Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
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	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Entdeckung von Herzmedikamenten wird durch die Abhängigkeit von nicht-menschlichen Tier- und Zellmodellen mit unzureichendem Durchsatz und physiologischer Genauigkeit behindert, um genaue Messwerte durchzuführen. Die hiPSC-CM-Biologie in Verbindung mit HT-Instrumenten und physiologischen Sonden hat das Potenzial, menschliche Modelle wieder in die frühesten Stadien der Modellierung von Herzerkrankungen und der Wirkstoffforschung einzuführen. Wir haben eine 3D-Methode zur Generierung von Herzgewebe entwickelt, die qualitativ hochwertige und funktionelle CSs für eine optimale Plattform zur Modellierung von Herzerkrankungen und zum Screening von Medikamenten erzeugt. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination der Sphäroidtechnologie in 3D-Bioreaktorsystemen für die industrielle EV-Produktion einen notwendigen Schritt in Richtung klinischer Translation der EV-basierten Therapie. Das hier beschriebene Verfahren beruht auf mehreren entscheidenden Faktoren und ist eine Variante der bestehenden Protokolle 9,10,28,29. Zu diesen Methoden gehören: 1) die Erzeugung von 3D-Gewebekonstrukten, 2) die optimale Zellzahl und das optimale Timing vor dem Screening, 3) die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Hochdurchsatzkapazität der Instrumente und 4) die Möglichkeit, die Sphäroide vor jeder Funktionsanalyse einzufrieren. Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Protokollen beschreibt das vorgeschlagene Protokoll die Erzeugung von bis zu 1.500 Sphäroiden pro Tag und die Eignung für HTS. Die konventionelle Analyse von hundert Verbindungen über 6 x 0,5 logarithmische Dosen für 10 Replikate unter Verwendung bestehender 96-Well-Calcium-Bildgebungssysteme oder 24-Well-Multiplex-Engineering-Herzgewebe erfordert etwa 500 Millionen bis 3 Milliarden hiPSC-CMs31,32. Die vorgeschlagene Anwendung macht Herzscreenings im Vergleich zu den herkömmlichen Systemen kostengünstiger und zeitsparender, da die 96-Well-Platten im Vergleich zur beschriebenen Methode nur 10% der Aussaatdichte benötigten. Darüber hinaus ermöglicht die Erzeugung von Sphäroiden durch Selbstaggregation in ultraniedrigen Befestigungsplatten im Vergleich zu bisherigen Protokollen, wie z. B. der Hanging-Drop-Methode, eine qualitativ hochwertige automatisierte Bildgebung einzelner Mikrogewebe33.
Dieses kleine 3D-Modell ahmt den biologischen und physiologischen Phänotyp der kardiovaskulären Umgebung in vivo nach. Wie bereits gezeigt, nehmen Calcium-Transienten in 3D-Herzgewebekonstrukten im Vergleich zu 2D-Monolayer-Zellkulturen dramatisch zu34.
Als nächstes stellten wir fest, dass die Aussaatdichte und die richtige Kultivierungszeit ebenfalls kritische Faktoren für ein erfolgreiches CS-Screening sind. Die Dichten von 10K-20K hiPSC-CMs pro Sphäroid und das Screening zwischen den Wochen 2-3 nach der Generierung waren optimal, während zu kleine oder zu alte Sphäroide einen gestörten Umgang mit Kalzium zeigen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Daher ist es wichtig, die Aussaatdichte so konstant wie möglich zu halten, da die Größe die Funktionsparameter beeinflusst. Auch wenn diese optische Methode gute Ergebnisse für lebende 3D-Kulturen als ganzes Gewebe liefert, ist es eine Herausforderung, Daten innerhalb größerer Sphäroide auf (sub-)zellulärer Ebene zu erhalten, ohne auf zeitaufwändige histologische Methoden angewiesen zu sein. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze veröffentlicht, die "optisches Clearing" verwenden, das die Erfassung ganzer 3D-Sphäroide mit der Möglichkeit der Einzelzellquantifizierung von Markern ermöglicht. Hier haben wir ein 3-tägiges Protokoll vom CS-Harvesting auf die Bildanalyse angepasst, das für die 3D-Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie29 optimiert ist (Abbildung 1C und Abbildung 4D).
Schließlich steigt mit der Zunahme von 3D-Herzgewebeanwendungen und kommerziellen Anwendungen die Nachfrage nach Langzeitlagerung und patientenspezifischem Biobanking von verschiedenen Spendern. Die Kryokonservierung ist eine effektive Strategie, um HTS-Platten aus mehreren Chargen im Laufe der Zeit zu erzeugen. Das Einfrieren von hiPSC-CMs wurde bereits beschrieben und unterscheidet sich nicht von anderen kultivierten Zelltypen 10,35,36. Kürzlich wurden Ansätze zum Einfrieren von Platten mit 2D-Zellen beschrieben37. Hier stellten wir fest, dass das PSC-Kryokonservierungskit im Vergleich zu drei anderen (Daten nicht gezeigt) den optimalsten Zustand aufweist und dieses Medium für das effiziente Einfrieren von Sphäroiden verwendete. Nach der Kryokonservierung bleibt die Lebensfähigkeit hoch (Abbildung 4B, C), aber die elektrophysiologischen Eigenschaften der CSs werden beeinträchtigt und eine Inkubationszeit nach dem Auftauen ist erforderlich. Tatsächlich zeigten die CSs 1 Woche nach dem Auftauen eine spontane Schlagaktivität und einen Umgang mit Kalzium. Es wurde jedoch beschrieben, dass frische und wiedergewonnene hiPSC-CMs nicht immer identische molekulare und physiologische Eigenschaften aufweisen38. Diese Einschränkung muss berücksichtigt werden, wenn kryokonservierte hiPSC-CMs zur Beurteilung arzneimittelinduzierter kardialer Messwerte verwendet werden. Obwohl wir die Anzahl der Zellen pro Sphäroid und das optimale Timing der transienten Calcium-Bildgebung effektiv modulieren, könnten die kardialen Sphäroide verbessert werden, indem hiPSC-abgeleitete Kardiomyozytenzellen mit Endothelzellen, Fibroblasten, Zell-Zell-Verbindungen und extrazellulären Matrizen wie Chitosan, Kollagen IV, Fibronektin, Matrigel oder Laminin gemischt werden, die die in vivo Herzumgebung nachahmen39. 40. Sonstiges Insgesamt schlagen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur effizienten Generierung von CSs vor, die für nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und HT-Wirkstoffscreening geeignet sind.

Die Entdeckung von human-induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) bot beispiellose Möglichkeiten, die menschliche Entwicklung und Krankheit auf zellulärer Ebene zu untersuchen. In den letzten zehn Jahren wurden unter Verwendung von Entwicklungslektionen verschiedene Protokolle etabliert, um die effiziente Differenzierung von hiPS-Zellen in Kardiomyozyten (CMs) sicherzustellen1,2,3,4. hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) können als Ressource für die Modellierung genetisch vererbbarer kardiovaskulärer Erkrankungen (CVDs), die Prüfung der kardialen Sicherheit für neue Medikamente und kardiale regenerative Strategien dienen 5,6,7,8. Trotz der gezielten kardialen Differenzierung von hiPS-Zellen bleiben unbestimmte CM-Zahlen eine Herausforderung im kardialen Bereich, da gereifte hiPSC-CMs im Allgemeinen nicht proliferativ sind und primäre menschliche Zellen nicht in großen Mengen verfügbar sind.
Kürzlich haben wir beschrieben, dass die gleichzeitige Aktivierung des Wnt-Signalwegs mit einer Kultur mit niedriger Zelldichte zu einer massiven proliferativen Reaktion (bis zu 250-fach) von hiPSC-CMs 9,10 führte. Diese kostengünstige Strategie zur massiven Expansion von hiPSC-CMs durch serielles Passaging im Kulturkolbenformat erleichtert die Standardisierung und Qualitätskontrolle einer großen Anzahl funktionaler hiPSC-CMs. Um mit der Nachfrage nach großen Chargen von hiPSC-CMs von verschiedenen Spendern Schritt zu halten, wurde außerdem das Biobanking von hiPSC-CMs beschrieben10. Kardiomyozyten-Monoschichten, die in diesen Standardkulturschalen ausgesät werden, sind jedoch nicht repräsentativ für die komplexe 3D-Struktur im Herzen. Darüber hinaus ist die Unreife von hiPSC-CMs nach wie vor ein Hindernis, so dass der biologische und physiologische Phänotyp der kardiovaskulären Umgebung in vivo nicht nachgeahmt werden kann.
Es wurden neuartige 3D-In-vitro-Modelle entwickelt, bei denen hiPSC-CMs ein näheres physiologisches Verhalten zeigen, wie z. B. Selbstorganisation 11,12, Umbau der extrazellulären Matrix (EZM) 13, verbesserte Reifung 14,15,16 und synchronisierte Kontraktion17,18,19 . 3D-Modelle wurden für die Arzneimittelforschung, Kardiotoxizitätstests von Arzneimitteln, die Modellierung von Krankheiten, regenerative Therapien und sogar die ersten klinischen Studien verwendet 20,21,22,23,24. Eines der am häufigsten verwendeten Modelle ist das Fibrin-basierte technische Herzgewebe (EHT), das eine gewebeähnliche Anordnung und kardiale Kontraktilität aufweist13,17,25. Zuvor haben wir gezeigt, dass EHTs, die aus expandierten hiPSC-CMs generiert wurden, eine vergleichbare Kontraktilität aufwiesen wie solche aus nicht expandierten hiPSC-CMs, was eine unbeeinträchtigte zelluläre Funktionalität nach der Expansion9 zeigte. Obwohl die Generierung von EHTs aus hiPSC-CMs gut etabliert ist, werden weitere Entwicklungen im Hinblick auf die Etablierung einer HT-Bewertungsplattform erwartet. Hier ermöglicht die schnelle Erzeugung einer großen Anzahl von selbstaggregierenden kardialen Sphäroiden (CSs) im 96-Well-Format eine Verbesserung der 3D-Bedingungen für Hochdurchsatz-Screening-Zwecke (HTS).
Insgesamt liegt der Vorteil von CSs als 3D-Zellkultur in ihrer hohen Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit. Insbesondere können CSs in Kombination mit der robotergestützten Probenhandhabung die CS-Kultur, die Arzneimittelbehandlung und die High-Content-Analyse standardisieren und automatisieren20. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Erzeugung hochreiner und qualitativ hochwertiger CSs, die effizient kryokonserviert und auf Herzfunktion untersucht werden können, indem Ca2+ transiente Messungen mit einem optischen Kalziumerfassungs- und -analysesystem durchgeführt werden. Dieses Modell bietet ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug zur Durchführung von Hochdurchsatz-Sieben auf Hunderten bis Tausenden von Sphäroiden17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) sind von größter Bedeutung für die Modellierung und Therapie menschlicher Herzerkrankungen. Wir haben kürzlich eine kostengünstige Strategie für den massiven Ausbau von hiPSC-CMs in zwei Dimensionen (2D) veröffentlicht. Zwei wesentliche Einschränkungen sind die Unreife der Zellen und die mangelnde dreidimensionale (3D) Anordnung und Skalierbarkeit in Hochdurchsatz-Screening-Plattformen (HTS). Um diese Einschränkungen zu überwinden, bilden die expandierten Kardiomyozyten eine ideale Zellquelle für die Erzeugung von 3D-Herzzellkulturen und Tissue-Engineering-Techniken. Letzteres birgt ein großes Potenzial im kardiovaskulären Bereich und bietet fortschrittlichere und physiologisch relevantere HTS. Hier beschreiben wir einen HTS-kompatiblen Workflow mit einfacher Skalierbarkeit für die Generierung, Wartung und optische Analyse von kardialen Sphäroiden (CSs) in einem 96-Well-Format. Diese kleinen CSs sind unerlässlich, um die Lücke zu schließen, die in aktuellen In-vitro-Krankheitsmodellen und/oder -generierungen für 3D-Tissue-Engineering-Plattformen vorhanden ist. Die CSs weisen eine stark strukturierte Morphologie, Größe und zelluläre Zusammensetzung auf. Darüber hinaus zeigen hiPSC-CMs, die als CSs kultiviert werden, eine erhöhte Reifung und mehrere funktionelle Merkmale des menschlichen Herzens, wie z. B. spontane Kalziumbehandlung und kontraktile Aktivität. Durch die Automatisierung des gesamten Arbeitsablaufs, von der Erstellung der CSs bis zur Funktionsanalyse, erhöhen wir die Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Chargen, wie die Hochdurchsatz-Bildgebung (HT) und die Analyse des Kalziumhandlings zeigen. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Modellierung von Herzerkrankungen und die Bewertung von Arzneimittel-/Therapiewirkungen auf Einzelzellebene innerhalb einer komplexen 3D-Zellumgebung in einem vollautomatischen HTS-Workflow. Darüber hinaus beschreibt die Studie ein einfaches Verfahren zur Langzeitkonservierung und zum Biobanking von ganzen Sphäroiden, das Forschern die Möglichkeit bietet, funktionelle Gewebespeicher der nächsten Generation zu schaffen. HTS wird in Kombination mit der Langzeitlagerung einen wesentlichen Beitrag zur translationalen Forschung in einer Vielzahl von Bereichen leisten, darunter die Entdeckung und Erprobung von Arzneimitteln, die regenerative Medizin und die Entwicklung personalisierter Therapien.

Das in Abbildung 1A gezeigte Protokoll beschreibt die Generierung von CSs aus zuvor erweiterten hiPSC-CMs. Die CSs erhalten am Tag 1 nach der Aussaat eine 3D-Struktur in Rundbodenplatten mit extrem niedriger Befestigung und können bis zu 6 Wochen lang kultiviert werden (Abbildung 1B). Wie durch Immunfluoreszenzfärbung beurteilt, exprimierte die Mehrheit der Zellen in 3 Wochen alten CSs sarkomere Proteine wie α-Actinin und Troponin T und zeigte eine regelmäßige Sarkomerorganisation (Abbildung 1C). Für die Quantifizierung von α-Actinin-positiven Zellen wurde eine Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenz zeigten die Durchflusszytometriedaten vergleichbar hohe α-Actinin-Spiegel sowohl an Tag 0 (76,9 % ± 16,6 %) als auch bei 3 Wochen alten CSs (71,1 % ± 22,7 %) (Abbildung 1D), was auf eine konstante und hochreine Zellzusammensetzung während der Kultivierung hinweist. Es gab eine erhöhte Expression der kardialen Gene für Verbindungen (GJA1, JPH2 und PKP2), Desmosomen (DES) und Mitochondrien (ATP5A) in hiPSC-CM-abgeleiteten Sphäroiden (Tag 42) im Vergleich zu hiPSC-CMs, die 90 Tage lang in 2D kultiviert wurden (Abbildung 1E). Die Expression dieser Gene ist ein Kennzeichen der Zell-Zell-Interaktion und -Reifung30.
Anschließend wurden die funktionellen Eigenschaften von CSs, nämlich die Schlagrate und das Ca2+ Handling, zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet (Abbildung 2). Calcium-Transientenparameter wie Anstiegszeit, Spitzenzeit, Abklingzeit und Calcium-Transientendauer (CTD90) wurden wie in Abbildung 2A, B dargestellt bewertet. Der Prozentsatz der schlagenden CSs ist in den ersten 3 Wochen nach der Generierung ähnlich, fiel jedoch in Woche 6 (Wk6) CSs signifikant ab (Abbildung 2C). Die Schlagrate war bei Wk3 im Vergleich zu Wk1 signifikant reduziert und fiel, ähnlich wie der Prozentsatz der schlagenden CSs, bei Wk6 dramatisch ab (Abbildung 2D). Bei Wk6 wurde eine Verschlechterung der CS beobachtet, was den Rückgang sowohl der Schlagrate als auch der Anzahl der schlagenden CSs erklären kann. Die Messung der transienten Calciumparameter zeigte einen signifikant höheren Spitzenwert bei Wk2 (Abbildung 2E), während die Anstiegszeit, die Abklingzeit und CTD90 bei Wk3 im Vergleich zu Wk1 signifikant erhöht waren (Abbildung 2F-H ). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass hiPSC-CM-abgeleitete Sphäroide etwa 2 und 3 Wochen nach der Generierung funktionell optimal sind.
Abbildung 3 zeigt den Einfluss der Sphäroidgröße auf die Schlagrate und den Umgang mit Kalzium. CSs wurden durch Aussaat von 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 und 20 x 10 4 hiPSC-CMs in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte für insgesamt 24 CSs/Vertiefungen pro Bedingung erzeugt (Abbildung 3A). Wie erwartet, nahm die Sphäroidgröße mit zunehmender Anzahl der verwendeten Zellen zu und reichte von 178 ± 36 μm bis 351 ± 65 μm (Abbildung 3A, rechtes Bild). Ca2+ Transienten wurden in 3 Wochen alten CSs bei den vier verschiedenen Seedingdichten gemessen (Abbildung 3B). Messungen der schlagenden CSs zeigten, dass nur etwa 50% der kleineren Größen-CSs (2,5K- und 5K-CSs) schlugen, während der Prozentsatz der größeren CSs (10K- und 20K-CSs) signifikant höher war (etwa 85%) (Abbildung 3C). Eine ähnliche Schlagrate (ca. 28 bpm) wurde von 5K-, 10K- und 20K-CSs gezeigt, die im Vergleich zu 2,5K-CSs signifikant höher war (Abbildung 3D). Die Spitzenwerte der Kalziumbilder waren unter allen getesteten Bedingungen ähnlich (Abbildung 3E), jedoch waren die Anstiegszeit (Abbildung 3F), die Abklingzeit (Abbildung 3G) und CTD90 (Abbildung 3H) bei größeren CSs (10K- und 20K-CSs) im Vergleich zu den kleineren (2,5K- und 5K-CSs) signifikant erhöht. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass hiPSC-CM-abgeleitete Sphäroide optimal für das Calcium-Handling-Screening sind, wenn eine Seeding-Dichte zwischen 10K- und 20K-hiPSC-CMs/Well verwendet wird.
Als nächstes bewerteten wir die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Lebensfähigkeit und Funktion von CS. Vor der Analyse wurden aufgetaute CSs 1 Woche lang in Kultur gehalten (Abbildung 4A). Wie sowohl die Durchflusszytometrie (Abbildung 4B) als auch die Calcein-AM (Abbildung 4C) Zellviabilitätstests zeigten, hatte die Kryokonservierung keinen Einfluss auf die Zellviabilität innerhalb der CSs. Darüber hinaus zeigten aufgetaute CSs ähnliche Expressionsniveaus von sarkomeren Proteinen im Vergleich zu den frischen, altersangepassten CSs (Abbildung 4D). Diese Daten deuten darauf hin, dass CSs für die anschließende Herzfunktionsanalyse und das Hochdurchsatz-Screening effizient kryokonserviert werden können.
Schließlich wurden die Schlagaktivität und dasCa2+-Handling sowohl in frischen als auch in kryokonservierten CSs gemessen (Abbildung 5). Der Prozentsatz der schlagenden CSs wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auftauen nach 2, 5 bzw. 7 Tagen gemessen. Während die meisten frischen CSs im Laufe der Zeit eine schlagende Aktivität zeigten, benötigten die kryokonservierten CSs eindeutig bis zu 1 Woche Kultivierung, um ihre schlagende Aktivität wiederherzustellen (Abbildung 5B). Es gab keine signifikante Veränderung in der Schlagrate von aufgetauten CSs im Vergleich zu frischen; Bei einigen eingefrorenen CSs wurde jedoch keine spontane Schlagaktivität beobachtet (Abbildung 5C). Obwohl die Spitzenwerte in gefrorenen/aufgetauten CSs im Vergleich zu frischen signifikant reduziert waren (Abbildung 5D), wurden keine signifikanten Veränderungen in der Anstiegszeit, der Abklingzeit und dem CTD90 von gefrorenen/aufgetauten CSs im Vergleich zu frischen (Abbildung 5E-G) beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass es wichtig ist, die CSs nach dem Auftauen mindestens 1 Woche im Inkubator erholen zu lassen, bevor die Schlagaktivität und der vorübergehende Ca2+ gemessen werden.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Kryokonservierung von hiPSC-CM-abgeleiteten Sphäroiden die Lebensfähigkeit der Kardiomyozyten, die sarkomere Struktur und ihre funktionellen Eigenschaften wie spontane Schlagaktivität und Kalziumhandhabung bewahrt. Daher stellen hiPSC-CM-abgeleitete Sphäroide ein geeignetes Modell dar, um die kardiale Elektrophysiologie in vitro genau zu rekapitulieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Abbildung 1: Erzeugung von kardialen Sphäroiden . (A) Schematische Darstellung der Wnt-basierten gerichteten kardialen Differenzierung, der anschließenden Expansion von hiPSC-CMs und der Generierung von CSs. Erstellt mit biorender.com. (B) Hellfeldbilder zu verschiedenen Zeitpunkten der CS-Kultivierung. Maßstabsleiste, 200 μm. Wk steht für Woche. (C) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder für kardiale Sarkomerproteine α-Actinin und Troponin T in 3 Wochen alten CSs. Immunfluoreszenz: Hoechst (blau), α-Actinin (grün) und Troponin T (rot). Maßstabsleiste, 200 μm. Das vergrößerte zusammengeführte Bild auf der rechten Seite zeigt die Sarkomer-Organisation. Maßstabsbalken, 50 μm. (D) Durchflusszytometrische Quantifizierung von α-Actinin-positiven Zellen vor (Tag 0) und 3 Wochen nach der Bildung von CSs. (n = 14-23 pro Bedingung. (E) RT-qPCR, die an hiPSC-CMs durchgeführt wurde, die 90 Tage lang kultiviert wurden (2D), und an Sphäroidproben, die 42 Tage lang kultiviert wurden, um die Expressionsniveaus verschiedener kardialer Gene zu bestimmen, die mit Zellverbindungen, intermediären Filamenten und Mitochondrien in Verbindung stehen. (n = 1-3 Chargen). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. NS (nicht signifikant), berechnet durch einen ungepaarten t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Abbildung 2: Schlagrate und Calcium-Handling in CSs in verschiedenen Wochen nach der Generierung. (A) Beispiele für transiente Calcium-Parameter, die vom Vala Sciences-Analysealgorithmus in der Cyteseer-Software berechnet wurden. (B) Repräsentative Calcium-Transientenspuren und Zeitrafferbilder der CSs zu verschiedenen Zeitpunkten (Wochen) nach der Erzeugung. Maßstabsbalken, 200 μm. (C) Die zeitliche Quantifizierung der spontanen Schlagaktivität wird als Prozentsatz der schlagenden CSs ausgedrückt. (D) Die Taktrate der CSs während der Kultivierungszeit. (E-H) Quantifizierung der Calcium-Transienten mit Spitzenwert, Anstiegszeit, Abklingzeit und CTD90. Bei den angegebenen Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SD. Biologische Replikate = drei, technische Replikate = 38, 50, 66 bzw. 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. Abkürzungen; CTD = Calcium-Transientendauer, Wk = Woche, CSs = humane Herzsphäroide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Abbildung 3: Schlagrate und Calcium-Handling in CSs, die mit unterschiedlichen Zellimpfdichten erzeugt wurden. (A) Hellfeld-Bildgebung (links) und Größenmessungen (rechts) von CSs, die mit einer unterschiedlichen Anzahl von hiPSC-CMs erzeugt wurden. Maßstabsbalken, 200 μm. (B) Repräsentative Calcium-Transientenspuren und Zeitrafferaufnahmen der 2,5K-20K-CSs. (C,D) Schlagprozentsatz und Schlagrate von 2.5K-20K-CSs. (E-H) Spitzenwert, Anstiegszeit, Abklingzeit und CTD90 in 2,5K-20K-CSs. Die Daten sind Mittelwerte ± SD. Biologische Replikate = drei, technische Replikate = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. Abkürzungen: CTD = Calcium Transient Duration, Wk = Woche, k = x 1.000 Zellen, CSs = kardiale Sphäroide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Abbildung 4. Wirkung der Kryokonservierung auf die Lebensfähigkeit und Struktur von kardialen Sphäroiden. (A) Schematische Darstellung der CS-Generierung, des anschließenden Biobankings und des Auftauens. (B) Durchflusszytometrie-Zellviabilitätstest sowohl in frischen als auch in kryokonservierten CSs. Als Positivkontrolle wurde eine Behandlung mit 10% Triton-X-Lösung für 5 min verwendet. (n = 4 pro Bedingung). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ** **p < 0,001; Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (C) Calcein-AM-Zellviabilitätstest in frischen versus aufgetauten CSs nach 7 Tagen Kultivierung (n = 15-17 pro Bedingung, ** **p < 0,001, durch gepaarten t-Test; Maßstabsbalken, 200 μm). (D) Repräsentative Hellfeld- (links) und Immunfluoreszenzfärbung für die α-Actinin- und Troponin-T-Expression in frischen und aufgetauten CSs. Immunfluoreszenz: Hoechst (blau), α-Actinin (grün) und Troponin T (rot). Die zusammengeführten Bilder auf der rechten Seite zeigen Sarkomer-Streifen in den CSs. Maßstabsleiste, 50 μm. Abkürzungen: X = Wunschtautag, PI = Propidiumiodid, Cal-AM = Calcall-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Abbildung 5: Calcium-Transienten in frischen versus aufgetauten CSs. (A) Repräsentative Calcium-Transientenspuren und Zeitrafferbilder der CSs vor der Kryokonservierung und 1 Woche nach dem Auftauen. (B) Schlagprozentsatz von frischen und gefrorenen/aufgetauten Herzsphäroiden. Balken stellen einzelne Experimente dar. (C) Schlagrate von frischen und gefrorenen/aufgetauten Herzsphäroiden. (D-G) Quantifizierung von transienten Calciumparametern: Spitzenwert, Anstiegszeit, Abklingzeit und CTD90. Die Daten sind Mittelwert ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. Abkürzungen; CTD = Calcium-Transientendauer, CSs = kardiale Sphäroide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategien für die Durchflusszytometrie-Analyse. (A) Repräsentative Gating-Strategie für α-Actinin-positive hiPSC-CMs in einer reinen Population versus Negativkontrolle und Isotypkontrolle. Die Anzahl der α-Actinin-positiv analysierten Zellen beträgt 25 x 105. Abkürzungen; SSC = Seitenstreuung, PI+ = Propidiumiodid positiv. (B) Repräsentative Gating-Strategie für die Viabilitätsanalyse sowohl in der frischen, aufgetauten, der Positivkontrolle (Triton-X) als auch in der Negativkontrolle (ungefärbt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Hier wird eine Reihe von Protokollen für die Erzeugung und Kryokonservierung von kardialen Sphäroiden (CSs) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten vorgestellt, die in einem multidimensionalen Hochdurchsatzformat kultiviert wurden. Dieses dreidimensionale Modell fungiert als robuste Plattform für die Modellierung von Krankheiten, Hochdurchsatz-Screenings und behält seine Funktionalität nach der Kryokonservierung bei.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf für die Erzeugung, Pflege und optische Analyse von kardialen Sphäroiden. Diese kardialen Sphäroide sind unerlässlich, um die Lücke in aktuellen In-vitro-Krankheitsmodellen zu schließen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Hochdurchsatz-Screening und funktionelle Speicherung von Herzsphäroiden der nächsten Generation zu entwickeln.Beginnen Sie mit der Zugabe von einem Milliliter pro Quadratzentimeter steriler Herzablösungslösung zu jeder Vertiefung einer Kulturplatte, die konfluente, vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten enthält. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie die Ablösung der Zellen, indem Sie weiße und runde Zellen unter 4-facher Vergrößerung eines Hellfeldmikroskops beobachten.Dissoziieren Sie die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mechanisch, indem Sie sie mit zwei Millilitern warmem Basalmedium spülen, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 300 g. Dann saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter hiPSC-CM-Beschichtungsmedium.Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Zellpellet zu dissoziieren. Laden Sie die Lösung nach drei oder vier Mischungen, wenn sie homogen erscheint, in eine Kassette, um die Zellen zu zählen, und übertragen Sie die entsprechende Menge an Zellen in 100 Mikrolitern Überzugsmedium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und rundem Boden. Legen Sie die kardiale Sphäroideplatte 24 Stunden lang bei 70 U/min bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 21 % Sauerstoff und 90 % Luftfeuchtigkeit auf einen Orbitalschüttler im Inkubator.Um einen Sphäroidbruch zu vermeiden, saugen Sie nur 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie in den ersten 48 Stunden 100 Mikroliter RPMI plus B27-Medium pro Vertiefung hinzu. Als nächstes saugen Sie 100 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung ab und fügen 100 Mikroliter des Reifungsmediums pro Vertiefung hinzu. Halten Sie die Zellen im Reifemedium und erfrischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.Legen Sie die Sphäroidplatte zum Vorkühlen 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie die Platte drei Minuten lang bei 70 g zentrifugieren. Entfernen Sie das Medium, bis 50 Mikroliter im Brunnen verbleiben. Fügen Sie dann 200 Mikroliter eiskaltes hiPSC-Gefriermedium pro Vertiefung hinzu.Versiegeln Sie die Platte mit einer Plattenschweißfolie. Um die Siliziumform vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten des Siliziumelastomer-Kits in einem Verhältnis von 10 zu 1 und fügen Sie die Lösung in den unteren Teil der Well-Platte hinzu. Entblasen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe für 15 bis 20 Minuten.Legen Sie die Form in einen Ofen und härten Sie sie acht Stunden lang bei 60 Grad Celsius aus, um ein halbflexibles Elastomer zu erhalten, das von der Platte abgezogen wird. Legen Sie die versiegelte Platte vorsichtig in eine Silikonform, um einen gleichmäßigen Wärmeaustausch zwischen der Wellplatte und dem Gefrierschrank zu gewährleisten. Frieren Sie die Platte bei 80 Grad Celsius für mindestens vier Stunden in der vorbereiteten Silikonform ein, bevor Sie die Platte zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank oder einen 150 Grad Celsius-Gefrierschrank überführen.Um ein schnelles Auftauen der Herzsphäroide zu gewährleisten, sammeln Sie jeweils eine Zellplatte mit Herzsphäroiden aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator mit 5% Kohlendioxid, 21% Sauerstoff und 90% Feuchtigkeit. Entfernen Sie die Versiegelungsfolie von der Platte und saugen Sie 150 Mikroliter jeder Vertiefung ab, bevor Sie 200 Mikroliter eines warmen Basalmediums in jede Vertiefung geben. Zentrifugieren Sie den Teller drei Minuten lang bei 70 g und wiederholen Sie die warme Grundwäsche.Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie 150 Mikroliter des Mediums und fügen Sie 200 Mikroliter Kardiomyozyten-Auftaumedium in jede Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie dann die RPMI-Wäsche wie erwähnt während der kardialen Sphäroidgenerierung, gefolgt von der Aufrechterhaltung der Zellen im Reifungsmedium. Nach einer Woche der Kultur sind die aufgetauten Herzsphäroide optimal für die optische Bildgebung mit Kalzium.Saugen Sie 150 Mikroliter von jeder Vertiefung ab. Behandeln Sie die aufgetauten Herzsphäroide mit 100 Mikrolitern Cal-520 AM Calciumfarbstoff pro Vertiefung unter dunklen Bedingungen und inkubieren Sie die Platte 60 Minuten lang. Bereiten Sie ein Kalziumerfassungs- und -analysesystem vor, indem Sie das Mikroskop mit Strom versorgen und sicherstellen, dass die Umgebungskontrolloption aktiviert ist.Passen Sie die Abmessungen der Kamera und der Blende an, um den Hintergrundbereich zu minimieren. Um das Kalziumsignal mit einem 488-Nanometer-Laser zu messen, stellen Sie den Kontrast während der Kalziumfreisetzung auf einen schwarzen Hintergrund mit einem hellgrünen Signal ein. Nehmen Sie innerhalb von 10 Sekunden ein Video mit einem konsistenten Strom von 2 bis 10 Spitzen auf.Nehmen Sie ein 10-Sekunden-Video auf und scannen Sie über die 96-Well-Platte, wobei Sie sich zunächst nach links und dann im Zickzack nach unten bewegen, um die gesamte Platte abzudecken. Nachdem Sie die Kalziumtransienten erfasst haben, analysieren Sie die Daten mit einer Software zur Analyse von Fluoreszenzspuren. Die kardialen Sphäroide erhielten am ersten Tag nach der Aussaat eine 3D-Struktur, die bis zu sechs Wochen lang kultiviert werden konnte.Die Mehrzahl der drei Wochen alten kardialen Sphäroide exprimierte eine reguläre Sarkomerorganisation mit Alpha-Actinin und Troponin T. Hohe Alpha-Actinin-Spiegel in den am Tag null und drei Wochen alten Herzsphäroiden deuteten auf eine konstante und hochreine Zellzusammensetzung während der Kultivierung hin. Eine erhöhte Expression der kardialen Gene, Desmosomen und Mitochondrien wurde in Sphäroiden beobachtet als in hiPSC-CMs, die 90 Tage lang in 2D kultiviert wurden. Der Schlagprozentsatz der Herzsphäroide war in den ersten drei Wochen nach der Generierung ähnlich und fiel in der sechsten Woche aufgrund der Verschlechterung der Herzsphäroide signifikant ab.Die Schlagrate war in der dritten Woche im Vergleich signifikant reduziert und sank in der sechsten Woche als Folge der Verschlechterung. Die transienten Calciumparameter zeigten in der zweiten Woche einen höheren Spitzenwert an, während die Anstiegszeit, die Zerfallszeit und die transiente Calciumdauer bei 90% des Zerfalls in der dritten Woche signifikant erhöht waren, was zeigt, dass hiPSC-CM-abgeleitete Sphäroide in den Wochen zwei und drei nach der Generierung funktionell optimal waren. Die Sphäroidgröße nahm mit der Anzahl der Zellen zu, die für die Aussaat verwendet wurden.Bei größeren, alten Sphäroiden war der Schlag deutlich höher. Eine ähnliche und signifikant höhere Schlagrate wurde von 5k-, 10k- und 20k-Sphäroiden im Vergleich zu 2,5k-Sphäroiden gezeigt. Die Kryokonservierung hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der kardialen Sphäroide.Eine ähnliche Expression von sarkomeren Proteinen in den aufgetauten und frischen, altersangepassten Sphäroiden deutete auf eine Kryokonservierungseffizienz hin. Es gab keine signifikante Veränderung in der Schlagrate von aufgetauten oder frischen Herzsphäroiden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der Anstiegszeit, der Abklingzeit und dem CTD90 von aufgetautem oder frischem CS beobachtet. Neben der Modellierung von Krankheiten und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings können diese Sphäroide auch für Bioreaktoren der extrazellulären Vesikelproduktion und extrazelluläre Vesikeltherapien eingesetzt werden.Das Biobanking dieser Sphäroide kann auch als neuartige Kardiomyozytenversorgung für regenerative Strategien genutzt werden. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass Biobanken von Stammzellmodellen von Patienten für Mukoviszidose, Krebs und kardiale Sphäroide ein großes Potenzial für die Entschlüsselung molekularer Mechanismen für Arzneimittelscreenings und für die personalisierte Medizin haben.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluierung der kardialen Kontraktilitätsmodulationstherapie in 2D-Kardiomyozyten aus humanen Stammzellen

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...