Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

ברצוננו להכיר במדעי VALA עבור חבילת התוכנה Cyteseer ואופטימיזציה של ניתוח הסידן התלת-ממדי האוטומטי. ברצוננו להכיר בתמיכה במענק מקרן PLN (RM). P.A.D. ו- F.S. נתמכים על ידי CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. נתמך על ידי H2020-EVICARE (#725229) של מועצת המחקר האירופית (ERC). J.W.B. נתמך על ידי UMC Utrecht Clinical Fellowship, מלגת מכון הלב ההולנדי ומענק הכישרונות הצעירים CVON-Dosis; קרן הלב ההולנדית (CVON-Dosis 2014-40). N.C. נתמכת על ידי תוכנית הכבידה "חומרים מונעים רגנרציה" על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (RegmedXB #024.003.013), ופעולות מארי סקלודובסקה-קירי (הסכם מענק RESCUE #801540). V.S.-P. נתמך על ידי קרן הברית (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. נתמכת על ידי הפרויקט BRAVE במימון האיחוד האירופי (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

גילוי תרופות לבביות נפגע על ידי הסתמכות על מודלים לא אנושיים של בעלי חיים ותאיים עם תפוקה לא מספקת ונאמנות פיזיולוגית לביצוע מדויק של קריאות. לביולוגיה של hiPSC-CM בשילוב עם מכשור HT ובדיקות פיזיולוגיות יש פוטנציאל להציג מחדש מודלים אנושיים לשלבים המוקדמים ביותר של מודלים של מחלות לב וגילוי תרופות. פיתחנו שיטה תלת ממדית לייצור רקמת לב המייצרת CSs איכותיים ופונקציונליים למידול אופטימלי של מחלות לב ופלטפורמת סינון תרופות. בנוסף, שילוב טכנולוגיית הספרואידים במערכות ביוריאקטורים תלת-ממדיות לייצור תעשייתי של רכב חשמלי מאפשר צעד הכרחי לקראת תרגום קליני של טיפול מבוסס EV. השיטה המתוארת כאן מסתמכת על מספר גורמים מכריעים והיא גרסה של פרוטוקולים קיימים 9,10,28,29. שיטות אלה כוללות: 1) יצירת מבנים רקמתיים תלת-ממדיים, 2) מספר התאים האופטימלי והתזמון לפני ההקרנה, 3) שיפור הרגישות ויכולת התפוקה הגבוהה של מכשירים, ו-4) היכולת להקפיא את הספרואידים לפני כל ניתוח פונקציונלי. בניגוד לפרוטוקולים שתוארו בעבר, הפרוטוקול המוצע מתאר ייצור של עד 1,500 ספרואידים ליום ואת ההתאמה ל-HTS. ניתוח קונבנציונלי של מאה תרכובות מעל 6 x 0.5 מנות יומן עבור 10 עותקים משוכפלים באמצעות מערכות הדמיית סידן קיימות של 96 בארות או רקמות לב מהונדסות מרובות 24 בארות דורש כ 500 מיליון עד 3 מיליארד hiPSC-CMs31,32. היישום המוצע הופך את בדיקות הלב לפחות יקרות ויעילות בזמן בהשוואה למערכות הקונבנציונליות, שכן לוחות 96 בארות דרשו רק 10% מצפיפות הזריעה בהשוואה לשיטה המתוארת. יתר על כן, בהשוואה לפרוטוקולים קודמים, כגון שיטת הטיפה התלויה, יצירת ספרואידים על ידי צבירה עצמית בלוחות חיבור נמוכים במיוחד מאפשרת הדמיה אוטומטית באיכות גבוהה של מיקרו-רקמות בודדות33.
מודל תלת-ממדי קטן זה מחקה את הפנוטיפ הביולוגי והפיזיולוגי של הסביבה הקרדיווסקולרית in vivo . כפי שהוכח בעבר, מעברי סידן גדלים באופן דרמטי במבנים תלת-ממדיים של רקמת לב בהשוואה לתרביות תאים חד-שכבתיות דו-ממדיות34.
לאחר מכן, מצאנו כי צפיפות הזריעה וזמן גידול נכון הם גם גורמים קריטיים לסינון מוצלח של ניתוח קיסרי. הצפיפות של 10K-20K hiPSC-CMs לכל ספרואיד והבדיקות בין שבועות 2-3 לאחר הדור היו אופטימליות, בעוד שספרואידים קטנים מדי או ישנים מדי מראים טיפול בסידן מופרע (איור 2 ואיור 3). לכן, חשוב לשמור על צפיפות זריעה עקבית ככל האפשר, שכן הגודל משפיע על הפרמטרים הפונקציונליים. כמו כן, למרות ששיטה אופטית זו מספקת תוצאות טובות עבור תרביות תלת-ממדיות חיות כרקמה שלמה, השגת נתונים בתוך ספרואידים גדולים יותר ברמה (תת-תאית) תאית היא מאתגרת מבלי להסתמך על שיטות היסטולוגיה הגוזלות זמן. לאחרונה פורסמו מספר גישות המשתמשות ב"ניקוי אופטי", המאפשר רכישת ספרואידים תלת-ממדיים שלמים עם אפשרות לכימות חד-תאי של סמנים. כאן, התאמנו פרוטוקול של 3 ימים מקצירת CS לניתוח תמונה, אשר מותאם להדמיה תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי29 (איור 1C ואיור 4D).
לבסוף, עם הגידול ביישומי רקמת לב תלת-ממדית וביישומים מסחריים, הביקוש לאחסון לטווח ארוך ולביו-בנקאות ספציפית למטופל מתורמים שונים עולה. שימור בהקפאה היא אסטרטגיה יעילה ליצירת לוחות HTS מאצוות מרובות לאורך זמן. הקפאה של hiPSC-CMs תוארה בעבר ואינה שונה בהשוואה לסוגי תאים אחרים בתרבית 10,35,36. לאחרונה תוארו גישות להקפאת לוחות עם תאים דו-ממדיים37. כאן, מצאנו שערכת השימור הקריוגנית PSC היא המצב האופטימלי ביותר בהשוואה לשלושה אחרים (הנתונים לא מוצגים) והשתמשנו במדיום זה להקפאה יעילה של ספרואידים. לאחר שימור בהקפאה, הכדאיות נשארת גבוהה (איור 4B,C), אך התכונות האלקטרופיזיולוגיות של CSs מושפעות ונדרשת תקופת דגירה לאחר ההפשרה. ואכן, שבוע לאחר ההפשרה, CSs הציגו פעילות פעימות ספונטנית וטיפול בסידן. עם זאת, תואר כי hiPSC-CMs טריים והתאוששו לא תמיד מראים תכונות מולקולריות ופיזיולוגיות זהות38. מגבלה זו צריכה להילקח בחשבון כאשר hiPSC-CMs שמורים בהקפאה משמשים להערכת קריאות לב המושרות על ידי תרופות. יתר על כן, למרות שאנו מווסתים ביעילות את מספר התאים לכל ספרואיד ואת העיתוי האופטימלי של הדמיה חולפת סידן, ניתן לשפר את הספרואידים הלבביים על ידי ערבוב תאי קרדיומיוציטים שמקורם ב- hiPSC עם תאי אנדותל, פיברובלסטים, צמתי תאים, ומטריצות חוץ-תאיות, כגון chitosan, קולגן IV, פיברונקטין , מטריג'ל או למינין, המחקים את סביבת הלב in vivo 39, 40. בסך הכל, אנו מציעים פרוטוקול שלב אחר שלב כדי ליצור ביעילות CSs המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון מידול מחלות ובדיקת תרופות HT.

הגילוי של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) הציע הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות אנושית ומחלות ברמה התאית. במהלך העשור האחרון, באמצעות לקחים התפתחותיים, נקבעו פרוטוקולים שונים כדי להבטיח את ההבחנה היעילה של hiPSCs לקרדיומיוציטים (CMs)1,2,3,4. קרדיומיוציטים הנגזרים מ-hiPSC (hiPSC-CMs) יכולים לשמש כמשאב למידול מחלות לב וכלי דם תורשתיות גנטית (CVD), בדיקת בטיחות הלב עבור תרופות חדשות ואסטרטגיות התחדשות לב 5,6,7,8. למרות התמיינות הלב המכוונת של hiPSCs, מספרי CM בלתי מוגדרים נותרו אתגר בתחום הלב, שכן hiPSC-CMs בוגרים בדרך כלל אינם מתרבים, ותאים אנושיים ראשוניים אינם זמינים בכמויות גבוהות.
לאחרונה, תיארנו כי הפעלת איתות Wnt במקביל עם תרבית צפיפות תאים נמוכה הביאה לתגובת שגשוג מסיבית (עד פי 250) של hiPSC-CMs 9,10. אסטרטגיה חסכונית זו להרחבה מסיבית של hiPSC-CMs באמצעות מעבר סדרתי בפורמט בקבוק תרבות מאפשרת סטנדרטיזציה ובקרת איכות של מספר רב של hiPSC-CMs פונקציונליים. בנוסף, כדי לעמוד בקצב הביקוש לאצוות גדולות של hiPSC-CMs מתורמים שונים, הביו-בנקאות של hiPSC-CMs תוארה10. עם זאת, מונושכבות קרדיומיוציטים שנזרעו בצלחות תרבית סטנדרטיות אלה אינן מייצגות את המבנה התלת-ממדי המורכב הקיים בלב. יתר על כן, חוסר הבשלות של hiPSC-CMs נותר מכשול, ובכך נכשל בחיקוי הפנוטיפ הביולוגי והפיזיולוגי של הסביבה הקרדיווסקולרית in vivo.
פותחו מודלים תלת-ממדיים חדשניים במבחנה שבהם hiPSC-CMs מראים התנהגות פיזיולוגית קרובה יותר כגון ארגון עצמי 11,12, עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) 13, התבגרות משופרת 14,15,16 והתכווצות מסונכרנת17,18,19 . מודלים תלת-ממדיים שימשו לגילוי תרופות, בדיקות לב-ריאוקסיות של תרופות, מידול מחלות, טיפולים רגנרטיביים, ואפילו הניסויים הקליניים הראשונים 20,21,22,23,24. אחד המודלים הנפוצים ביותר הוא רקמת לב מהונדסת מבוססת פיברין (EHT), המציגה סידור דמוי רקמה והתכווצות לב13,17,25. בעבר, הראינו כי EHTs שנוצרו מ-hiPSC-CMs מורחבים הציגו התכווצות דומה לזו של hiPSC-CMs לא מורחבים, והדגימו פונקציונליות תאית ללא פשרות לאחר הרחבה9. עם זאת, למרות שהדור של EHTs מ- hiPSC-CMs כבר מבוסס היטב, צפויות התפתחויות נוספות לגבי הקמת פלטפורמת הערכת HT. כאן, הדור המהיר של מספר גדול של כדורי לב צוברים את עצמם (CSs) בפורמט 96 באר מאפשר שיפור בתנאי תלת מימד למטרות סינון בתפוקה גבוהה (HTS).
בסך הכל, היתרון של CSs כתרבית תאים תלת-ממדית הוא יכולת השחזור והמדרגיות הגבוהה שלהם. בפרט, CSs בשילוב עם טיפול בדגימות רובוטיות יכולים לתקנן ולהפוך את תרבות CS, טיפול תרופתי וניתוח תוכן גבוהלאוטומטיים 20. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים ליצירת CSs בעלי טוהר גבוה ובאיכות גבוהה, אשר ניתן לשמר בהקפאה ביעילות ולבדוק את תפקוד הלב על ידי ביצוע מדידות ארעיות Ca2+ באמצעות מערכת רכישה וניתוח סידן אופטית. דגם זה מספק כלי פשוט אך רב עוצמה לביצוע מסכים בעלי תפוקה גבוהה על מאות עד אלפי ספרואידים17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שמקורם בתאי גזע (hiPSC-CMs) הם בעלי חשיבות עליונה עבור מודלים וטיפולים במחלות לב אנושיות. לאחרונה פרסמנו אסטרטגיה חסכונית להרחבה מסיבית של hiPSC-CMs בשני ממדים (2D). שתי מגבלות עיקריות הן חוסר בשלות תאים והיעדר סידור ומדרגיות תלת-ממדיים (3D) בפלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה (HTS). כדי להתגבר על מגבלות אלה, הקרדיומיוציטים המורחבים מהווים מקור תאים אידיאלי ליצירת תרבית תאי לב תלת-ממדית וטכניקות הנדסת רקמות. האחרון מחזיק פוטנציאל גדול בתחום הלב וכלי הדם, מתן HTS מתקדם יותר רלוונטי פיזיולוגית. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה תואמת HTS עם מדרגיות קלה לייצור, תחזוקה וניתוח אופטי של ספרואידים לבביים (CS) בפורמט של 96 בארות. CSs קטנים אלה חיוניים כדי למלא את הפער הקיים במודלים הנוכחיים של מחלות מבחנה ו / או דור עבור פלטפורמות הנדסת רקמות תלת ממדיות. ה-CSs מציגים מורפולוגיה, גודל והרכב תאי מובנים מאוד. יתר על כן, hiPSC-CMs בתרבית כמו CSs להציג התבגרות מוגברת וכמה תכונות תפקודיות של הלב האנושי, כגון טיפול סידן ספונטני ופעילות התכווצות. על ידי אוטומציה של זרימת העבודה המלאה, החל מדור CSs ועד ניתוח פונקציונלי, אנו מגדילים את יכולת השחזור תוך ובין-אצווה כפי שמודגם על ידי הדמיה בתפוקה גבוהה (HT) וניתוח טיפול בסידן. הפרוטוקול המתואר מאפשר מידול של מחלות לב והערכת השפעות תרופתיות/טיפוליות ברמת התא הבודד בתוך סביבת תאים תלת-ממדית מורכבת בתהליך עבודה אוטומטי לחלוטין של HTS. בנוסף, המחקר מתאר הליך פשוט לשימור ארוך טווח ובנקאות ביולוגית של ספרואידים שלמים, ובכך מספק לחוקרים את ההזדמנות ליצור אחסון רקמות פונקציונלי של הדור הבא. HTS בשילוב עם אחסון לטווח ארוך יתרום באופן משמעותי למחקר תרגומי במגוון רחב של תחומים, כולל גילוי ובדיקת תרופות, רפואה רגנרטיבית ופיתוח טיפולים מותאמים אישית.

הפרוטוקול שמוצג באיור 1A מתאר את היצירה של CSs מ-hiPSC-CMs שהורחבו בעבר. ה-CSs רוכשים מבנה תלת-ממדי ביום הראשון שלאחר הזריעה בלוחות עגולים-תחתונים בעלי חיבור נמוך במיוחד, וניתן לגדל אותם בתרבית במשך עד 6 שבועות (איור 1B). כפי שהוערך על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, רוב התאים ב-CSs בני 3 שבועות ביטאו חלבונים סרקומריים כמו α-אקטינין וטרופונין T, והציגו ארגון סרקומר סדיר (איור 1C). לכימות תאים חיוביים α-אקטינין בוצע ניתוח ציטומטריית זרימה. בהתאם לתוצאות האימונופלואורסצנטיות, נתוני ציטומטריית הזרימה הדגימו רמות גבוהות דומות של α-אקטינין הן ביום 0 (76.9% ±-16.6%) והן ב-CSs בני 3 שבועות (71.1% ±-22.7%) (איור 1D), מה שמצביע על הרכב תאי קבוע וטהור מאוד במהלך התרבית. היה ביטוי מוגבר של גנים לבביים עבור צמתים (GJA1, JPH2 ו-PKP2), דסמוזומים (DES) ומיטוכונדריה (ATP5A) בספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM (יום 42) לעומת hiPSC-CMs שגודלו בתרבית דו-ממדית במשך 90 יום (איור 1E). הביטוי של גנים אלה הוא סימן ההיכר של אינטראקציה תא-תא והתבגרות30.
לאחר מכן, התכונות הפונקציונליות של CSs, כלומר קצב פעימות וטיפול Ca2+, הוערכו בנקודות זמן שונות (איור 2). פרמטרים חולפים של סידן כגון זמן עלייה, זמן שיא, זמן דעיכה ומשך מעבר סידן (CTD90) הוערכו כפי שמצוין באיור 2A,B. אחוז המכות של CSs דומה בשלושת השבועות הראשונים שלאחר הדור, אך ירד משמעותית בשבוע 6 (Wk6) CSs (איור 2C). שיעור המכות הופחת משמעותית ב-Wk3 בהשוואה ל-Wk1, ובדומה לאחוז המכות ב-CSs, ירד באופן דרמטי ב-Wk6 (איור 2D). ב-Wk6 נצפתה הידרדרות ב-CS, מה שיכול להסביר את הירידה הן בקצב המכות והן במספר ה-CSs המכים. מדידה של פרמטרים חולפים של סידן הצביעה על ערך שיא גבוה משמעותית ב-Wk2 (איור 2E), בעוד שזמן העלייה, זמן הדעיכה ו-CTD90 גדלו משמעותית ב-Wk3 בהשוואה ל-Wk1 (איור 2F-H ). יחד, תוצאות אלה מראות כי ספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM הם אופטימליים מבחינה תפקודית בסביבות שבועות 2 ו-3 לאחר הדור.
איור 3 מראה את ההשפעה של גודל הספרואיד על קצב המכות והטיפול בסידן. CSs נוצרו על-ידי זריעה של 2.5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 ו-20 x 10 4 hiPSC-CMs בבאר של צלחת של 96 בארות עבור סך של 24 CSs/wells לכל תנאי (איור 3A). כצפוי, גודל הספרואיד גדל ככל שמספר התאים שנעשה בהם שימוש גדל, ונע בין 178 ±-36 מיקרומטר ל-351 ±-65 מיקרומטר (איור 3A, פאנל ימני). Ca2+ transients נמדדו בניתוחים קיסריים בני 3 שבועות בארבע צפיפויות זריעה שונות (איור 3B). מדידות של CSs מכים הצביעו על כך שרק כ-50% מה-CSs הקטנים יותר (2.5K ו-5K-CSs) הכו, בעוד שאחוז ה-CSs הגדולים יותר (10K ו-20K-CSs) היה גבוה משמעותית (כ-85%) (איור 3C). קצב מכות דומה (כ-28 פעימות לדקה) הוצג על-ידי 5K-, 10K ו-20K-CSs, שהיה גבוה משמעותית בהשוואה ל-2.5K-CSs (איור 3D). ערכי השיא של תמונות סידן היו דומים בכל התנאים שנבדקו (איור 3E), אולם זמן העלייה (איור 3F), זמן הדעיכה (איור 3G) ו-CTD90 (איור 3H) גדלו באופן משמעותי ב-CSs גדולים יותר (10K ו-20K-CSs) בהשוואה לקטנים יותר (2.5K- ו-5K-CS). יחד, תוצאות אלה מראות כי ספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM הם אופטימליים לטיפול בסידן כאשר משתמשים בצפיפות זריעה בין 10K ל-20K hiPSC-CMs / באר.
לאחר מכן, הערכנו את ההשפעה של שימור בהקפאה על הכדאיות והתפקוד של CS. לפני הניתוח, ניתוחים קיסריים מופשרים נשמרו בתרבית במשך שבוע אחד (איור 4A). כפי שניתן לראות הן בבדיקות ציטומטריית זרימה (איור 4B) והן בבדיקות כדאיות תאים Calcein-AM (איור 4C), שימור קריוגני לא השפיע על כדאיות התאים בתוך CSs. נוסף על כך, CSs מופשרים הראו רמות ביטוי דומות של חלבונים סרקומריים בהשוואה ל-CSs טריים תואמי גיל (איור 4D). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן לשמור ביעילות CSs בהקפאה לצורך ניתוח תפקודי לב לאחר מכן ובדיקות סקר בתפוקה גבוהה.
לבסוף, פעילות המכות והטיפול ב-Ca2+ נמדדו הן ב-CSs טריים והן בהקפאה (איור 5). אחוז המכות נמדד בנקודות זמן שונות לאחר ההפשרה, בהתאמה, 2, 5 ו-7 ימים. בעוד שרוב הניתוחים הקיסריים הטריים הראו פעילות פעימה לאורך זמן, ברור שה-CSs שנשמרו בהקפאה נזקקו לעד שבוע אחד של תרבית כדי לשחזר את פעילות הפעימות שלהם (איור 5B). לא חל שינוי משמעותי בשיעור המכות של CSs מופשרים לעומת טריים; אולם לא נצפתה פעילות פעימות ספונטנית בחלק מהניתוחים הקיסריים הקפואים (איור 5C). אף על פי שערכי השיא הופחתו באופן משמעותי ב-CSs קפואים/מופשרים בהשוואה לטריים (איור 5D), לא נצפו שינויים משמעותיים בזמן העלייה, בזמן הדעיכה וב-CTD90 של CSs קפואים/מופשרים בהשוואה לטריים (איור 5E-G). נתונים אלה מצביעים על כך שלאחר ההפשרה, חשוב לתת ל-CSs להתאושש באינקובטור לפחות שבוע לפני מדידת פעילות פעימות ו-Ca2+ חולף.
יחד, תוצאות אלה מראות כי שימור בהקפאה של ספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM משמר את יכולת הקיום של קרדיומיוציטים, את המבנה הסרקומרי ואת המאפיינים התפקודיים שלהם כגון פעילות פעימות ספונטנית וטיפול בסידן. לפיכך, ספרואידים הנגזרים מ- hiPSC-CM מייצגים מודל מתאים לשחזור מדויק של אלקטרופיזיולוגיה של הלב במבחנה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> איור 1: יצירת ספרואידים לבביים . (A) ייצוג סכמטי של התמיינות לבבית מכוונת מבוססת Wnt, ההתרחבות הבאה של hiPSC-CMs, ויצירת CSs. נוצר עם biorender.com. (B) תמונות בשדה בהיר בנקודות זמן שונות של תרבית CS. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. Wk מייצג את השבוע. (C) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות עבור חלבונים סרקומריים לבביים α-אקטינין וטרופונין T ב-CSs בני 3 שבועות. אימונופלואורסצנציה: Hoechst (כחול), α-actinin (ירוק) וטרופונין T (אדום). סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. התמונה הממוזגת המוגדלת מימין מציגה את ארגון הסרקומרה. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (D) כימות ציטומטריית זרימה של תאים חיוביים α-אקטינין לפני (יום 0) ו-3 שבועות לאחר היווצרות CSs. (n = 14-23 לכל תנאי. (E) RT-qPCR בוצע על hiPSC-CMs בתרבית במשך 90 יום (2D) ודגימות ספרואידים בתרבית במשך 42 יום כדי לקבוע רמות ביטוי של גנים לבביים שונים הקשורים לצמתי תאים, חוטי ביניים ומיטוכונדריה. (n = 1-3 קבוצות). הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. NS (לא משמעותי) כפי שמחושב על ידי מבחן t לא מזווג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> איור 2: קצב מכות וטיפול בסידן בניתוחים קיסריים בשבועות שונים לאחר הדור. (A) דוגמאות לפרמטרים חולפים של סידן שחושבו על ידי אלגוריתם ניתוח מדעי Vala בתוכנת Cyteseer. (B) עקבות סידן חולפים מייצגים ותמונות בהילוך מהיר של CSs בנקודות זמן שונות (שבועות) לאחר הדור. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. (C) כימות מהלך הזמן של פעילות פעימות ספונטניות מבוטא כאחוז ה-CSs המכים. (D) קצב הכאה של CSs במהלך זמן הטיפוח. (ה-ה) כימות של מעברי הסידן המראים ערך שיא, זמן עלייה, זמן ריקבון ו- CTD90. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SD. משכפלים ביולוגיים = שלושה, משכפלים טכניים = 38, 50, 66 ו-7, בהתאמה. *p < 0.05, ****p < 0.001; ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות פוסט-הוק של Tukey. קיצורים; CTD = משך סידן חולף, Wk = שבוע, CSs = כדורי לב אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> איור 3: קצב מכות וטיפול בסידן ב-CSs שנוצרו באמצעות צפיפויות שונות של זריעת תאים. (A) מדידות שדה בהיר (משמאל) וגודל (מימין) של CSs שנוצרו באמצעות מספרים שונים של hiPSC-CMs. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. (B) עקבות סידן חולפים מייצגים ותמונות קיטועי זמן של 2.5K-20K-CSs. (ג,ד) אחוזי חבטה וקצב חבטות של 2.5K-20K-CSs. (ה-ה) ערך שיא, זמן עלייה, זמן דעיכה ו- CTD90 ב- 2.5K-20K-CSs. הנתונים ממוצעים ± SD. משכפלים ביולוגיים = שלושה, משכפלים טכניים = 28-39. *p < 0.05, ****p < 0.001; ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות פוסט-הוק של Tukey. קיצורים: CTD = משך מעבר סידן, Wk = שבוע, k = x 1,000 תאים, CSs = ספרואידים לב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> איור 4. השפעת שימור בהקפאה על כדאיות ומבנה כדורי הלב. (A) ייצוג סכמטי של ייצור מדעי המחשב, ביו-בנקאות עוקבת והפשרה. (B) בדיקת כדאיות תאי ציטומטריה של זרימה הן ב-CSs טריים והן בהקפאה. כבקרה חיובית, נעשה שימוש בטיפול עם 10% פתרון Triton-X למשך 5 דקות. (n = 4 לכל תנאי). הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. ****p < 0.001; ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות פוסט-הוק של Tukey. (C) בדיקת כדאיות תאי Calcein-AM ב-CSs טריים לעומת מופשרים לאחר 7 ימים של תרבית (n = 15-17 לכל מצב, ****p < 0.001, על ידי מבחן t זוגי; סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר). (D) צביעה מייצגת של שדה בהיר (משמאל) ואימונופלואורסנציה עבור ביטוי α-אקטינין וטרופונין T ב-CSs טריים ומופשרים. אימונופלואורסצנטיות: Hoechst (כחול), α-actinin (ירוק) וטרופונין T (אדום). התמונות הממוזגות מימין מציגות קטעי סרקומרה ב- CSs. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. קיצורים: X = יום הפשרה לפי בחירה, PI = יודיד פרופידיום, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> איור 5: מעברי סידן ב-CSs טריים לעומת מופשרים. (A) עקבות סידן חולפים מייצגים ותמונות בהילוך מהיר של ה-CSs לפני שימור בהקפאה ושבוע לאחר ההפשרה. (B) אחוז הכאה של כדורי לב טריים וקפואים/מופשרים. עמודות מייצגות ניסויים בודדים. (C) קצב הכאה של כדורי לב טריים וקפואים/מופשרים. (ד-ג) כימות פרמטרים חולפים של סידן: ערך שיא, זמן עלייה, זמן ריקבון ו-CTD90. הנתונים הם ממוצעים ± SD. *p < 0.05, ****p < 0.001; ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות פוסט-הוק של Tukey. קיצורים; CTD = משך סידן חולף, CSs = ספרואידים לבביים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: אסטרטגיות gating מייצגות לניתוח ציטומטריית זרימה. (A) אסטרטגיית gating מייצגת עבור hiPSC-CMs חיוביים α-אקטינין באוכלוסייה טהורה לעומת בקרה שלילית ובקרת איזוטיפ. מספר התאים המנותחים α-אקטינין חיוביים הוא 25 x 105. קיצורים; SSC = פיזור צד, PI+ = פרופידיום יודיד חיובי. (B) אסטרטגיית גטינג מייצגת לניתוח הכדאיות הן בבקרה הטרייה, המופשרת, החיובית (Triton-X) והן בבקרה השלילית (לא מוכתמת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

מוצגת כאן סדרה של פרוטוקולים ליצירה ושימור בהקפאה של ספרואידים לבביים (CSs) מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שמקורם בתאי גזע בתרבית בפורמט רב-ממדי בעל תפוקה גבוהה. מודל תלת מימדי זה מתפקד כפלטפורמה חזקה למידול מחלות, הקרנות בתפוקה גבוהה, ושומר על הפונקציונליות שלו לאחר שימור בהקפאה.

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ליצירה, תחזוקה וניתוח אופטי של כדורי לב. ספרואידים לבביים אלה חיוניים כדי למלא את הפער הנוכחי במודלים של מחלות חוץ גופיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ליצור הדור הבא, סינון בתפוקה גבוהה ואחסון פונקציונלי של כדורי לב.התחל בהוספת מיליליטר אחד לסנטימטר רבוע של תמיסת ניתוק לב סטרילית לכל באר של צלחת תרבית המכילה קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המופקים מתאי גזע המושרים על ידי אדם. דוגרים על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אשר את ניתוק התאים על ידי התבוננות בתאים לבנים ועגולים תחת הגדלה פי 4 של מיקרוסקופ שדה בהיר.באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר, נתק מכנית את התאים על ידי שטיפתם עם שני מיליליטר של מדיום בסיסי חם כדי להכין תרחיף תא יחיד. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי בקוטר 15 מיליליטר, ולצנטריפוגה למשך שלוש דקות במשקל 300 גרם. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את התאים במיליליטר אחד של ציפוי מחדש hiPSC-CM.השתמש 1, 000 מיקרוליטר פיפטה קצה כדי לנתק את גלולת התא. לאחר שלוש או ארבע תערובות, מכיוון שהתמיסה נראית הומוגנית, טען אותה לקסטה כדי לספור את התאים, והעבר את כמות התאים המתאימה ב -100 מיקרוליטר של מדיום ציפוי מחדש לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד, תחתית עגולה, 96 בארות. הניחו את לוחית כדורי הלב על שייקר אורביטלי באינקובטור ב-70 סל"ד עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, 21% חמצן ו-90% לחות למשך 24 שעות.כדי למנוע קרע ספרואידי, לשאוף רק 50 מיקרוליטר של בינוני מכל באר, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של RPMI בתוספת B27 בינוני לכל באר במשך 48 השעות הראשונות. לאחר מכן, שואפים 100 מיקרוליטר של המדיום מכל באר, ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום ההתבגרות לכל באר. לשמור על התאים במדיום ההבשלה, ולרענן את המדיום כל יומיים-שלושה.מניחים את צלחת הספרואיד על קרח במשך 10 דקות לקירור מקדים לפני צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 70 גרם. מוציאים את המדיום עד 50 מיקרוליטר נשארים בבאר. לאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטר של hiPSC קר כקרח הקפאה בינוני לכל באר.אטמו את הצלחת בסרט איטום צלחת. כדי להכין את תבנית הסיליקון, מערבבים את רכיבי ערכת אלסטומר הסיליקון ביחס של 10 ל-1, ומוסיפים את התמיסה בתוך החלק התחתון של צלחת הבאר. נטרלו את הבועות של התמיסה באמצעות משאבת ואקום למשך 15 עד 20 דקות.מכניסים את התבנית לתנור, ומרפאים אותה בחום של 60 מעלות למשך שמונה שעות לקבלת אלסטומר גמיש למחצה שמתקלף מהצלחת. הכניסו את הצלחת האטומה בזהירות לתבנית סיליקון, תוך הבטחת חילופי חום אחידים בין צלחת הבאר למקפיא. מקפיאים את הצלחת בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות בתבנית סיליקון מוכנה לפני העברת הצלחת למיכל חנקן נוזלי או למקפיא של 150 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.כדי להבטיח הפשרה מהירה של ספרואידים לבביים, אספו צלחת תא אחת עם ספרואידים לבביים בכל פעם מהחנקן הנוזלי, והניחו אותה באינקובטור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, 21% חמצן ו-90% לחות. מוציאים את סרט האיטום מהצלחת, ושואבים 150 מיקרוליטר מכל באר לפני הוספת 200 מיקרוליטר של מדיום בזאלי חם לכל באר. צנטריפוגג את הצלחת ב 70 גרם במשך שלוש דקות, ולחזור על כביסה בינונית בסיסית חמה.לאחר שתסיים, להסיר 150 מיקרוליטר של המדיום, ולהוסיף 200 מיקרוליטר של cardiomyocytes מפשיר בינוני בכל באר. לאחר מכן חזור על שטיפת RPMI כאמור במהלך יצירת כדורית הלב, ולאחר מכן שמירה על התאים במצע ההתבגרות. לאחר שבוע של תרבית, ספרואידים לב מופשרים הם אופטימליים לטיפול בסידן הדמיה אופטית.שאפו 150 מיקרוליטר מכל באר. טפלו בכדורי הלב המופשרים עם 100 מיקרוליטר של צבע סידן Cal-520 AM בינוני לכל באר בתנאים חשוכים, ודגרו על הצלחת במשך 60 דקות. הכינו מערכת לאיסוף וניתוח סידן על ידי הפעלת המיקרוסקופ והבטחת האפשרות לבקרה סביבתית.כוונן את מידות צמצם המצלמה והמסגור כדי למזער את שטח הרקע. כדי למדוד את אות הסידן, באמצעות לייזר של 488 ננומטר, הגדר את הניגודיות לרקע שחור עם אות ירוק בהיר במהלך שחרור הסידן. הקלט סרטון עם זרם עקבי של 2 עד 10 פסגות תוך 10 שניות.הקליטו סרטון של 10 שניות, וסרקו את הצלחת בעלת 96 הבארות, בתחילה זוזו שמאלה, ואז מטה בצורה זיגזגית כדי לכסות את הצלחת כולה. לאחר רכישת מעברי הסידן, נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח עקבות פלואורסצנטיות. כדורי הלב רכשו מבנה תלת-ממדי ביום הראשון שלאחר הזריעה, שניתן היה לגדל בתרבית עד שישה שבועות.רוב הספרואידים הלבביים בני שלושה שבועות ביטאו ארגון סרקומר קבוע עם אלפא אקטינין וטרופונין T.רמות גבוהות של אלפא אקטינין ביום אפס וכדורואידים לבביים בני שלושה שבועות הצביעו על הרכב תאי קבוע וטהור מאוד במהלך התרבית. ביטוי מוגבר של גנים לבביים, דסמוזומים ומיטוכונדריה נצפה בספרואידים מאשר hiPSC-CMs שגודלו בדו-ממד במשך 90 יום. אחוז המכות של ספרואידים לבביים היה דומה בשלושת השבועות הראשונים שלאחר הדור וירד משמעותית בשבוע השישי עקב הידרדרות הספרואידים הלבביים.שיעור המכות ירד משמעותית בשבוע השלישי לעומת השבוע השישי כתוצאה מהחמרה. פרמטרים חולפים של סידן הצביעו על ערך שיא גבוה יותר בשבוע השני, בעוד שזמן העלייה, זמן הדעיכה ומשך הזמן הארעי של הסידן ב-90% מהריקבון גדלו משמעותית בשבוע השלישי, מה שמראה כי ספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM היו אופטימליים מבחינה תפקודית בשבוע השני והשלישי שלאחר הדור. גודל הספרואיד גדל עם מספר התאים המשמשים לזריעה.בממדים גדולים יותר, ספרואידים ישנים, המכות היו גבוהות משמעותית. שיעור מכות דומה וגבוה משמעותית הוצג על ידי ספרואידים 5k, 10k ו- 20k בהשוואה ל- 2.5k ספרואידים. שימור בהקפאה לא השפיע על כדאיות התאים בתוך כדורי הלב.ביטוי דומה של חלבונים סרקומריים בספרואידים המופשרים והטריים תואמי גיל הצביע על יעילות הקפאה. לא היה שינוי משמעותי בקצב הפעימות של כדורי לב מופשרים או טריים. לא נצפו שינויים משמעותיים בזמן העלייה, בזמן הדעיכה וב-CTD90 של CS מופשר או טרי. לצד מידול מחלות ובדיקות סקר תרופתיות בעלות תפוקה גבוהה, ספרואידים אלה יכולים לשמש גם לביוריאקטורים של ייצור שלפוחית חוץ-תאית ולטיפולים חוץ-תאיים הקשורים לשלפוחית.כמו כן, הביו-בנקאות של ספרואידים אלה יכולה לשמש כאספקת קרדיומיוציטים חדשה לאסטרטגיות רגנרטיביות. ראיות מצטברות מצביעות על כך שלביובנקים של מודלים של תאי גזע שמקורם בחולים עבור סיסטיק פיברוזיס, סרטן וספרואידים לבביים יש פוטנציאל גדול לפענוח מנגנונים מולקולריים לבדיקות סקר לתרופות ולרפואה מותאמת אישית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...