Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
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Os autores não têm nada a revelar.

A descoberta de medicamentos cardíacos é dificultada por uma dependência de modelos celulares e animais não humanos com rendimento inadequado e fidelidade fisiológica para realizar leituras com precisão. A biologia hiPSC-CM, juntamente com a instrumentação HT e sondas fisiológicas, tem o potencial de reintroduzir modelos humanos nos estágios iniciais da modelagem de doenças cardíacas e da descoberta de medicamentos. Desenvolvemos um método de geração de tecido cardíaco 3D que produz CSs funcionais e de alta qualidade para uma plataforma ideal de modelagem de doenças cardíacas e triagem de medicamentos. Além disso, a combinação da tecnologia esferoide em sistemas de biorreatores 3D para a produção industrial de EV permite um passo necessário em direção à tradução clínica da terapia baseada em EV. O método aqui descrito baseia-se em vários fatores cruciais e é uma variante dos protocolos existentes 9,10,28,29. Esses métodos incluem: 1) a geração de construções de tecido 3D, 2) o número ideal de células e o tempo antes da triagem, 3) melhorar a sensibilidade e a capacidade de alto rendimento dos instrumentos e 4) ser capaz de congelar os esferoides antes de qualquer análise funcional. Ao contrário dos protocolos descritos anteriormente, o protocolo proposto descreve a geração de até 1.500 esferoides por dia e a adequação para HTS. A análise convencional de uma centena de compostos com mais de 6 x 0,5 log doses para 10 replicações usando sistemas de imagem de cálcio de 96 poços existentes ou tecidos cardíacos modificados multiplexados de 24 poços requer aproximadamente 500 milhões a 3 bilhões de CMs hiPSC-31,32. A aplicação proposta torna os rastreios cardíacos menos dispendiosos e eficazes em termos de tempo em comparação com os sistemas convencionais, uma vez que as placas de 96 poços exigiram apenas 10% da densidade de semeadura em comparação com o método descrito. Além disso, em comparação com protocolos anteriores, como o método hanging-drop, a geração de esferoides por autoagregação em placas de fixação ultrabaixa permite imagens automatizadas de alta qualidade de microtecidos únicos33.
Este pequeno modelo 3D imita o fenótipo biológico e fisiológico do ambiente cardiovascular in vivo. Como demonstrado anteriormente, os transientes de cálcio aumentam drasticamente nos construtos de tecido cardíaco 3D em comparação com as culturas de células monocamada 2D34.
Em seguida, descobrimos que a densidade de semeadura e o tempo de cultivo adequado também são fatores críticos para uma triagem de CS bem-sucedida. As densidades de 10K-20K hiPSC-CMs por esferoide e triagem entre as semanas 2-3 após a geração foram ótimas, enquanto esferoides muito pequenos ou muito velhos mostram manuseio de cálcio perturbado (Figura 2 e Figura 3). Portanto, é importante manter as densidades de semeadura o mais consistentes possível, uma vez que o tamanho influencia os parâmetros funcionais. Além disso, embora este método óptico forneça bons resultados para culturas 3D vivas como um todo o tecido, a obtenção de dados dentro de esferoides maiores a nível (sub)celular é um desafio sem depender de métodos histológicos demorados. Recentemente, várias abordagens foram publicadas que usaram "limpeza óptica", que permite a aquisição de esferoides 3D inteiros com a oportunidade de quantificação de marcadores de célula única. Aqui, adaptamos um protocolo de 3 dias da coleta de CS para a análise de imagens, que é otimizado para imagens 3D usando microscopia confocal29 (Figura 1C e Figura 4D).
Por fim, com o aumento das aplicações de tecido cardíaco 3D e aplicações comerciais, a demanda por armazenamento a longo prazo e biobanco específico do paciente de vários doadores está aumentando. A criopreservação é uma estratégia eficaz para gerar placas HTS a partir de vários lotes ao longo do tempo. O congelamento de CME-hiPSC já foi descrito anteriormente e não é diferente em comparação com outros tipos de células cultivadas 10,35,36. Recentemente, abordagens para congelamento de placas com células 2D têm sido descritas37. Aqui, descobrimos que o kit de criopreservação PSC é a condição mais ideal em comparação com três outros (dados não mostrados) e usamos esse meio para o congelamento eficiente de esferoides. Após a criopreservação, a viabilidade permanece elevada (Figura 4B,C), mas as propriedades eletrofisiológicas dos CSs são afetadas e é necessário um período de incubação após o descongelamento. De fato, 1 semana após o descongelamento, os CSs apresentaram atividade espontânea de batimento e manuseio de cálcio. No entanto, tem sido descrito que os CM-hiPSC frescos e recuperados nem sempre apresentam propriedades moleculares e fisiológicas idênticas38. Essa limitação precisa ser considerada quando os CM-hiPSC criopreservados são usados para avaliar leituras cardíacas induzidas por medicamentos. Além disso, embora efetivamente modulemos o número de células por esferoide e o momento ideal da imagem transitória de cálcio, os esferoides cardíacos poderiam ser melhorados pela mistura de células cardiomiócitos derivadas de hiPSC com células endoteliais, fibroblastos, junções célula-célula e matrizes extracelulares, como quitosana, colágeno IV, fibronectina, matrigel ou laminina, imitando o ambiente cardíaco in vivo 39, 40. No geral, propomos um protocolo passo-a-passo para gerar eficientemente CSs que são adequados para aplicações a jusante, como modelagem de doenças e triagem de medicamentos HT.

A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) ofereceu oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento humano e a doença no nível celular. Ao longo da última década, utilizando lições de desenvolvimento, vários protocolos têm sido estabelecidos para garantir a diferenciação eficiente de hiPSCs em cardiomiócitos (MCs)1,2,3,4. Os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) podem servir como um recurso para modelar doenças cardiovasculares geneticamente hereditárias (DCV), testar a segurança cardíaca para novos medicamentos e estratégias regenerativas cardíacas 5,6,7,8. Apesar da diferenciação cardíaca direcionada das hiPSCs, os números indefinidos de MC continuam sendo um desafio no campo cardíaco, uma vez que os CM-HCs hiPSC amadurecidos geralmente não são proliferativos e as células humanas primárias não estão disponíveis em grandes quantidades.
Recentemente, descrevemos que a ativação concomitante da sinalização Wnt com cultura de baixa densidade celular resultou em uma resposta proliferativa maciça (até 250 vezes) de hiPSC-CMs 9,10. Essa estratégia econômica para a expansão maciça de hiPSC-CMs via passagem serial em formato de frasco de cultura facilita a padronização e o controle de qualidade de um grande número de hiPSC-CMs funcionais. Além disso, para acompanhar a demanda por grandes lotes de hiPSC-CMs de vários doadores, o biobanco de hiPSC-CMs tem sido descrito10. No entanto, as monocamadas de cardiomiócitos semeadas nessas placas de cultura padrão não são representativas da complexa estrutura 3D presente no coração. Além disso, a imaturidade dos CME-hiPSC tem permanecido um obstáculo, ficando aquém de imitar o fenótipo biológico e fisiológico do ambiente cardiovascular in vivo.
Novos modelos 3D in vitro foram desenvolvidos onde os CM-hiPSC mostram um comportamento fisiológico mais próximo, como auto-organização 11,12, remodelamento da matriz extracelular (ECM) 13, maturação aumentada 14,15,16 e contração sincronizada17,18,19 . Modelos 3D têm sido utilizados para descoberta de medicamentos, testes de cardiotoxicidade de medicamentos, modelagem de doenças, terapias regenerativas e até mesmo os primeiros ensaios clínicos 20,21,22,23,24. Um dos modelos mais utilizados é o tecido cardíaco modificado à base de fibrina (EHT), que apresenta arranjo tecidual e contratilidade cardíaca13,17,25. Anteriormente, mostramos que os EHTs gerados a partir de hiPSC-CMs expandidos exibiam contratilidade comparável aos de hiPSC-CMs não expandidos, demonstrando funcionalidade celular não comprometida após a expansão9. No entanto, embora a geração de EHTs a partir de CM-hiPSC tenha sido bem estabelecida, esperam-se novos desenvolvimentos em relação ao estabelecimento de uma plataforma de avaliação de HT. Aqui, a rápida geração de um grande número de esferoides cardíacos auto-agregadores (CSs) no formato de 96 poços permite uma melhoria nas condições 3D para fins de triagem de alto rendimento (HTS).
No geral, a vantagem dos CSs como cultura de células 3D é sua alta reprodutibilidade e escalabilidade. Em particular, os CSs combinados com o manuseio robótico de amostras podem padronizar e automatizar a cultura de CS, o tratamento medicamentoso e a análise de alto conteúdo20. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para gerar CSs de alta pureza e alta qualidade, que podem ser eficientemente criopreservados e rastreados para a função cardíaca, realizando medições transitórias de Ca2+ usando um sistema óptico de aquisição e análise de cálcio. Este modelo fornece uma ferramenta simples, mas poderosa, para executar telas de alto rendimento em centenas a milhares de esferoides17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) são de suma importância para a modelagem e terapêutica de doenças cardíacas humanas. Publicamos recentemente uma estratégia econômica para a expansão maciça de CM-hiPSC em duas dimensões (2D). Duas grandes limitações são a imaturidade celular e a falta de arranjo tridimensional (3D) e escalabilidade em plataformas de triagem de alto rendimento (HTS). Para superar essas limitações, os cardiomiócitos expandidos formam uma fonte celular ideal para a geração de cultura de células cardíacas 3D e técnicas de engenharia de tecidos. Este último possui grande potencial no campo cardiovascular, proporcionando HTS mais avançada e fisiologicamente relevante. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho compatível com HTS com fácil escalabilidade para a geração, manutenção e análise óptica de esferoides cardíacos (CSs) em um formato de 96 poços. Esses pequenos CSs são essenciais para preencher a lacuna presente nos atuais modelos de doenças in vitro e/ou geração para plataformas de engenharia de tecidos 3D. Os CSs apresentam morfologia, tamanho e composição celular altamente estruturados. Além disso, os CMs hiPSC cultivados como CSs apresentam maturação aumentada e várias características funcionais do coração humano, como manuseio espontâneo de cálcio e atividade contrátil. Ao automatizar o fluxo de trabalho completo, desde a geração de CSs até a análise funcional, aumentamos a reprodutibilidade intra e interlotes, conforme demonstrado pela imagem de alto rendimento (HT) e pela análise de manuseio de cálcio. O protocolo descrito permite a modelagem de doenças cardíacas e a avaliação de efeitos medicamentosos/terapêuticos no nível de uma única célula dentro de um ambiente complexo de células 3D em um fluxo de trabalho HTS totalmente automatizado. Além disso, o estudo descreve um procedimento simples para preservação a longo prazo e biobanco de esferoides inteiros, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de criar armazenamento de tecidos funcionais de próxima geração. O HTS combinado com o armazenamento de longo prazo contribuirá substancialmente para a pesquisa translacional em uma ampla gama de áreas, incluindo descoberta e teste de medicamentos, medicina regenerativa e desenvolvimento de terapias personalizadas.

O protocolo mostrado na Figura 1A descreve a geração de CSs a partir de CMs-hiPSC previamente expandidos. Os CSs adquirem uma estrutura 3D no dia 1 pós-semeadura em placas de fundo redondo de fixação ultrabaixa e podem ser cultivados por até 6 semanas (Figura 1B). Conforme avaliado pela coloração por imunofluorescência, a maioria das células em CSs de 3 semanas de idade expressou proteínas sarcômeras como α-actinina e troponina T e apresentou organização regular do sarcômero (Figura 1C). Para a quantificação de células positivas para α-actinina, foi realizada análise de citometria de fluxo. De acordo com os resultados da imunofluorescência, os dados da citometria de fluxo demonstraram níveis elevados comparáveis de α-actinina tanto no dia 0 (76,9% ± 16,6%) quanto nos CSs de 3 semanas de idade (71,1% ± 22,7%) (Figura 1D), indicando uma composição celular constante e altamente pura durante a cultura. Houve aumento da expressão dos genes cardíacos para junções (GJA1, JPH2 e PKP2), desmossomos (DES) e mitocôndrias (ATP5A) em esferoides derivados de hiPSC-CM (dia 42) versus hiPSC-CMs cultivados em 2D por 90 dias (Figura 1E). A expressão desses genes é uma marca registrada da interação célula-célula e maturação30.
Posteriormente, as propriedades funcionais dos CSs, ou seja, a taxa de batimento e o manuseio de Ca2+, foram avaliadas em diferentes momentos (Figura 2). Parâmetros transitórios de cálcio como tempo de elevação, tempo de pico, tempo de decaimento e duração transitória de cálcio (CTD90) foram avaliados conforme indicado na Figura 2A,B. A porcentagem de espancamento de CSs é semelhante nas primeiras 3 semanas pós-geração, mas caiu significativamente na semana 6 (Wk6) CSs (Figura 2C). A taxa de batimento foi significativamente reduzida em Wk3 em comparação com Wk1 e, semelhante à porcentagem de espancamento de CSs, caiu drasticamente em Wk6 (Figura 2D). No Wk6, observou-se deterioração da CS, o que pode explicar a queda tanto na taxa de batimento quanto no número de CSs de batimento. A medição dos parâmetros transitórios de cálcio indicou um valor de pico significativamente maior em Wk2 (Figura 2E), enquanto o tempo de subida, o tempo de decaimento e o CTD90 foram significativamente aumentados em Wk3 em comparação com Wk1 (Figura 2F-H ). Tomados em conjunto, esses resultados mostram que os esferoides derivados de hiPSC-CM são funcionalmente ótimos em torno das semanas 2 e 3 pós-geração.
A Figura 3 mostra o efeito do tamanho do esferoide sobre a taxa de batimento e o manuseio do cálcio. Os CSs foram gerados pela semeadura de 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 e 20 x 10 4 hiPSC-CMs em um poço de uma placa de 96 poços para um total de 24 CSs/poços por condição (Figura 3A). Como esperado, o tamanho do esferoide aumentou à medida que o número de células utilizadas aumentou, variando de 178 ± 36 μm a 351 ± 65 μm (Figura 3A, painel direito). Os transientes de Ca2+ foram medidos em CSs de 3 semanas de idade nas quatro diferentes densidades de semeadura (Figura 3B). As medidas de CSs de batimento indicaram que apenas cerca de 50% dos CSs de tamanho menor (2,5K e 5K-CSs) estavam batendo, enquanto a porcentagem de CSs de tamanho maior (10K e 20K-CSs) foi significativamente maior (cerca de 85%) (Figura 3C). Uma taxa de batimento semelhante (aproximadamente 28 bpm) foi mostrada por 5K-, 10K-, e 20K-CSs, que foi significativamente maior em comparação com 2.5K-CSs (Figura 3D). Os valores de pico das imagens de cálcio foram semelhantes em todas as condições testadas (Figura 3E), no entanto, o tempo de elevação (Figura 3F), o tempo de decaimento (Figura 3G) e o CTD90 (Figura 3H) foram significativamente aumentados em CSs de tamanho maior (10K- e 20K-CSs) em comparação com os menores (2,5K- e 5K-CSs). Tomados em conjunto, esses resultados mostram que os esferoides derivados de hiPSC-CM são ideais para triagem de manuseio de cálcio quando uma densidade de semeadura entre 10K e 20K hiPSC-CMs/poço é usada.
Em seguida, avaliou-se o impacto da criopreservação na viabilidade e função da CS. Antes da análise, os CSs descongelados foram mantidos em cultura por 1 semana (Figura 4A). Como demonstrado pelos testes de viabilidade celular de citometria de fluxo (Figura 4B) e Calcein-AM (Figura 4C), a criopreservação não afetou a viabilidade celular dentro dos CSs. Além disso, os CSs descongelados mostraram níveis de expressão semelhantes de proteínas sarcômeras em comparação com os CSs pareados por idade fresca (Figura 4D). Esses dados indicam que os CSs podem ser eficientemente criopreservados para posterior análise da função cardíaca e triagem de alto rendimento.
Por fim, a atividade de batimento e o manuseio de Ca2+ foram medidos em CSs frescos e criopreservados (Figura 5). A porcentagem de espancamento de CSs foi medida em diferentes momentos após o descongelamento, respectivamente, aos 2, 5 e 7 dias. Enquanto a maioria dos CSs frescos mostrou atividade de batimento ao longo do tempo, claramente os CSs criopreservados precisaram de até 1 semana de cultura para recuperar sua atividade de batimento (Figura 5B). Não houve mudança significativa na taxa de batimento de CSs descongelados versus frescos; no entanto, nenhuma atividade espontânea de batimento foi observada em alguns CSs congelados (Figura 5C). Embora os valores de pico tenham sido significativamente reduzidos em CSs congelados/descongelados em comparação com os frescos (Figura 5D), não foram observadas mudanças significativas no tempo de subida, no tempo de decaimento e no CTD90 de CSs congelados/descongelados em comparação com os frescos (Figura 5E-G). Esses dados indicam que, após o descongelamento, é importante deixar os CSs se recuperarem na incubadora por pelo menos 1 semana antes de medir a atividade de batimento e o Ca2+ transitório.
Tomados em conjunto, esses resultados mostram que a criopreservação de esferoides derivados de hiPSC-CM preserva a viabilidade dos cardiomiócitos, a estrutura sarcômera e suas características funcionais, como atividade de batimento espontâneo e manuseio de cálcio. Assim, os esferoides derivados de hiPSC-CM representam um modelo adequado para recapitular com precisão a eletrofisiologia cardíaca in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figura 1: Geração de esferoides cardíacos . (A) Representação esquemática da diferenciação cardíaca dirigida baseada em Wnt, a subsequente expansão de CMs-hiPSC e a geração de CSs. Criado com biorender.com. (B) Imagens de campo brilhante em diferentes pontos de tempo da cultura CS. Barra de escala, 200 μm. Wk representa a semana. (C) Imagens representativas de imunofluorescência para proteínas sarcômeras cardíacas α-actinina e troponina T em CSs de 3 semanas de idade. Imunofluorescência: Hoechst (azul), α-actinina (verde) e troponina T (vermelho). Barra de escala, 200 μm. A imagem mesclada ampliada à direita exibe a organização do sarcômero. Barra de escala, 50 μm. (D) Quantificação por citometria de fluxo de células positivas para α-actinina antes (dia 0) e 3 semanas após a formação de CSs. (n = 14-23 por condição. (E) RT-QPCR realizada em hiPSC-CMs cultivados por 90 dias (2D) e amostras esferoides cultivadas por 42 dias para estabelecer níveis de expressão de diferentes genes cardíacos relacionados a junções celulares, filamentos intermediários e mitocôndrias. (n = 1-3 lotes). Os dados são representados como média ± DP. NS (não significativo) calculado por um teste t não pareado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figura 2: Taxa de batimento e manuseio de cálcio em CSs em diferentes semanas após a geração. (A) Exemplos de parâmetros transitórios de cálcio calculados pelo algoritmo de análise de ciências Vala no Cyteseer Software. (B) Traços transientes de cálcio representativos e imagens de lapso de tempo dos CSs em diferentes pontos de tempo (semanas) após a geração. Barra de escala, 200 μm. (C) A quantificação do tempo de atividade de espancamento espontâneo é expressa como a porcentagem de espancamento de CSs. (D) Taxa de espancamento de CSs durante o tempo de cultivo. (E-H) Quantificação dos transientes de cálcio mostrando valor de pico, tempo de subida, tempo de decaimento e CTD90. Os dados apresentados são médios ± DP. Replicações biológicas = três, replicações técnicas = 38, 50, 66 e 7, respectivamente. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey. Abreviaturas; CTD = duração transitória do cálcio, Wk = semana, CSs = esferoides cardíacos humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figura 3: Taxa de batimento e manuseio de cálcio em CSs gerados usando diferentes densidades de semeadura celular. (A) Imagens de campo brilhante (esquerda) e medidas de tamanho (direita) de CSs geradas usando diferentes números de hiPSC-CMs. Barra de escala, 200 μm. (B) Traços transientes de cálcio representativos e imagens de lapso de tempo dos 2,5K-20K-CSs. (C,D) Porcentagem de batidas e taxa de batida de 2,5K-20K-CSs. (E-H) Valor de pico, tempo de subida, tempo de decaimento e CTD90 em 2,5K-20K-CSs. Os dados são médios ± DP. Replicações biológicas = três, replicações técnicas = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey. Abreviaturas: CTD = duração transitória do cálcio, Wk = semana, k = x 1.000 células, CSs = esferoides cardíacos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Figura 4. Efeito da criopreservação na viabilidade e estrutura de esferoides cardíacos. (A) Representação esquemática da geração de CS, subsequente biobanca e descongelamento. (B) Teste de viabilidade celular por citometria de fluxo em CSs frescos e criopreservados. Como controle positivo, foi utilizado um tratamento com solução de Triton-X a 10% por 5 min. (n = 4 por condição). Os dados são representados como média ± DP. ** **p < 0,001; ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey. (C) Teste de viabilidade celular de Calcein-AM em CSs frescos versus descongelados após 7 dias de cultura (n = 15-17 por condição, ****p < 0,001, pelo teste t pareado; barra de escala, 200 μm). (D) Coloração representativa de campo brilhante (esquerda) e imunofluorescência para expressão de α-actinina e troponina T em CSs frescos e descongelados. Imunofluorescência: Hoechst (azul), α-actinina (verde) e troponina T (vermelho). As imagens mescladas à direita exibem estrias de sarcômero nos CSs. Barra de escala, 50 μm. Abreviações: X = dia de descongelamento de escolha, PI = iodeto de propídio, Cal-AM = calceína-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figura 5: Transientes de cálcio em CSs frescos versus descongelados. (A) Traços transientes de cálcio representativos e imagens de lapso de tempo dos CSs antes da criopreservação e 1 semana após o descongelamento. (B) Porcentagem de espancamento de esferoides cardíacos frescos e congelados/descongelados. As barras representam experimentos individuais. (C) Taxa de batimento de esferoides cardíacos frescos e congelados/descongelados. (D-G) Quantificação de parâmetros transitórios de cálcio: valor de pico, tempo de subida, tempo de decaimento e CTD90. Os dados são médios ± DP. *p < 0,05, ****p < 0,001; ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey. Abreviaturas; CTD = duração transitória do cálcio, CSs = esferoides cardíacos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura 1 Suplementar: Estratégias representativas de gating para análise de citometria de fluxo. (A) Estratégia de gating representativa para hiPSC-CMs positivos para α-actinina em uma população pura versus controle negativo e controle isotipo. O número de células analisadas positivas para α-actinina é de 25 x 105. Abreviaturas; CSC = dispersão lateral, PI+ = iodeto de propídio positivo. (B) Estratégia de decantação representativa para a análise de viabilidade tanto no fresco, descongelado, no controle positivo (Triton-X) quanto no controle negativo (não corado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para a geração, manutenção e análise óptica de esferoides cardíacos. Esses esferoides cardíacos são essenciais para preencher a lacuna nos atuais modelos de doenças in vitro. Essa técnica permite que os pesquisadores criem triagem de próxima geração e alto rendimento e armazenamento funcional de esferoides cardíacos.Comece com a adição de um mililitro por centímetro quadrado de solução de descolamento cardíaco estéril a cada poço de uma placa de cultura contendo cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos confluentes. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Confirme o descolamento das células observando células brancas e redondas sob ampliação de 4x de um microscópio de campo brilhante.Usando uma pipeta de cinco mililitros, dissociar mecanicamente as células, lavando-as com dois mililitros de meio basal quente para preparar uma única suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar por três minutos a 300g. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de meio de replating hiPSC-CM.Use uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros para dissociar a pastilha celular. Após três ou quatro misturas, à medida que a solução parecer homogênea, carregue-a em um para contar as células e transfira a quantidade apropriada de células em 100 microlitros de meio de replatagem para cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa, de fundo redondo, de 96 poços. Coloque a placa de esferoides cardíacos em um agitador orbital na incubadora a 70 rpm com uma temperatura de 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, oxigênio a 21% e umidade de 90% por 24 horas.Para evitar a ruptura esferoide, aspirar apenas 50 microlitros de meio de cada poço e adicionar 100 microlitros de RPMI mais B27 médio por poço durante as primeiras 48 horas. Em seguida, aspirar 100 microlitros do meio de cada poço e adicionar 100 microlitros do meio de maturação por poço. Mantenha as células no meio de maturação e atualize o meio a cada dois ou três dias.Coloque a placa esferoide no gelo por 10 minutos para pré-resfriamento antes de centrifugar a placa por três minutos a 70g. Retire o meio até que 50 microlitros permaneçam no poço. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de congelamento hiPSC gelado por poço.Sele a placa com uma película de vedação da placa. Para preparar o molde de silício, misture os componentes do kit de elastômero de silício em uma proporção de 10 para 1 e adicione a solução dentro da parte inferior da placa do poço. Desborhe a solução usando uma bomba de vácuo por 15 a 20 minutos.Coloque o molde em um forno e cure-o a 60 graus Celsius por oito horas para obter um elastômero semi-flexível que é retirado da placa. Coloque a placa selada cuidadosamente em um molde de silicone, garantindo uma troca de calor uniforme entre a placa do poço e o freezer. Congele a placa a 80 graus Celsius por um mínimo de quatro horas no molde de silicone preparado antes de transferir a placa para um tanque de nitrogênio líquido ou um freezer de 150 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.Para garantir um rápido descongelamento dos esferoides cardíacos, colete uma placa celular com esferoides cardíacos de cada vez do nitrogênio líquido e coloque-a na incubadora por 15 minutos a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, 21% de oxigênio e 90% de umidade. Remova o filme de vedação da placa e aspirar 150 microlitros de cada poço antes de adicionar 200 microlitros de um meio basal quente a cada poço. Centrifugar a placa a 70g durante três minutos e repetir a lavagem basal a meio quente.Uma vez feito, remova 150 microlitros do meio e adicione 200 microlitros de cardiomiócitos descongelando o meio em cada poço. Em seguida, repita a lavagem do RPMI como mencionado durante a geração esferoide cardíaca, seguida pela manutenção das células no meio de maturação. Após uma semana da cultura, os esferoides cardíacos descongelados são ideais para imagens ópticas de manipulação de cálcio.Aspirar 150 microlitros de cada poço. Trate os esferoides cardíacos descongelados com 100 microlitros de meio de corante de cálcio Cal-520 AM por poço em condições escuras e incube a placa por 60 minutos. Prepare um sistema de aquisição e análise de cálcio alimentando o microscópio e garantindo que a opção de controle ambiental esteja ativada.Ajuste as dimensões da câmera e da abertura do enquadramento para minimizar a área de fundo. Para medir o sinal de cálcio, usando um laser de 488 nanômetros, defina o contraste para um fundo preto com um sinal verde brilhante durante a liberação de cálcio. Grave um vídeo com um fluxo consistente de 2 a 10 picos em 10 segundos.Grave um vídeo de 10 segundos e digitalize a placa de 96 poços, inicialmente movendo-se para a esquerda e, em seguida, para baixo em ziguezague para cobrir toda a placa. Após a aquisição dos transientes de cálcio, analise os dados utilizando um software de análise de traços de fluorescência. Os esferoides cardíacos adquiriram uma estrutura 3D no primeiro dia pós-semeadura, que pôde ser cultivada por até seis semanas.A maioria dos esferoides cardíacos de três semanas de idade expressou organização regular do sarcômero com alfa actinina e troponina T.Altos níveis de alfa actinina no dia zero e esferoides cardíacos de três semanas de idade indicaram uma composição celular constante e altamente pura durante a cultura. Um aumento da expressão dos genes cardíacos, desmossomos e mitocôndrias foi observado em esferoides do que hiPSC-CMs cultivados em 2D por 90 dias. A porcentagem de batimento dos esferoides cardíacos foi semelhante nas primeiras três semanas pós-geração e caiu significativamente na sexta semana devido à deterioração dos esferoides cardíacos.A taxa de batimento foi significativamente reduzida na terceira semana em comparação e caiu na sexta semana como resultado da deterioração. Os parâmetros transitórios de cálcio indicaram um valor de pico mais alto na segunda semana, enquanto o tempo de subida, o tempo de decaimento e a duração transitória do cálcio em 90% do decaimento foram significativamente aumentados na terceira semana, mostrando que os esferoides derivados de hiPSC-CM foram funcionalmente ótimos nas semanas dois e três pós-geração. O tamanho do esferoide aumentou com o número de células usadas para semeadura.Em tamanho maior, esferoides antigos, a batida foi significativamente maior. Uma taxa de batimento semelhante e significativamente maior foi mostrada por esferoides de 5k, 10k e 20k em comparação com esferoides de 2,5k. A criopreservação não afetou a viabilidade celular dentro dos esferoides cardíacos.Expressão semelhante de proteínas sarcômeras nos esferoides descongelados e frescos compatíveis com a idade indicou eficiência de criopreservação. Não houve alteração significativa na taxa de batimento de esferoides cardíacos descongelados ou frescos. Não foram observadas alterações significativas no tempo de subida, no tempo de decaimento e na CTD90 de CS descongelados ou frescos. Ao lado da modelagem de doenças e exames de drogas de alto rendimento, esses esferoides também podem ser usados para biorreatores de produção de vesículas extracelulares e terapias extracelulares relacionadas à vesícula.Além disso, o biobanco desses esferoides pode ser usado como um novo suprimento de cardiomiócitos para estratégias regenerativas. Evidências acumuladas sugerem que os biobancos de modelos de células-tronco derivadas de pacientes para fibrose cística, câncer e esferoides cardíacos têm grande potencial para desvendar mecanismos moleculares para exames de drogas e para medicina personalizada.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Fabricação microfluida de microcápsulas core-shell carregando esferoides de células-tronco pluripotentes humanas

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...