Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
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著者は開示するものは何もありません。

心臓創薬は、正確な読み出しを実行するための不十分なスループットと生理学的忠実度を備えた非ヒト動物および細胞モデルへの依存によって妨げられています。hiPSC-CM生物学とHT機器および生理学的プローブを組み合わせることで、心臓病モデリングと創薬の初期段階にヒトモデルを再導入する可能性があります。我々は、最適な心疾患モデリングおよび薬物スクリーニングプラットフォームのための高品質で機能的なCSを生成する3次元心臓組織生成法を開発しました。さらに、産業用EV生産用の3Dバイオリアクターシステムにスフェロイド技術を組み合わせることで、EVベースの治療の臨床翻訳に向けて必要なステップが可能になります。ここで説明する方法は、いくつかの重要な要因に依存しており、既存のプロトコル9、10、28、29の変形である。これらの方法には、1)3D組織構築物の生成、2)スクリーニング前の最適な細胞数とタイミング、3)機器の感度とハイスループット能力の向上、4)機能解析の前にスフェロイドを凍結できることが含まれます。前述のプロトコルとは異なり、提案されたプロトコルは、1日あたり最大1,500個のスフェロイドの生成とHTSへの適合性を説明しています。既存の96ウェルカルシウムイメージングシステムまたは24ウェルマルチプレックス操作心臓組織を使用して、10回の反復で6 x 0.5ログ用量にわたる100の化合物の従来の分析には、約5億から30億のhiPSC-CMが必要です31,32。提案されたアプリケーションは、96ウェルプレートが記載された方法と比較して播種密度の10%しか必要としないため、従来のシステムと比較して心臓スクリーニングのコストと時間効率を低下させます。さらに、ハンギングドロップ法などの以前のプロトコルと比較して、超低付着プレートでの自己凝集によるスフェロイドの生成により、単一の微小組織の高品質の自動イメージングが可能になります33。
この小さな3Dモデルは、 in vivo 心血管環境の生物学的および生理学的表現型を模倣しています。以前に実証されたように、カルシウム一過性は、2D単層細胞培養物と比較して3D心臓組織構築物において劇的に増加する34。
次に、播種密度と適切な培養時間もCSスクリーニングを成功させるための重要な要素であることがわかりました。スフェロイドあたりの10K-20K hiPSC-CMの密度と、生成後2〜3週の間のスクリーニングは最適でしたが、小さすぎるスフェロイドまたは古すぎるスフェロイドはカルシウム処理の乱れを示します(図2 および 図3)。したがって、サイズが機能パラメータに影響を与えるため、播種密度をできるだけ一定に保つことが重要です。また、この光学的方法は、組織全体としての生きた3D培養に対して良好な結果をもたらしますが、時間のかかる組織学的方法に頼らずに、より大きなスフェロイド内のデータを(サブ)細胞レベルで取得することは困難です。最近、マーカーの単一細胞定量の機会を備えた3Dスフェロイド全体の取得を可能にする「光学的透明化」を使用したいくつかのアプローチが発表されています。ここでは、CSハーベスティングから共焦点顕微鏡を使用した3Dイメージングに最適化された画像解析までの3日間のプロトコルを採用しました29 (図1C および 図4D)。
最後に、3D心臓組織アプリケーションと商用アプリケーションの増加に伴い、さまざまなドナーからの長期保存と患者固有のバイオバンキングの需要が高まっています。凍結保存は、時間の経過とともに複数のバッチからHTSプレートを生成するための効果的な戦略です。hiPSC-CMの凍結は以前に説明されており、他の培養細胞タイプと比較して違いはありません10、35、36。最近、2D細胞でプレートを凍結するためのアプローチが記載されている37。ここでは、PSC凍結保存キットが他の3つ(データ示さず)と比較して最適な条件であることを発見し、スフェロイドの効率的な凍結のためにこの培地を使用しました。凍結保存後、生存率は高いままですが(図4B、C)、CSの電気生理学的特性が影響を受け、解凍後のインキュベーション期間が必要です。実際、融解の1週間後、CSは自発的な拍動活性とカルシウムの取り扱いを示しました。しかしながら、新鮮および回収されたhiPSC-CMは、必ずしも同一の分子的および生理学的特性を示すとは限らないことが記載されている38。凍結保存されたhiPSC-CMを薬物誘発性心臓読み出しの評価に使用する場合は、この制限を考慮する必要があります。さらに、スフェロイド当たりの細胞数やカルシウム一過性イメージングの最適なタイミングを効果的に調節するが、hiPS細胞由来の心筋細胞を内皮細胞、線維芽細胞、細胞間接合部、細胞間マトリックス(キトサン、コラーゲンIV、フィブロネクチン、マトリゲル、ラミニンなど)と混合し、生体内心臓環境を模倣することで、心臓スフェロイドを改善することができた39。40。全体として、疾患モデリングやHT薬物スクリーニングなどのダウンストリームアプリケーションに適したCSを効率的に生成するための段階的なプロトコルを提案します。

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の発見は、ヒトの発生と疾患を細胞レベルで研究する前例のない機会を提供しました。過去10年間で、発達の教訓を使用して、hiPS細胞を心筋細胞(CM)に効率的に分化させるためのさまざまなプロトコルが確立されてきました1,2,3,4。hiPSC由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、遺伝的に遺伝する心血管疾患(CVD)のモデリング、新薬の心臓安全性の試験、および心臓再生戦略のためのリソースとして役立ちます5、6、7、8。hiPS細胞の指向性心臓分化にもかかわらず、成熟したhiPSC-CMは一般に非増殖性であり、初代ヒト細胞は大量に入手できないため、心臓分野では不定のCM数が依然として課題です。
最近、我々は、低細胞密度培養によるWntシグナル伝達活性化が、hiPSC-CMの大規模な増殖応答(最大250倍)をもたらすことを説明しました9,10。培養フラスコフォーマットでのシリアル継代によるhiPSC-CMの大規模な拡張のためのこの費用対効果の高い戦略は、多数の機能的なhiPSC-CMの標準化と品質管理を容易にします。さらに、様々なドナーからのhiPSC-CMの大量バッチの需要に追いつくために、hiPSC-CMのバイオバンキングが記載されている10。しかしながら、これらの標準的な培養皿に播種された心筋細胞単層は、心臓に存在する複雑な3D構造を代表するものではない。さらに、hiPSC-CMの未熟さは依然として障害であり、したがって、in vivo心血管環境の生物学的および生理学的表現型を模倣するには不十分です。
新しい3Din vitroモデルが開発されており、hiPSC-CMは、自己組織化11,12、細胞外マトリックス(ECM)リモデリング13、成熟の亢進14,15,16、同期収縮17,18,19などのより近い生理学的挙動を示します。.3Dモデルは、創薬、薬物心毒性試験、疾患モデリング、再生療法、さらには最初の臨床試験に利用されています20、21、22、23、24。最も使用されるモデルの1つは、フィブリンベースの人工心臓組織(EHT)であり、組織様配置および心臓収縮性を示す13,17,25。これまでに、拡張型hiPSC-CMから作製したEHTは、非拡張型hiPSC-CMと同等の収縮性を示し、拡張後も損なわれない細胞機能を示すことを示しました9。しかしながら、hiPSC-CMからのEHTの生成は十分に確立されているが、HT評価プラットフォームの確立に関してはさらなる進展が期待される。ここでは、96ウェルフォーマットの多数の自己凝集型心筋スフェロイド(CS)を迅速に生成することで、ハイスループットスクリーニング(HTS)目的の3D条件を改善することができます。
全体として、3D細胞培養としてのCSの利点は、その高い再現性とスケーラビリティです。特に、ロボットによるサンプルハンドリングと組み合わせたCSは、CS培養、薬物処理、およびハイコンテント分析を標準化および自動化することができます20。ここでは、光学カルシウム取得および分析システムを使用してCa2+過渡測定を行うことにより、効率的に凍結保存および心機能のスクリーニングが可能な、高純度で高品質のCSを生成するための最適化されたプロトコルについて説明します。このモデルは、数百から数千のスフェロイド17,18でハイスループットスクリーンを実行するためのシンプルでありながら強力なツールを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、ヒト心臓病のモデリングと治療にとって最も重要です。私たちは最近、hiPSC-CMを2次元(2D)で大規模に拡大するための費用対効果の高い戦略を発表しました。2つの大きな制限は、細胞の未熟さと、ハイスループットスクリーニング(HTS)プラットフォームにおける3次元(3D)配置とスケーラビリティの欠如です。これらの制限を克服するために、拡張された心筋細胞は、3D心臓細胞培養および組織工学技術の生成に理想的な細胞源を形成します。後者は心臓血管分野で大きな可能性を秘めており、より高度で生理学的に関連するHTSを提供します。ここでは、96ウェルフォーマットの心臓スフェロイド(CS)の生成、メンテナンス、および光学分析のための容易なスケーラビリティを備えたHTS互換ワークフローについて説明します。これらの小さなCSは、現在の in vitro 疾患モデルおよび/または3D組織工学プラットフォームの生成に存在するギャップを埋めるために不可欠です。CSは、高度に構造化された形態、サイズ、および細胞組成を示します。さらに、CSとして培養されたhiPSC-CMは、成熟度が高く、自発的なカルシウム処理や収縮活動など、ヒト心臓のいくつかの機能的特徴を示します。CSの生成から機能解析までのワークフロー全体を自動化することで、ハイスループット(HT)イメージングやカルシウムハンドリング分析で実証されるように、バッチ内およびバッチ間の再現性を向上させます。記載されたプロトコルは、完全に自動化されたHTSワークフローにおいて、心臓病のモデリングおよび複雑な3D細胞環境内の単一細胞レベルでの薬物/治療効果の評価を可能にする。さらに、この研究では、全スフェロイドの長期保存とバイオバンキングのための簡単な手順を説明し、それによって研究者に次世代の機能的組織ストレージを作成する機会を提供します。HTSと長期保存を組み合わせることで、創薬・試験、再生医療、個別化医療の開発など、幅広い分野でのトランスレーショナルリサーチに大きく貢献します。

図1Aに示すプロトコルは、以前に拡張されたhiPSC-CMからのCSの生成を示しています。CSは、播種後1日目までに超低接着丸底プレートで3D構造を取得し、最大6週間培養することができます(図1B)。免疫蛍光染色によって評価されるように、3週齢CSの細胞の大部分は、α-アクチニンやトロポニンTなどのサルコメアタンパク質を発現し、規則的なサルコメア組織を示しました(図1C)。α-アクチニン陽性細胞の定量のために、フローサイトメトリー分析を行った。免疫蛍光法の結果によると、フローサイトメトリーデータは、0日目(76.9%±16.6%)と3週齢のCS(71.1%±22.7%)の両方で同等の高レベルのαアクチニンを示し(図1D)、培養中に一定で高純度の細胞組成を示しました。hiPSC-CM由来のスフェロイド(42日目)では、接合部(GJA1、JPH2、およびPKP2)、デスモソーム(DES)、およびミトコンドリア(ATP5A)の心臓遺伝子の発現が、2Dで90日間培養されたhiPSC-CMと比較して増加しました(図1E)。これらの遺伝子の発現は、細胞間相互作用および成熟の特徴である30。
続いて、CSの機能特性、すなわち叩解率とCa2+処理を異なる時点で評価しました(図2)。立ち上がり時間、ピーク時間、減衰時間、カルシウム過渡持続時間(CTD90)などのカルシウム過渡パラメータは、図2A、Bに示すように評価されました。CSを叩く割合は、生成後最初の3週間で類似していますが、6週目(Wk6)のCSでは大幅に低下しました(図2C)。叩動率はWk1と比較してWk3で有意に低下し、CSの叩解率と同様に、Wk6で劇的に低下しました(図2D)。Wk6ではCSの劣化が見られ、これは拍動速度と拍解CS数の両方の低下を説明することができます。 カルシウム過渡パラメータの測定では、Wk2で有意に高いピーク値が示され(図2E)、立ち上がり時間、減衰時間、およびCTD90はWk1と比較してWk3で有意に増加しました(図2F-H).まとめると、これらの結果は、hiPSC-CM由来のスフェロイドが、世代後2週目と3週目頃に機能的に最適であることを示しています。
図3は、拍動速度およびカルシウム取り扱いに対するスフェロイドサイズの影響を示す。CSは、96ウェルプレートのウェルに2.5 x 10 4、5 x 10 4、10 x 104、および20 x 10 4 hiPSC-CMを播種することによって生成され、条件ごとに合計24個のCS/ウェルになりました(図3A)。予想通り、使用する細胞数が増えるにつれてスフェロイドのサイズが大きくなり、178 ± 36 μmから351 ± 65 μmの範囲になりました(図3A、右パネル)。Ca2+過渡現象は、3週齢のCSで4つの異なる播種密度で測定されました(図3B)。叩倒CSの測定では、小型のCS(2.5Kおよび5K-CS)の約50%のみが鼓動しているのに対し、大きなサイズの叩きCSの割合(10Kおよび20K-CS)の割合は有意に高い(約85%)ことが示されました(図3C)。同様の鼓動速度(約28bpm)は、5K、10K、および20K-CSによって示され、2.5K-CSと比較して有意に高かった(図3D)。カルシウム画像のピーク値はすべてのテスト条件で類似していましたが(図3E)、立ち上がり時間(図3F)、減衰時間(図3G)、およびCTD90(図3H)は、小さいサイズ(2.5Kおよび5K-CS)と比較して、大きいサイズCS(10Kおよび20K-CS)で有意に増加しました。これらの結果を総合すると、hiPSC-CM由来のスフェロイドは、10K〜20K hiPSC-CM/ウェルの播種密度を使用する場合、カルシウム取り扱いスクリーニングに最適であることがわかります。
次に、凍結保存がCSの生存率と機能に与える影響を評価しました。分析前に、融解したCSを培養液中で1週間維持した(図4A)。フローサイトメトリー(図4B)およびCalcein-AM(図4C)の両方の細胞生存率試験によって示されるように、凍結保存はCS内の細胞生存率に影響しなかった。 さらに、融解CSは、新鮮な年齢を一致させたCSと比較して、同様のサルコメアタンパク質の発現レベルを示した(図4D)。これらのデータは、CSがその後の心機能解析およびハイスループットスクリーニングのために効率的に凍結保存できることを示しています。
最後に、叩解活性とCa2+取り扱いを、新鮮なCSと凍結保存されたCSの両方で測定しました(図5)。CSを叩解する割合は、解凍後の異なる時点で、それぞれ2、5、および7日目に測定されました。新鮮なCSのほとんどは時間の経過とともに拍動活性を示しましたが、凍結保存されたCSは、拍動活性を回復するために最大1週間の培養を必要としたことは明らかです(図5B)。解凍したCSと新鮮なCSの鼓動率に有意な変化はなかった。しかし、一部の凍結CSでは自発的な拍動活動は観察されませんでした(図5C)。凍結/解凍CSでは、新鮮なものと比較してピーク値が大幅に減少しましたが(図5D)、新鮮なものと比較して、凍結/解凍されたCSの立ち上がり時間、減衰時間、およびCTD90に大きな変化は見られませんでした(図5E-G)。これらのデータは、融解後、拍動活性およびCa2+過渡を測定する前に、CSをインキュベーター内で少なくとも1週間回復させることが重要であることを示している。
これらの結果は、hiPSC-CM由来スフェロイドの凍結保存が、心筋細胞の生存率、サルコメア構造、および自発拍動活性やカルシウム取り扱いなどの機能的特徴を維持することを示しています。したがって、hiPSC-CM由来のスフェロイドは、 in vitroで心臓電気生理学を正確に要約するのに適したモデルを表しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> 図1:心臓スフェロイドの生成 。 (A)Wntベースの指向性心臓分化、その後のhiPSC-CMの拡大、およびCSの生成の模式図。 biorender.com で作成。(B)CS培養の異なる時点での明視野画像。スケールバー、200μm。Wk は週を表します。(C)3週齢CSにおける心臓サルコメアタンパク質α-アクチニンおよびトロポニンTの代表的な免疫蛍光画像。 免疫蛍光:ヘキスト(青)、α-アクチニン(緑)、およびトロポニンT(赤)。スケールバー、200μm。右側のズームインマージ画像は、サルコメア組織を示しています。スケールバー、50μm。 (D)CSの形成前(0日目)および3週間後のα-アクチニン陽性細胞のフローサイトメトリー定量(条件あたりn = 14〜23。(E)細胞接合部、中間径フィラメント、ミトコンドリアに関連するさまざまな心臓遺伝子の発現レベルを確立するために、90日間培養したhiPSC-CMおよび42日間培養したスフェロイドサンプルに対してRT-qPCRを実施します。(n = 1〜3バッチ)。データは、対応のないt検定によって計算されたSD.NS(有意でない)±平均値として表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> 図2:生成後の異なる週におけるCSにおける叩解率とカルシウム処理。 (A)CyteseerソフトウェアのVala科学分析アルゴリズムによって計算されたカルシウム過渡パラメータの例。(B)生成後の異なる時点(数週間)におけるCSの代表的なカルシウム過渡痕跡とタイムラプス画像。スケールバー、200μm。 (C)自発拍動活動の経時変化定量は、叩解CSの割合として表されます。 (D)培養時間中のCSの叩解率。(E-H)カルシウム過渡現象の定量は、ピーク値、立ち上がり時間、減衰時間、およびCTD90を示す。生物学的反復=3、技術反復=38、50、66、および7のそれぞれ、および生物学的反復=38、50、66、および7の±SDの平均を示すデータ。*p < 0.05, ****p < 0.001;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後多重比較検定。略語;CTD =カルシウム過渡持続時間、Wk =週、CSs =ヒト心臓スフェロイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> 図3:異なる細胞播種密度を用いて生成されたCSにおける拍解速度およびカルシウム処理。 (A)異なる数のhiPSC-CMを用いて作製したCSの明視野イメージング(左)とサイズ測定(右)。スケールバー、200 μm。 (B)2.5K-20K-CSの代表的なカルシウム過渡痕跡とタイムラプス画像。(C,D)2.5K-20K-CSの殴打率と打率。(E-H)ピーク値、立ち上がり時間、減衰時間、および2.5K-20K-CSのCTD90±生物学的反復= 3、技術的反復= 28-39。*p < 0.05, ****p < 0.001;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後多重比較検定。略語:CTD =カルシウム過渡持続時間、Wk =週、k = x 1,000細胞、CSs =心臓スフェロイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> 図 4.心臓スフェロイドの生存率と構造に対する凍結保存の影響。 (A)CS生成、その後のバイオバンキング、融解の模式図。(B)新鮮なCSと凍結保存されたCSの両方におけるフローサイトメトリー細胞生存率試験。ポジティブコントロールとして、10%Triton-X溶液による5分間の処理を使用した。(条件あたりn = 4)。データは、SD±平均値として表されます。 ** **p < 0.001;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後多重比較検定。(C)培養7日後の新鮮なCSと解凍したCSのカルセインAM細胞生存率試験(条件あたりn = 15-17、 ****p < 0.001、対応のあるt検定による;スケールバー、200μm)。(D)新鮮および融解したCSにおけるα-アクチニンおよびトロポニンT発現の代表的な明視野(左)および免疫蛍光染色。 免疫蛍光:ヘキスト(青)、α-アクチニン(緑)、およびトロポニンT(赤)。右側のマージされた写真は、CSのサルコメア線条を示しています。 スケールバー、50μm。 略語:X =選択の解凍日、PI =ヨウ化プロピジウム、Cal-AM =カルセイン-AM、EthD-I =エチジウムホモダイマーI。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> 図5:新鮮なCSと解凍したCSのカルシウム過渡現象。 (A)凍結保存前および融解後1週間のCSの代表的なカルシウム過渡痕跡とタイムラプス画像。(B)新鮮および凍結/解凍された心臓スフェロイドの拍動率。棒グラフは個々の実験を表します。(C)新鮮および凍結/解凍された心臓スフェロイドの鼓動率。(D-G)カルシウム過渡パラメータの定量化:ピーク値、立ち上がり時間、減衰時間、CTD90。データは平均±SDです。 *p < 0.05, ****p < 0.001;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後多重比較検定。略語;CTD = カルシウム過渡持続時間、CSs = 心スフェロイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:フローサイトメトリー分析のための代表的なゲーティング戦略。 (A)純粋な集団におけるα-アクチニン陽性hiPSC-CMの代表的なゲーティング戦略と陰性対照およびアイソタイプ対照の比較。α-アクチニン陽性の分析細胞数は25 x 105である。略語;SSC = 側方散乱、PI+ = ヨウ化プロピジウム陽性。(B)新鮮、解凍、ポジティブコントロール(Triton-X)、およびネガティブコントロール(染色なし)の両方での生存率分析のための代表的なゲーティング戦略。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

このプロトコルは、心臓スフェロイドの生成、維持、および光学分析のためのワークフローを記述します。これらの心臓スフェロイドは、現在のin vitro疾患モデルのギャップを埋めるために不可欠です。この技術により、研究者は心臓スフェロイドの次世代のハイスループットスクリーニングと機能的ストレージを作成することができます。まず、コンフルエントなヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞を含む培養プレートの各ウェルに、1ミリリットルの1ミリリットル四方の滅菌心臓剥離液を加えます。プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。白・丸型の細胞を明視野顕微鏡の倍率4倍で観察し、細胞の剥離を確認します。5ミリリットルのピペットを使用して、2ミリリットルの温かい基礎培地で細胞を洗い流すことによって細胞を機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、300gで3分間遠心分離する。その後、上清を吸引し、細胞を1ミリリットルのhiPSC-CM再めっき培地に再懸濁した。1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞ペレットを解離します。3〜4回混合した後、溶液が均一に見えるので、カセットにロードして細胞をカウントし、100マイクロリットルの再メッキ培地中の適切な量の細胞を超低接着、丸底、96ウェルプレートの各ウェルに移します。心臓スフェロイドプレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに70rpm、温度37°C、二酸化炭素5%、酸素21%、湿度90%で24時間置きます。スフェロイドの破裂を避けるために、各ウェルから50マイクロリットルの培地のみを吸引し、最初の48時間はウェルあたり100マイクロリットルのRPMIとB27培地を追加します。次に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を吸引し、1ウェルあたり100マイクロリットルの成熟培地を添加する。成熟培地で細胞を維持し、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。スフェロイドプレートを氷上に10分間置き、予冷してから、プレートを70gで3分間遠心分離します。50マイクロリットルがウェルに残るまで培地を取り除きます。次に、ウェルあたり200マイクロリットルの氷冷hiPSC凍結培地を追加します。プレートシールフィルムでプレートをシールします。シリコンモールドを準備するには、シリコンエラストマーキットのコンポーネントを10対1の比率で混合し、ウェルプレートの下部内に溶液を追加します。真空ポンプを使用して15〜20分間溶液を脱泡します。金型をオーブンに入れ、摂氏60度で8時間硬化させて、プレートから剥がした半可撓性エラストマーを得ます。密封されたプレートをシリコン型に注意深く入れ、ウェルプレートと冷凍庫の間の均一な熱交換を確保します。プレートを液体窒素タンクまたは摂氏150度の冷凍庫に移して長期保管する前に、準備したシリコーン型でプレートを摂氏80度で最低4時間凍結します。心臓スフェロイドの迅速な解凍を確実にするために、液体窒素から心臓スフェロイドを含む細胞プレートを一度に1枚集め、摂氏37度、二酸化炭素5%、酸素21%、湿度90%のインキュベーターに15分間入れます。シーリングフィルムをプレートから取り除き、各ウェルの150マイクロリットルを吸引してから、200マイクロリットルの温かい基礎培地を各ウェルに加えます。プレートを70gで3分間遠心分離し、温かい基礎培地洗浄を繰り返します。完了したら、150マイクロリットルの培地を除去し、各ウェルに200マイクロリットルの心筋細胞融解培地を追加します。次いで、心臓スフェロイド生成中に述べたようにRPMI洗浄を繰り返し、次いで成熟培地中の細胞を維持する。培養の1週間後、融解した心臓スフェロイドはカルシウム取り扱い光学イメージングに最適です。各ウェルの150マイクロリットルを吸引する。融解した心臓スフェロイドを暗所条件下でウェルあたり100マイクロリットルのCal-520 AMカルシウム色素培地で処理し、プレートを60分間インキュベートします。顕微鏡に電力を供給し、環境制御オプションがオンになっていることを確認して、カルシウム取得および分析システムを準備します。カメラとフレーミングの絞り寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。カルシウム信号を測定するには、488ナノメートルのレーザーを使用して、カルシウム放出中の明るい緑色の信号でコントラストを黒い背景に設定します。2秒以内に10〜10ピークの一貫したストリームでビデオを録画します。10秒のビデオを録画し、96ウェルプレートをスキャンし、最初は左に移動し、次にジグザグに下に移動してプレート全体を覆います。カルシウム過渡現象を取得した後、蛍光トレース解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。心臓スフェロイドは播種後1日目までに3D構造を獲得し、最大6週間培養することができました。3週齢の心臓スフェロイドの大部分は、アルファアクチニンとトロポニンTで規則的なサルコメア組織を発現し、0日目と3週齢の心臓スフェロイドの高レベルのアルファアクチニンは、培養中に一定で高純度の細胞組成を示しました。心臓遺伝子、デスモソーム、およびミトコンドリアの発現の増加は、2Dで90日間培養したhiPSC-CMよりもスフェロイドで観察されました。心臓スフェロイドの拍動率は、世代後最初の3週間で同様であり、心臓スフェロイドの劣化により6週目に大幅に低下しました。殴動率は3週目と比較して大幅に低下し、悪化の結果として6週目に低下しました。カルシウム過渡パラメータは2週目に高いピーク値を示し、上昇時間、減衰時間、および崩壊90%でのカルシウム過渡持続時間は3週目に有意に増加し、hiPSC-CM由来のスフェロイドが生成後2週目と3週目に機能的に最適であることを示しています。スフェロイドサイズは、播種に使用される細胞の数とともに増加しました。より大きなサイズの古い回転楕円体では、鼓動は有意に高かった。5k、10k、および20kのスフェロイドは、2.5kのスフェロイドと比較して、同様の有意に高い鼓動率を示しました。凍結保存は、心臓スフェロイド内の細胞生存率に影響を与えませんでした。融解および新鮮な年齢を合わせたスフェロイドにおけるサルコメアタンパク質の同様の発現は、凍結保存効率を示した。融解または新鮮な心臓スフェロイドの拍動速度に有意な変化はなかった。立ち上がり時間、減衰時間、および解凍または新鮮なCSのCTD90に大きな変化は見られませんでした。疾患モデリングやハイスループット薬物スクリーニングの他に、これらのスフェロイドは細胞外小胞産生のバイオリアクターや細胞外小胞関連療法にも使用できます。また、これらのスフェロイドのバイオバンキングは、再生戦略のための新しい心筋細胞供給として使用することができます。嚢胞性線維症、がん、心臓スフェロイドの患者由来幹細胞モデルのバイオバンクは、薬物スクリーニングや個別化医療の分子メカニズムを解明する大きな可能性を秘めていることが示唆されています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

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ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

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Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

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Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...