CS congelés (figure 5C). Bien que les valeurs de pointe aient été significativement réduites dans les CS congelés/décongelés par rapport aux CS frais (figure 5D), aucun changement significatif n’a été observé dans le temps de montée, le temps de désintégration et le CTD90 des CS congelés/décongelés par rapport aux CS frais (figure 5E-G). Ces données indiquent qu’après la décongélation, il est important de laisser les CS récupérer dans l’incubateur pendant au moins 1 semaine avant de mesurer l’activité de battement et Ca2+ transitoire.
Pris ensemble, ces résultats montrent que la cryoconservation des sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM préserve la viabilité des cardiomyocytes, la structure sarcomérique et leurs caractéristiques fonctionnelles telles que l’activité de battement spontané et la manipulation du calcium. Ainsi, les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM représentent un modèle approprié pour récapituler avec précision l’électrophysiologie cardiaque in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figure 1 : Génération de sphéroïdes cardiaques. (A) Représentation schématique de la différenciation cardiaque dirigée basée sur Wnt, de l’expansion ultérieure des hiPSC-CM et de la génération de CS. Créé avec biorender.com. (B) Images en fond clair à différents points temporels de la culture CS. Barre d’échelle, 200 μm. Wk représente la semaine. (C) Images représentatives de l’immunofluorescence pour les protéines sarcomériques cardiaques α-actinine et troponine T dans les CS âgés de 3 semaines. Immunofluorescence: Hoechst (bleu), α-actinine (vert) et troponine T (rouge). Barre d’échelle, 200 μm. L’image fusionnée agrandie à droite montre l’organisation du sarcomère. Barre d’échelle, 50 μm. (D) Quantification par cytométrie en flux des cellules positives à la α-actinine avant (jour 0) et 3 semaines après la formation des CS. (n = 14-23 par condition. (E) RT-qPCR réalisée sur des hiPSC-CM cultivés pendant 90 jours (2D) et des échantillons de sphéroïdes cultivés pendant 42 jours pour établir les niveaux d’expression de différents gènes cardiaques liés aux jonctions cellulaires, aux filaments intermédiaires et aux mitochondries. (n = 1-3 lots). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. NS (non significatif) calculée par un test t non apparié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figure 2 : Taux de battement et manipulation du calcium dans les CS à différentes semaines après la génération. (A) Exemples de paramètres transitoires calciques calculés par l’algorithme d’analyse Vala sciences de Cyteseer Software. (B) Des traces transitoires de calcium représentatives et des images accélérées des CS à différents moments (semaines) post-génération. Barre d’échelle, 200 μm. (C) La quantification de l’activité de battement spontané est exprimée en pourcentage de CS battus. (D) Taux de battement des CS pendant la culture. (E-H) Quantification des transitoires calciques montrant la valeur maximale, le temps de montée, le temps de désintégration et CTD90. Les données présentées sont des réplications moyennes ± écart-type. Réplications biologiques = trois, répétitions techniques = 38, 50, 66 et 7, respectivement. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples post hoc de Tukey. Abréviations; CTD = durée transitoire du calcium, semaine = semaine, CS = sphéroïdes cardiaques humains. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figure 3 : Taux de battement et manipulation du calcium dans les CS générés à l’aide de différentes densités d’ensemencement cellulaire. (A) Imagerie en fond clair (à gauche) et mesures de taille (à droite) des CS générées à l’aide de différents nombres de CM-HiPSC. Barre d’échelle, 200 μm. (B) Traces transitoires de calcium représentatives et images accélérées des 2,5K-20K-CS. (C, D) Pourcentage de battement et taux de battement de 2,5K-20K-CS. (E-H) Valeur maximale, temps de montée, temps de désintégration et CTD90 dans les 2.5K-20K-CS. Les données sont moyennes ± écart-type. Réplications biologiques = trois, réplications techniques = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples post hoc de Tukey. Abréviations : CTD = durée transitoire calcique, semaine = semaine, k = x 1 000 cellules, CS = sphéroïdes cardiaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Graphique 4. Effet de la cryoconservation sur la viabilité et la structure des sphéroïdes cardiaques. (A) Représentation schématique de la génération de CS, des biobanques subséquentes et de la décongélation. (B) Test de viabilité cellulaire par cytométrie en flux dans les CS frais et cryoconservés. Comme témoin positif, un traitement avec une solution de Triton-X à 10% pendant 5 minutes a été utilisé. (n = 4 par affection). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. ****p < 0,001; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples post hoc de Tukey. (C) Test de viabilité des cellules calcéine-AM dans les CS frais versus décongelés après 7 jours de culture (n = 15-17 par condition, ****p < 0,001, par test t apparié; barre d’échelle, 200 μm). (D) Coloration représentative en fond clair (à gauche) et immunofluorescence pour l’expression de la α-actinine et de la troponine T dans les CS frais et décongelés. Immunofluorescence: Hoechst (bleu), α-actinine (vert) et troponine T (rouge). Les images fusionnées à droite montrent les stries sarcomères dans les CS. Barre d’échelle, 50 μm. Abréviations : X = jour de décongélation au choix, PI = iodure de propidium, Cal-AM = calcéine-AM, EthD-I = Homodimère d’éthidium I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figure 5 : Transitoires calciques dans les CS frais par rapport aux CS décongelés. (A) Traces transitoires de calcium représentatives et images accélérées des CS avant cryoconservation et 1 semaine après la décongélation. (B) Pourcentage de battement de sphéroïdes cardiaques frais et congelés/décongelés. Les barres représentent des expériences individuelles. (C) Taux de battement des sphéroïdes cardiaques frais et congelés/décongelés. (D-G) Quantification des paramètres transitoires du calcium : valeur de pointe, temps de montée, temps de désintégration et CTD90. Les données sont moyennes ± écart-type. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples post hoc de Tukey. Abréviations; CTD = durée transitoire calcique, CS = sphéroïdes cardiaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Stratégies de points de contrôle représentatifs pour l’analyse de cytométrie en flux. (A) Stratégie de contrôle représentative pour les α-actinines hiPSC-CM positives dans une population pure par rapport au contrôle négatif et au contrôle isotype. Le nombre de cellules analysées positives à la α-actinine est de 25 x 105. Abréviations; SSC = diffusion latérale, PI+ = iodure de propidium positif. (B) Stratégie représentative de points de contrôle pour l’analyse de viabilité à la fois pour le témoin frais, le témoin décongelé, le témoin positif (Triton-X) et le témoin négatif (non coloré). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Un ensemble de protocoles pour la génération et la cryoconservation de sphéroïdes cardiaques (CS) à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme cultivés dans un format multidimensionnel à haut débit est présenté. Ce modèle tridimensionnel fonctionne comme une plate-forme robuste pour la modélisation des maladies, les criblages à haut débit et conserve sa fonctionnalité après cryoconservation.

Génération, criblage à haut débit et biobanque de sphéroïdes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes d’origine humaine

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Ce protocole décrit un flux de travail pour la génération, la maintenance et l’analyse optique des sphéroïdes cardiaques. Ces sphéroïdes cardiaques sont essentiels pour combler les lacunes des modèles actuels de maladies in vitro. Cette technique permet aux chercheurs de créer un criblage et un stockage fonctionnel de nouvelle génération à haut débit des sphéroïdes cardiaques.Commencez par ajouter un millilitre par centimètre carré de solution de décollement cardiaque stérile à chaque puits d’une plaque de culture contenant des cardiomyocytes pluripotents dérivés de cellules souches confluentes induites par l’homme. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Confirmer le détachement des cellules en observant des cellules blanches et rondes sous grossissement 4x d’un microscope à fond clair.À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, dissocier mécaniquement les cellules en les rinçant avec deux millilitres de milieu basal chaud pour préparer une suspension unicellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger pendant trois minutes à 300 g. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de média de replaquage hiPSC-CM.Utilisez un embout de pipette de 1 000 microlitres pour dissocier la pastille de cellule. Après trois ou quatre mélanges, lorsque la solution semble homogène, chargez-la dans une cassette pour compter les cellules et transférez la quantité appropriée de cellules dans 100 microlitres de milieu de placage à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse, à fond rond, à 96 puits. Placez la plaque de sphéroïdes cardiaques sur un agitateur orbital dans l’incubateur à 70 tr / min avec une température de 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, 21% d’oxygène et 90% d’humidité pendant 24 heures.Pour éviter la rupture du sphéroïde, aspirez seulement 50 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de RPMI plus milieu B27 par puits pendant les 48 premières heures. Ensuite, aspirez 100 microlitres du milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres du milieu de maturation par puits. Maintenez les cellules dans le milieu de maturation et rafraîchissez le milieu tous les deux à trois jours.Placer la plaque sphéroïde sur de la glace pendant 10 minutes pour le prérefroidissement avant de centrifuger la plaque pendant trois minutes à 70g. Retirez le milieu jusqu’à ce qu’il reste 50 microlitres dans le puits. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de congélation hiPSC glacé par puits.Scellez la plaque avec un film d’étanchéité de plaque. Pour préparer le moule en silicium, mélangez les composants du kit d’élastomère de silicium dans un rapport de 10 pour 1 et ajoutez la solution à l’intérieur de la partie inférieure de la plaque de puits. Débulez la solution à l’aide d’une pompe à vide pendant 15 à 20 minutes.Placez le moule dans un four et durcissez-le à 60 degrés Celsius pendant huit heures pour obtenir un élastomère semi-flexible qui est décollé de la plaque. Placez soigneusement la plaque scellée dans un moule en silicone, assurant un échange de chaleur uniforme entre la plaque de puits et le congélateur. Congeler la plaque à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures dans le moule en silicone préparé avant de transférer la plaque dans un réservoir d’azote liquide ou un congélateur à 150 degrés Celsius pour un stockage à long terme.Pour assurer une décongélation rapide des sphéroïdes cardiaques, prélevez une plaque cellulaire avec des sphéroïdes cardiaques à la fois à partir de l’azote liquide et placez-la dans l’incubateur pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, contenant 5% de dioxyde de carbone, 21% d’oxygène et 90% d’humidité. Retirez le film d’étanchéité de la plaque et aspirez 150 microlitres de chaque puits avant d’ajouter 200 microlitres d’un milieu basal chaud à chaque puits. Centrifuger la plaque à 70g pendant trois minutes, et répéter le lavage moyen basal chaud.Une fois cela fait, retirez 150 microlitres du milieu et ajoutez 200 microlitres de milieu de décongélation des cardiomyocytes dans chaque puits. Répétez ensuite le lavage RPMI comme mentionné lors de la génération de sphéroïdes cardiaques, puis le maintien des cellules dans le milieu de maturation. Après une semaine de culture, les sphéroïdes cardiaques décongelés sont optimaux pour l’imagerie optique de manipulation du calcium.Aspirer 150 microlitres de chaque puits. Traitez les sphéroïdes cardiaques décongelés avec 100 microlitres de milieu de colorant calcique Cal-520 AM par puits dans des conditions sombres et incuber la plaque pendant 60 minutes. Préparez un système d’acquisition et d’analyse du calcium en alimentant le microscope et en vous assurant que l’option de contrôle environnemental est activée.Ajustez les dimensions de l’ouverture de la caméra et du cadrage pour réduire la zone d’arrière-plan. Pour mesurer le signal de calcium, à l’aide d’un laser de 488 nanomètres, réglez le contraste sur un fond noir avec un signal vert vif pendant la libération de calcium. Enregistrez une vidéo avec un flux constant de 2 à 10 pics en 10 secondes.Enregistrez une vidéo de 10 secondes et balayez la plaque de 96 puits, en vous déplaçant d’abord vers la gauche, puis vers le bas en zigzag pour couvrir toute la plaque. Après avoir acquis les transitoires calciques, analysez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse des traces de fluorescence. Les sphéroïdes cardiaques ont acquis une structure 3D dès le premier jour après l’ensemencement, qui pouvait être cultivée jusqu’à six semaines.La majorité des sphéroïdes cardiaques âgés de trois semaines ont exprimé une organisation régulière du sarcomère avec l’alpha-actinine et la troponine T.Des niveaux élevés d’alpha-actinine chez les sphéroïdes cardiaques du jour zéro et de trois semaines ont indiqué une composition cellulaire constante et très pure pendant la culture. Une expression accrue des gènes cardiaques, des desmosomes et des mitochondries a été observée chez les sphéroïdes que chez les hiPSC-CM cultivés en 2D pendant 90 jours. Le pourcentage de battements de sphéroïdes cardiaques était similaire au cours des trois premières semaines post-génération et a diminué de manière significative au cours de la sixième semaine en raison de la détérioration des sphéroïdes cardiaques.Le taux de battement a été significativement réduit à la troisième semaine par rapport et a diminué à la sixième semaine en raison de la détérioration. Les paramètres transitoires du calcium indiquaient une valeur maximale plus élevée à la deuxième semaine, tandis que le temps de montée, le temps de désintégration et la durée transitoire du calcium à 90% de la désintégration étaient significativement augmentés à la troisième semaine, montrant que les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM étaient fonctionnellement optimaux aux semaines deux et trois après la génération. La taille des sphéroïdes augmentait avec le nombre de cellules utilisées pour l’ensemencement.Chez les vieux sphéroïdes de plus grande taille, les coups étaient significativement plus élevés. Un taux de battement similaire et significativement plus élevé a été montré par les sphéroïdes 5k, 10k et 20k par rapport aux sphéroïdes 2,5k. La cryoconservation n’a pas affecté la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes cardiaques.Une expression similaire des protéines sarcomériques dans les sphéroïdes décongelés et frais appariés à l’âge indiquait une efficacité de cryoconservation. Il n’y avait pas de changement significatif dans le taux de battement des sphéroïdes cardiaques décongelés ou frais. Aucun changement significatif n’a été observé dans le temps de montée, le temps de désintégration et le CTD90 du CS décongelé ou frais. Outre la modélisation de la maladie et les criblages de médicaments à haut débit, ces sphéroïdes peuvent également être utilisés pour les bioréacteurs de production de vésicules extracellulaires et les thérapies liées aux vésicules extracellulaires.En outre, la biobanque de ces sphéroïdes peut être utilisée comme un nouvel approvisionnement en cardiomyocytes pour des stratégies de régénération. L’accumulation de preuves suggère que les biobanques de modèles de cellules souches dérivées de patients pour la fibrose kystique, le cancer et les sphéroïdes cardiaques ont un grand potentiel pour démêler les mécanismes moléculaires pour les dépistages de médicaments et pour la médecine personnalisée.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) pour criblage à haut débit des médicaments antifongiques

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Évaluation de la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes 2D dérivés de cellules souches humaines

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...