Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La scoperta di farmaci cardiaci è ostacolata dalla dipendenza da modelli animali e cellulari non umani con un throughput e una fedeltà fisiologica inadeguati per eseguire con precisione le letture. La biologia hiPSC-CM accoppiata con strumentazione HT e sonde fisiologiche ha il potenziale per reintrodurre modelli umani nelle prime fasi della modellazione delle malattie cardiache e della scoperta di farmaci. Abbiamo sviluppato un metodo di generazione del tessuto cardiaco 3D che produce CS funzionali e di alta qualità per una piattaforma ottimale di modellazione delle malattie cardiache e screening farmacologico. Inoltre, la combinazione della tecnologia sferoidale nei sistemi di bioreattori 3D per la produzione industriale di EV consente un passo necessario verso la traduzione clinica della terapia basata su EV. Il metodo qui descritto si basa su diversi fattori cruciali ed è una variante dei protocolli esistenti 9,10,28,29. Questi metodi includono: 1) la generazione di costrutti tissutali 3D, 2) il numero di cellule ottimali e la tempistica prima dello screening, 3) migliorare la sensibilità e la capacità di alta produttività degli strumenti e 4) essere in grado di congelare gli sferoidi prima di qualsiasi analisi funzionale. A differenza dei protocolli descritti in precedenza, il protocollo proposto descrive la generazione di fino a 1.500 sferoidi al giorno e l'idoneità per HTS. L'analisi convenzionale di un centinaio di composti su 6 x 0,5 dosi logaritmiche per 10 repliche utilizzando i sistemi di imaging del calcio a 96 pozzetti esistenti o tessuti cardiaci ingegnerizzati multiplex a 24 pozzetti richiede circa 500-3 miliardi di hiPSC-CMs31,32. L'applicazione proposta rende gli screening cardiaci meno costosi ed efficaci in termini di tempo rispetto ai sistemi convenzionali poiché le piastre a 96 pozzetti richiedevano solo il 10% della densità di semina rispetto al metodo descritto. Inoltre, rispetto ai protocolli precedenti, come il metodo hanging-drop, la generazione di sferoidi mediante autoaggregazione in piastre di attacco ultra-basse consente l'imaging automatizzato di alta qualità di singoli microtessuti33.
Questo piccolo modello 3D imita il fenotipo biologico e fisiologico dell'ambiente cardiovascolare in vivo . Come precedentemente dimostrato, i transitori di calcio aumentano drasticamente nei costrutti di tessuto cardiaco 3D rispetto alle colture cellulari monostrato 2D34.
Successivamente, abbiamo scoperto che la densità di semina e il corretto tempo di coltura sono anche fattori critici per uno screening CS di successo. Le densità di 10K-20K hiPSC-CMs per sferoide e lo screening tra le settimane 2-3 dopo la generazione erano ottimali, mentre gli sferoidi troppo piccoli o troppo vecchi mostrano una manipolazione disturbata del calcio (Figura 2 e Figura 3). Pertanto, è importante mantenere le densità di semina il più coerenti possibile, poiché le dimensioni influenzano i parametri funzionali. Inoltre, sebbene questo metodo ottico fornisca buoni risultati per le colture 3D vive come un intero tessuto, ottenere dati all'interno di sferoidi più grandi a livello (sub-) cellulare è difficile senza fare affidamento su metodi istologici che richiedono tempo. Recentemente, sono stati pubblicati diversi approcci che utilizzano il "clearing ottico", che consente l'acquisizione di interi sferoidi 3D con l'opportunità di quantificare i marcatori a singola cellula. Qui, abbiamo adattato un protocollo di 3 giorni dalla raccolta CS all'analisi delle immagini, che è ottimizzato per l'imaging 3D utilizzando la microscopia confocale29 (Figura 1C e Figura 4D).
Infine, con l'aumento delle applicazioni di tessuto cardiaco 3D e delle applicazioni commerciali, la domanda di conservazione a lungo termine e biobanking specifico per il paziente da parte di vari donatori è in aumento. La crioconservazione è una strategia efficace per generare piastre HTS da più lotti nel tempo. Il congelamento di hiPSC-CMs è stato descritto in precedenza e non è diverso rispetto ad altri tipi di cellule in coltura 10,35,36. Recentemente, sono stati descritti approcci per il congelamento di piastre con celle2D 37. Qui, abbiamo scoperto che il kit di crioconservazione PSC è la condizione ottimale rispetto ad altri tre (dati non mostrati) e abbiamo utilizzato questo mezzo per il congelamento efficiente degli sferoidi. Dopo la crioconservazione, la vitalità rimane elevata (Figura 4B,C), ma le proprietà elettrofisiologiche dei CS sono influenzate ed è necessario un periodo di incubazione dopo lo scongelamento. Infatti, 1 settimana dopo lo scongelamento, i CS hanno mostrato attività di battitura spontanea e manipolazione del calcio. Tuttavia, è stato descritto che le hiPSC-CM fresche e recuperate non mostrano sempre proprietà molecolari e fisiologiche identiche38. Questa limitazione deve essere considerata quando le hiPSC-CM crioconservate vengono utilizzate per valutare le letture cardiache indotte da farmaci. Inoltre, sebbene si modula efficacemente il numero di cellule per sferoide e la tempistica ottimale dell'imaging transitorio del calcio, gli sferoidi cardiaci potrebbero essere migliorati mescolando cellule cardiomiocitarie derivate da hiPSC con cellule endoteliali, fibroblasti, giunzioni cellula-cellula e matrici extracellulari, come chitosano, collagene IV, fibronectina, matrigel o laminina, imitando l'ambiente cardiaco in vivo 39, 40. Nel complesso, proponiamo un protocollo passo-passo per generare in modo efficiente CS che sono adatti per applicazioni a valle come la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci HT.

La scoperta delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) ha offerto opportunità senza precedenti per studiare lo sviluppo umano e le malattie a livello cellulare. Negli ultimi dieci anni, utilizzando lezioni di sviluppo, sono stati stabiliti vari protocolli per garantire l'efficiente differenziazione delle hiPSCs in cardiomiociti (CM)1,2,3,4. I cardiomiociti derivati da hiPSC (hiPSC-CMs) possono servire come risorsa per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD), testare la sicurezza cardiaca per nuovi farmaci e strategie rigenerative cardiache 5,6,7,8. Nonostante la differenziazione cardiaca diretta delle hiPSC, il numero indefinito di CM rimane una sfida nel campo cardiaco, poiché le hiPSC-CM mature generalmente non proliferano e le cellule umane primarie non sono disponibili in quantità elevate.
Recentemente, abbiamo descritto che l'attivazione concomitante della segnalazione Wnt con una coltura a bassa densità cellulare ha determinato una massiccia risposta proliferativa (fino a 250 volte) di hiPSC-CMs 9,10. Questa strategia economica per la massiccia espansione di hiPSC-CM tramite passata seriale in formato pallone di coltura facilita la standardizzazione e il controllo di qualità di un gran numero di hiPSC-CM funzionali. Inoltre, per tenere il passo con la domanda di grandi lotti di hiPSC-CM da vari donatori, è stata descritta la biobanca di hiPSC-CM10. Tuttavia, i monostrati di cardiomiociti seminati in questi piatti di coltura standard non sono rappresentativi della complessa struttura 3D presente nel cuore. Inoltre, l'immaturità delle hiPSC-CMs è rimasta un ostacolo, non essendo quindi all'altezza dell'imitazione del fenotipo biologico e fisiologico dell'ambiente cardiovascolare in vivo.
Sono stati sviluppati nuovi modelli 3D in vitro in cui le hiPSC-CM mostrano un comportamento fisiologico più vicino come l'auto-organizzazione 11,12, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) 13, la maturazione migliorata 14,15,16 e la contrazione sincronizzata17,18,19 . I modelli 3D sono stati utilizzati per la scoperta di farmaci, test di cardiotossicità farmacologica, modellazione di malattie, terapie rigenerative e persino i primi studi clinici 20,21,22,23,24. Uno dei modelli più utilizzati è il tessuto cardiaco ingegnerizzato a base di fibrina (EHT), che presenta una disposizione simile al tessuto e contrattilità cardiaca13,17,25. In precedenza, abbiamo dimostrato che gli EHT generati da hiPSC-CM espansi mostravano contrattilità comparabile a quelli di hiPSC-CM non espansi, dimostrando funzionalità cellulare non compromessa dopo l'espansione9. Tuttavia, anche se la generazione di EHT da hiPSC-CM è stata ben consolidata, si prevedono ulteriori sviluppi per quanto riguarda la creazione di una piattaforma di valutazione HT. Qui, la rapida generazione di un gran numero di sferoidi cardiaci autoaggreganti (CS) in formato a 96 pozzetti consente un miglioramento delle condizioni 3D per scopi di screening ad alta produttività (HTS).
Nel complesso, il vantaggio dei CS come coltura cellulare 3D è la loro elevata riproducibilità e scalabilità. In particolare, i CS combinati con la gestione robotica dei campioni possono standardizzare e automatizzare la coltura di CS, il trattamento farmacologico e l'analisi ad alto contenuto20. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per generare CS di alta purezza e alta qualità, che possono essere efficacemente crioconservati e sottoposti a screening per la funzione cardiaca eseguendo misurazioni transitorie di Ca2+ utilizzando un sistema ottico di acquisizione e analisi del calcio. Questo modello fornisce uno strumento semplice ma potente per eseguire schermi ad alto rendimento su centinaia di migliaia di sferoidi17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono di fondamentale importanza per la modellizzazione e la terapia delle malattie cardiache umane. Recentemente abbiamo pubblicato una strategia economica per la massiccia espansione di hiPSC-CM in due dimensioni (2D). Due limitazioni principali sono l'immaturità delle celle e la mancanza di disposizione tridimensionale (3D) e scalabilità nelle piattaforme HTS (High-Throughput Screening). Per superare queste limitazioni, i cardiomiociti espansi formano una fonte cellulare ideale per la generazione di colture cellulari cardiache 3D e tecniche di ingegneria tissutale. Quest'ultimo ha grandi potenzialità in campo cardiovascolare, fornendo HTS più avanzato e fisiologicamente rilevante. In questo articolo descriviamo un flusso di lavoro compatibile con HTS con facile scalabilità per la generazione, la manutenzione e l'analisi ottica degli sferoidi cardiaci (CS) in un formato a 96 pozzetti. Questi piccoli CS sono essenziali per colmare il divario presente negli attuali modelli di malattia in vitro e / o nella generazione per le piattaforme di ingegneria tissutale 3D. I CS presentano morfologia, dimensioni e composizione cellulare altamente strutturate. Inoltre, le hiPSC-CM coltivate come CS mostrano una maggiore maturazione e diverse caratteristiche funzionali del cuore umano, come la manipolazione spontanea del calcio e l'attività contrattile. Automatizzando l'intero flusso di lavoro, dalla generazione di CS all'analisi funzionale, aumentiamo la riproducibilità intra e inter-batch, come dimostrato dall'imaging ad alta produttività (HT) e dall'analisi della gestione del calcio. Il protocollo descritto consente la modellazione di malattie cardiache e la valutazione degli effetti farmacologici/terapeutici a livello di singola cellula all'interno di un complesso ambiente cellulare 3D in un flusso di lavoro HTS completamente automatizzato. Inoltre, lo studio descrive una procedura semplice per la conservazione a lungo termine e la biobanca di interi sferoidi, offrendo così ai ricercatori l'opportunità di creare un deposito funzionale di tessuti di prossima generazione. L'HTS combinato con lo stoccaggio a lungo termine contribuirà in modo sostanziale alla ricerca traslazionale in una vasta gamma di settori, tra cui la scoperta e la sperimentazione di farmaci, la medicina rigenerativa e lo sviluppo di terapie personalizzate.

Il protocollo mostrato nella Figura 1A descrive la generazione di CS da hiPSC-CM precedentemente espansi. I CS acquisiscono una struttura 3D entro il giorno 1 dopo la semina in piastre a fondo tondo ultra-basso e possono essere coltivati fino a 6 settimane (Figura 1B). Come valutato mediante colorazione con immunofluorescenza, la maggior parte delle cellule nei CS di 3 settimane esprimeva proteine sarcomeriche come α-actina e troponina T e mostrava una regolare organizzazione del sarcomero (Figura 1C). Per la quantificazione delle cellule α-actinina positive, è stata eseguita l'analisi della citometria a flusso. In accordo con i risultati dell'immunofluorescenza, i dati di citometria a flusso hanno dimostrato livelli elevati comparabili di α-actina sia nel giorno 0 (76,9% ± 16,6%) che nei CS di 3 settimane (71,1% ± 22,7%) (Figura 1D), indicando una composizione cellulare costante e altamente pura durante la coltivazione. C'è stato un aumento dell'espressione dei geni cardiaci per le giunzioni (GJA1, JPH2 e PKP2), i desmosomi (DES) e i mitocondri (ATP5A) negli sferoidi derivati da hiPSC-CM (giorno 42) rispetto agli hiPSC-CM coltivati in 2D per 90 giorni (Figura 1E). L'espressione di questi geni è un segno distintivo dell'interazione cellula-cellula e della maturazione30.
Successivamente, le proprietà funzionali dei CS, vale a dire la velocità di battitura e la manipolazione di Ca2+, sono state valutate in diversi punti temporali (Figura 2). I parametri transitori del calcio come il tempo di salita, il tempo di picco, il tempo di decadimento e la durata transitoria del calcio (CTD90) sono stati valutati come indicato nella Figura 2A,B. La percentuale di CS battuti è simile nelle prime 3 settimane post-generazione, ma è diminuita significativamente nella settimana 6 (Wk6) CS (Figura 2C). Il tasso di battitura è stato significativamente ridotto a Wk3 rispetto a Wk1 e, analogamente alla percentuale di CS battenti, è diminuito drasticamente a Wk6 (Figura 2D). A Wk6, è stato osservato un deterioramento della CS, che può spiegare il calo sia della frequenza di battitura che del numero di CS battenti. La misurazione dei parametri transitori del calcio ha indicato un valore di picco significativamente più alto a Wk2 (Figura 2E), mentre il tempo di salita, il tempo di decadimento e CTD90 sono stati significativamente aumentati a Wk3 rispetto a Wk1 (Figura 2F-H ). Nel loro insieme, questi risultati mostrano che gli sferoidi derivati da hiPSC-CM sono funzionalmente ottimali intorno alle settimane 2 e 3 post-generazione.
La figura 3 mostra l'effetto della dimensione dello sferoide sulla frequenza di battitura e sulla manipolazione del calcio. I CS sono stati generati seminando 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 e 20 x 10 4 hiPSC-CM in un pozzo di una piastra da 96 pozzetti per un totale di 24 CS / pozzetti per condizione (Figura 3A). Come previsto, la dimensione dello sferoide è aumentata all'aumentare del numero di cellule utilizzate, passando da 178 ± 36 μm a 351 ± 65 μm (Figura 3A, pannello di destra). I transitori di Ca2+ sono stati misurati in CS di 3 settimane alle quattro diverse densità di semina (Figura 3B). Le misurazioni dei CS di battitura hanno indicato che solo circa il 50% dei CS di dimensioni più piccole (2,5K e 5K CS) stavano battendo, mentre la percentuale di CS di dimensioni più grandi (10K e 20K CS) era significativamente più alta (circa l'85%) (Figura 3C). Un tasso di battitura simile (circa 28 bpm) è stato mostrato da 5K-, 10K- e 20K-CS, che era significativamente più alto rispetto a 2.5K-CSs (Figura 3D). I valori di picco delle immagini di calcio erano simili in tutte le condizioni testate (Figura 3E), tuttavia, il tempo di salita (Figura 3F), il tempo di decadimento (Figura 3G) e CTD90 (Figura 3H) sono stati significativamente aumentati in CS di dimensioni maggiori (10K- e 20K-CS) rispetto a quelli più piccoli (2.5K- e 5K-CSs). Nel loro insieme, questi risultati mostrano che gli sferoidi derivati da hiPSC-CM sono ottimali per lo screening della gestione del calcio quando viene utilizzata una densità di semina compresa tra 10K e 20K hiPSC-CM / pozzetto.
Successivamente, abbiamo valutato l'impatto della crioconservazione sulla vitalità e la funzione del CS. Prima dell'analisi, i CS scongelati sono stati mantenuti in coltura per 1 settimana (Figura 4A). Come mostrato dai test di vitalità cellulare di citometria a flusso (Figura 4B) e Calcein-AM (Figura 4C), la crioconservazione non ha influenzato la vitalità cellulare all'interno dei CS. Inoltre, i CS scongelati hanno mostrato livelli di espressione simili di proteine sarcomeriche rispetto ai CS freschi di età corrispondente (Figura 4D). Questi dati indicano che i CS possono essere crioconservati in modo efficiente per la successiva analisi della funzione cardiaca e lo screening ad alta produttività.
Infine, l'attività di battitura e la manipolazione di Ca2+ sono state misurate sia in CS freschi che crioconservati (Figura 5). La percentuale di CS battuti è stata misurata in diversi punti temporali dopo lo scongelamento, rispettivamente, a 2, 5 e 7 giorni. Mentre la maggior parte dei CS freschi ha mostrato attività di battitura nel tempo, chiaramente i CS crioconservati hanno avuto bisogno fino a 1 settimana di coltura per recuperare la loro attività di battitura (Figura 5B). Non vi è stato alcun cambiamento significativo nel tasso di battitura dei CS scongelati rispetto a quelli freschi; tuttavia, non è stata osservata alcuna attività spontanea di battitura in alcuni CS congelati (Figura 5C). Sebbene i valori di picco siano stati significativamente ridotti nei CS congelati/scongelati rispetto a quelli freschi (Figura 5D), non sono stati osservati cambiamenti significativi nel tempo di salita, nel tempo di decadimento e nel CTD90 dei CS congelati/scongelati rispetto ai CS freschi (Figura 5E-G). Questi dati indicano che, dopo lo scongelamento, è importante lasciare che i CS si riprendano nell'incubatore per almeno 1 settimana prima di misurare l'attività di battitura e il transitorio Ca2+.
Nel loro insieme, questi risultati mostrano che la crioconservazione degli sferoidi derivati da hiPSC-CM preserva la vitalità dei cardiomiociti, la struttura sarcomerica e le loro caratteristiche funzionali come l'attività di battitura spontanea e la manipolazione del calcio. Pertanto, gli sferoidi derivati dall'hiPSC-CM rappresentano un modello adatto per ricapitolare accuratamente l'elettrofisiologia cardiaca in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figura 1: Generazione di sferoidi cardiaci . (A) Rappresentazione schematica del differenziamento cardiaco diretto basato su Wnt, la successiva espansione di hiPSC-CMs e la generazione di CS. Creato con biorender.com. (B) Immagini in campo chiaro in diversi punti temporali della coltura CS. Barra scala, 200 μm. Wk rappresenta la settimana. (C) Immagini rappresentative di immunofluorescenza per le proteine sarcomeriche cardiache α-actina e troponina T in CS di 3 settimane. Immunofluorescenza: Hoechst (blu), α-actina (verde) e troponina T (rossa). Barra scala, 200 μm. L'immagine unita ingrandita a destra mostra l'organizzazione del sarcomero. Barra della scala, 50 μm. (D) Quantificazione della citometria a flusso di cellule α-actinina positive prima (giorno 0) e 3 settimane dopo la formazione di CS. (n = 14-23 per condizione. (E) RT-qPCR eseguita su hiPSC-CMs coltivati per 90 giorni (2D) e campioni sferoidi coltivati per 42 giorni per stabilire i livelli di espressione di diversi geni cardiaci correlati a giunzioni cellulari, filamenti intermedi e mitocondri. (n = 1-3 lotti). I dati sono rappresentati come media ± SD. NS (non significativo) calcolato da un test t spaiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figura 2: Beating rate e trattamento del calcio nei CS in diverse settimane dopo la generazione. (A) Esempi di parametri transitori di calcio calcolati dall'algoritmo di analisi Vala sciences in Cyteseer Software. (B) Tracce transitorie rappresentative di calcio e immagini time-lapse dei CS in diversi punti temporali (settimane) post-generazione. Barra della scala, 200 μm. (C) La quantificazione del corso temporale dell'attività di battitura spontanea è espressa come percentuale di CS che battono. (D) Tasso di battitura dei CS durante il tempo di coltura. (E-H) Quantificazione dei transitori di calcio che mostrano valore di picco, tempo di salita, tempo di decadimento e CTD90. I dati mostrati sono medi ± SD. Repliche biologiche = tre, repliche tecniche = 38, 50, 66 e 7, rispettivamente. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. Abbreviazioni; CTD = durata transitoria del calcio, Wk = settimana, CSs = sferoidi cardiaci umani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figura 3: Beating rate e manipolazione del calcio nei CS generati utilizzando diverse densità di semina cellulare. (A) Imaging a campo chiaro (a sinistra) e misurazioni delle dimensioni (a destra) dei CS generati utilizzando un numero diverso di hiPSC-CM. Barra della scala, 200 μm. (B) Tracce transitorie rappresentative di calcio e immagini time-lapse dei 2.5K-20K-CSs. (C,D) Percentuale di battimento e tasso di battimento di 2,5K-20K-CS. (E-H) Valore di picco, tempo di salita, tempo di decadimento e CTD90 in 2,5K-20K-CS. I dati sono medi ± SD. Repliche biologiche = tre, repliche tecniche = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. Abbreviazioni: CTD = durata transitoria del calcio, Wk = settimana, k = x 1.000 cellule, CSs = sferoidi cardiaci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Figura 4. Effetto della crioconservazione sulla vitalità e sulla struttura degli sferoidi cardiaci. (A) Rappresentazione schematica della generazione di CS, del successivo biobanking e dello scongelamento. (B) Test di vitalità cellulare di citometria a flusso in CS sia freschi che crioconservati. Come controllo positivo, è stato utilizzato un trattamento con soluzione Triton-X al 10% per 5 minuti. (n = 4 per condizione). I dati sono rappresentati come media ± DS. ****p < 0,001; ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (C) Test di vitalità delle cellule di calceina-AM in CS freschi rispetto a quelli scongelati dopo 7 giorni di coltura (n = 15-17 per condizione, ****p < 0,001, mediante t-test accoppiato; barra della scala, 200 μm). (D) Colorazione rappresentativa in campo chiaro (a sinistra) e immunofluorescenza per l'espressione di α-actina e troponina T in CS freschi e scongelati. Immunofluorescenza: Hoechst (blu), α-actina (verde) e troponina T (rossa). Le immagini unite sulla destra mostrano striature di sarcomero nei CS. Barra di scala, 50 μm. Abbreviazioni: X = giorno di scongelamento a scelta, PI = ioduro di propidio, Cal-AM = calceina-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figura 5: Transitori di calcio nei CS freschi rispetto a quelli scongelati. (A) Tracce transitorie rappresentative di calcio e immagini time-lapse dei CS prima della crioconservazione e 1 settimana dopo lo scongelamento. (B) Percentuale di battitura di sferoidi cardiaci freschi e congelati/scongelati. Le barre rappresentano singoli esperimenti. (C) Tasso di battitura di sferoidi cardiaci freschi e congelati/scongelati. (D-G) Quantificazione dei parametri transitori del calcio: valore di picco, tempo di salita, tempo di decadimento e CTD90. I dati sono medi ± DS. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. Abbreviazioni; CTD = durata transitoria del calcio, CSs = sferoidi cardiaci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Strategie rappresentative di gating per l'analisi della citometria a flusso. (A) Strategia rappresentativa di gating per hiPSC-CMs positivi all'α-actinina in una popolazione pura rispetto al controllo negativo e al controllo isotipo. Il numero di cellule analizzate positive all'α-actina è 25 x 105. Abbreviazioni; SSC = dispersione laterale, PI+ = ioduro di propidio positivo. (B) Strategia di gating rappresentativa per l'analisi di vitalità sia nel controllo fresco, scongelato, positivo (Triton-X) che negativo (non colorato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Qui viene presentato un insieme di protocolli per la generazione e la crioconservazione di sferoidi cardiaci (CS) da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo coltivati in un formato multidimensionale ad alto rendimento. Questo modello tridimensionale funziona come una solida piattaforma per la modellazione delle malattie, gli screening ad alto rendimento e mantiene la sua funzionalità dopo la crioconservazione.

Generazione, screening ad alto rendimento e biobanca di sferoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro per la generazione, la manutenzione e l'analisi ottica degli sferoidi cardiaci. Questi sferoidi cardiaci sono essenziali per colmare la lacuna negli attuali modelli di malattia in vitro. Questa tecnica consente ai ricercatori di creare screening di nuova generazione ad alto rendimento e conservazione funzionale degli sferoidi cardiaci.Inizia con l'aggiunta di un millilitro per centimetro quadrato di soluzione di distacco cardiaco sterile a ciascun pozzetto di una piastra di coltura contenente cardiomiociti confluenti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Confermare il distacco delle cellule osservando cellule bianche e di forma rotonda sotto ingrandimento 4x di un microscopio a campo luminoso.Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, dissociare meccanicamente le cellule lavandole con due millilitri di mezzo basale caldo per preparare una sospensione a singola cella. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare per tre minuti a 300 g. Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di placcatura hiPSC-CM.Utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microlitri per dissociare il pellet cellulare. Dopo tre o quattro miscele, quando la soluzione appare omogenea, caricarla in una cassetta per contare le celle e trasferire la quantità appropriata di celle in 100 microlitri di mezzo di riplaccatura a ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa, a fondo rotondo, a 96 pozzetti. Posizionare la piastra degli sferoidi cardiaci su uno shaker orbitale nell'incubatore a 70 giri / min con una temperatura di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, 21% di ossigeno e 90% di umidità per 24 ore.Per evitare la rottura dello sferoide, aspirare solo 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri di RPMI più B27 medio per pozzetto per le prime 48 ore. Quindi, aspirare 100 microlitri del mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri del mezzo di maturazione per pozzetto. Mantenere le cellule nel mezzo di maturazione e rinfrescare il terreno ogni due o tre giorni.Posizionare la piastra sferoidale sul ghiaccio per 10 minuti per il pre-raffreddamento prima di centrifugare la piastra per tre minuti a 70 g. Rimuovere il mezzo fino a quando 50 microlitri rimangono nel pozzo. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di congelamento hiPSC ghiacciato per pozzetto.Sigillare la piastra con un film sigillante a piastre. Per preparare lo stampo in silicone, mescolare i componenti del kit di elastomero di silicio in un rapporto 10 a 1 e aggiungere la soluzione all'interno della parte inferiore della piastra del pozzetto. Debollire la soluzione utilizzando una pompa per vuoto per 15-20 minuti.Mettere lo stampo in forno e polimerizzarlo a 60 gradi Celsius per otto ore per ottenere un elastomero semi-flessibile che viene staccato dalla piastra. Posizionare con cura la piastra sigillata in uno stampo in silicone, garantendo uno scambio termico uniforme tra la piastra del pozzetto e il congelatore. Congelare la piastra a 80 gradi Celsius per un minimo di quattro ore nello stampo in silicone preparato prima di trasferire la piastra in un serbatoio di azoto liquido o in un congelatore a 150 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Per garantire un rapido scongelamento degli sferoidi cardiaci, raccogliere una piastra cellulare con sferoidi cardiaci alla volta dall'azoto liquido e metterla nell'incubatore per 15 minuti a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, il 21% di ossigeno e il 90% di umidità. Rimuovere la pellicola sigillante dalla piastra e aspirare 150 microlitri di ciascun pozzetto prima di aggiungere 200 microlitri di un mezzo basale caldo a ciascun pozzetto. Centrifugare la piastra a 70g per tre minuti e ripetere il lavaggio con mezzo basale caldo.Una volta fatto, rimuovere 150 microlitri del mezzo e aggiungere 200 microlitri di mezzo di scongelamento dei cardiomiociti in ciascun pozzetto. Quindi ripetere il lavaggio RPMI come menzionato durante la generazione di sferoidi cardiaci, seguito dal mantenimento delle cellule nel mezzo di maturazione. Dopo una settimana di coltura, gli sferoidi cardiaci scongelati sono ottimali per la gestione dell'imaging ottico del calcio.Aspirare 150 microlitri di ciascun pozzetto. Trattare gli sferoidi cardiaci scongelati con 100 microlitri di Cal-520 AM calcium dye medium per pozzetto in condizioni di oscurità e incubare la piastra per 60 minuti. Preparare un sistema di acquisizione e analisi del calcio alimentando il microscopio e assicurandosi che l'opzione di controllo ambientale sia attiva.Regolare le dimensioni dell'apertura della fotocamera e dell'inquadratura per ridurre al minimo l'area di sfondo. Per misurare il segnale di calcio, utilizzando un laser a 488 nanometri, impostare il contrasto su uno sfondo nero con un segnale verde brillante durante il rilascio di calcio. Registra un video con un flusso costante da 2 a 10 picchi entro 10 secondi.Registra un video di 10 secondi e scansiona la piastra a 96 pozzetti, inizialmente spostandosi a sinistra, poi verso il basso a zigzag per coprire l'intera piastra. Dopo aver acquisito i transitori di calcio, analizzare i dati utilizzando il software di analisi delle tracce di fluorescenza. Gli sferoidi cardiaci hanno acquisito una struttura 3D entro il primo giorno dopo la semina, che potrebbe essere coltivata per un massimo di sei settimane.La maggior parte degli sferoidi cardiaci di tre settimane ha espresso un'organizzazione regolare del sarcomero con alfa actinina e troponina T. Alti livelli di alfa actinina nel giorno zero e sferoidi cardiaci di tre settimane hanno indicato una composizione cellulare costante e altamente pura durante la coltivazione. Un aumento dell'espressione dei geni cardiaci, dei desmosomi e dei mitocondri è stato osservato negli sferoidi rispetto agli hiPSC-CM coltivati in 2D per 90 giorni. La percentuale di battito degli sferoidi cardiaci era simile nelle prime tre settimane post-generazione ed è diminuita significativamente nella sesta settimana a causa del deterioramento degli sferoidi cardiaci.Il tasso di battitura è stato significativamente ridotto alla terza settimana rispetto e diminuito alla sesta settimana a causa del deterioramento. I parametri transitori del calcio hanno indicato un valore di picco più elevato alla seconda settimana, mentre il tempo di salita, il tempo di decadimento e la durata transitoria del calcio al 90% del decadimento sono aumentati significativamente alla terza settimana, dimostrando che gli sferoidi derivati da hiPSC-CM erano funzionalmente ottimali alle settimane due e tre dopo la generazione. La dimensione dello sferoide aumentava con il numero di cellule utilizzate per la semina.In dimensioni maggiori, vecchi sferoidi, il battito era significativamente più alto. Un tasso di battitura simile e significativamente più alto è stato mostrato dagli sferoidi 5k, 10k e 20k rispetto agli sferoidi 2.5k. La crioconservazione non ha influenzato la vitalità cellulare all'interno degli sferoidi cardiaci.Un'espressione simile di proteine sarcomeriche negli sferoidi scongelati e freschi di età corrispondente ha indicato l'efficienza della crioconservazione. Non c'è stato alcun cambiamento significativo nel tasso di battitura degli sferoidi cardiaci scongelati o freschi. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nel tempo di salita, nel tempo di decadimento e nel CTD90 di CS scongelato o fresco. Oltre alla modellizzazione della malattia e agli screening farmacologici ad alto rendimento, questi sferoidi possono essere utilizzati anche per bioreattori della produzione di vescicole extracellulari e terapie correlate alla vescicola extracellulare.Inoltre, il biobanking di questi sferoidi può essere utilizzato come nuova fornitura di cardiomiociti per strategie rigenerative. L'accumulo di prove suggerisce che le biobanche di modelli di cellule staminali derivate dal paziente per la fibrosi cistica, il cancro e gli sferoidi cardiaci hanno un grande potenziale per svelare i meccanismi molecolari per gli screening dei farmaci e per la medicina personalizzata.

Research

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Ricerca

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