Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить VALA sciences за программный пакет Cyteseer и оптимизацию автоматизированного 3D-анализа кальция. Мы хотели бы выразить признательность за грантовую поддержку от Фонда PLN (RM). P.A.D. и F.S. поддерживаются CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. поддерживается H2020-EVICARE (#725229) Европейского исследовательского совета (ERC). J.W.B. поддерживается клинической стипендией UMC в Утрехте, стипендией Нидерландского института сердца и грантом для молодых талантов CVON-Dosis; Нидерландский фонд сердца (CVON-Dosis 2014-40). N.C. поддерживается гравитационной программой «Регенерация, управляемая материалами» Нидерландской организации научных исследований (RegmedXB #024.003.013) и Действиями Марии Склодовской-Кюри (грантовое соглашение RESCUE #801540). В.С.-. поддерживается Фондом Альянса (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. поддерживается финансируемым ЕС проектом BRAVE (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

Открытие сердечных препаратов затруднено из-за зависимости от нечеловеческих животных и клеточных моделей с недостаточной пропускной способностью и физиологической точностью для точного выполнения показаний. Биология hiPSC-CM в сочетании с приборами HT и физиологическими зондами может повторно ввести человеческие модели на самые ранние стадии моделирования сердечных заболеваний и открытия лекарств. Мы разработали метод 3D-генерации сердечной ткани, который позволяет получать высококачественные и функциональные CS для оптимального моделирования сердечных заболеваний и платформы скрининга лекарств. Кроме того, сочетание сфероидной технологии в 3D-биореакторных системах для промышленного производства электромобилей позволяет сделать необходимый шаг к клиническому переводу терапии на основе электромобилей. Описанный здесь метод опирается на несколько решающих факторов и является вариантом существующих протоколов 9,10,28,29. Эти методы включают в себя: 1) генерацию 3D-тканевых конструкций, 2) оптимальное количество клеток и время перед скринингом, 3) повышение чувствительности и высокой пропускной способности инструментов и 4) возможность замораживания сфероидов перед любым функциональным анализом. В отличие от ранее описанных протоколов, предлагаемый протокол описывает генерацию до 1,500 сфероидов в день и пригодность для HTS. Обычный анализ ста соединений в дозах 6 x 0,5 log для 10 реплик с использованием существующих 96-луночных систем визуализации кальция или 24-луночных мультиплексированных инженерных тканей сердца требует от примерно 500 миллионов до 3 миллиардов hiPSC-CM31,32. Предлагаемое применение делает кардиологические скрининги менее дорогостоящими и эффективными по времени по сравнению с традиционными системами, поскольку для 96-луночных планшетов требуется только 10% плотности посева по сравнению с описанным методом. Кроме того, по сравнению с предыдущими протоколами, такими как метод подвешивания, генерация сфероидов путем самоагрегации в пластинах со сверхнизким креплением позволяет получать высококачественную автоматизированную визуализацию отдельных микротканей33.
Эта небольшая 3D-модель имитирует биологический и физиологический фенотип сердечно-сосудистой среды in vivo . Как было показано ранее, кальциевые переходные процессы резко увеличиваются в 3D-конструкциях сердечной ткани по сравнению с 2D-монослойными клеточными культурами34.
Затем мы обнаружили, что плотность посева и правильное время культивирования также являются критическими факторами для успешного скрининга CS. Плотность 10K-20K hiPSC-CM на сфероид и скрининг между 2-3 неделями после генерации были оптимальными, тогда как слишком маленькие или слишком старые сфероиды демонстрируют нарушенную обработку кальция (рис. 2 и рис. 3). Поэтому важно поддерживать как можно более постоянную плотность посева, поскольку размер влияет на функциональные параметры. Кроме того, хотя этот оптический метод обеспечивает хорошие результаты для живых 3D-культур как целой ткани, получение данных в более крупных сфероидах на (суб)клеточном уровне является сложной задачей, не полагаясь на трудоемкие методы гистологии. В последнее время было опубликовано несколько подходов, в которых используется «оптическая очистка», которая позволяет получать целые 3D-сфероиды с возможностью количественного определения маркеров в одной клетке. Здесь мы адаптировали 3-дневный протокол сбора CS к анализу изображений, который оптимизирован для 3D-визуализации с использованием конфокальной микроскопии29 (рис. 1C и рис. 4D).
Наконец, с увеличением числа 3D-приложений сердечной ткани и коммерческих применений растет спрос на долгосрочное хранение и биобанкинг для конкретных пациентов от различных доноров. Криоконсервация является эффективной стратегией создания HTS-планшетов из нескольких партий с течением времени. Замораживание hiPSC-CM было описано ранее и не отличается от других культивируемых типов клеток 10,35,36. Недавно были описаны подходы к замораживанию пластин с 2D-ячейками37. Здесь мы обнаружили, что набор для криоконсервации PSC является наиболее оптимальным состоянием по сравнению с тремя другими (данные не показаны), и использовали эту среду для эффективного замораживания сфероидов. После криоконсервации жизнеспособность остается высокой (рис. 4B, C), но это влияет на электрофизиологические свойства CS, и требуется период инкубации после размораживания. Действительно, через 1 неделю после размораживания CS проявляли спонтанную биение и обработку кальция. Однако было описано, что свежие и восстановленные hiPSC-CM не всегда проявляют идентичные молекулярные и физиологические свойства38. Это ограничение необходимо учитывать, когда криоконсервированные hiPSC-CM используются для оценки индуцированных лекарством сердечных показаний. Более того, хотя мы эффективно модулируем количество клеток на сфероид и оптимальное время переходной визуализации кальция, сердечные сфероиды могут быть улучшены путем смешивания кардиомиоцитарных клеток, полученных из hiPSC, с эндотелиальными клетками, фибробластами, клеточно-клеточными соединениями и внеклеточными матрицами, такими как хитозан, коллаген IV, фибронектин, матригель или ламинин, имитируя сердечную среду in vivo 39, 40. В целом, мы предлагаем пошаговый протокол для эффективного создания CS, которые подходят для последующих приложений, таких как моделирование заболеваний и скрининг лекарств HT.

Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыло беспрецедентные возможности для изучения развития и болезней человека на клеточном уровне. За последнее десятилетие на основе уроков развития были разработаны различные протоколы, обеспечивающие эффективную дифференцировку ИПСК в кардиомиоциты (КМ)1,2,3,4. Кардиомиоциты, полученные из hiPSC (hiPSC-CM), могут служить ресурсом для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), тестирования сердечной безопасности для новых лекарств и сердечных регенеративных стратегий 5,6,7,8. Несмотря на направленную сердечную дифференцировку ИПСК, неопределенное количество КМ остается проблемой в области сердца, поскольку зрелые ИПСК-КМ обычно не являются пролиферативными, а первичные клетки человека недоступны в больших количествах.
Недавно мы описали, что сопутствующая активация передачи сигналов Wnt с культурой низкой плотности клеток приводила к массивному пролиферативному ответу (до 250 раз) hiPSC-CMs 9,10. Эта экономически эффективная стратегия массового расширения hiPSC-CM за счет последовательного пассажирования в формате колбы для культивирования облегчает стандартизацию и контроль качества большого количества функциональных hiPSC-CM. Кроме того, чтобы не отставать от спроса на большие партии hiPSC-CM от различных доноров, было описано биобанкирование hiPSC-CM10. Однако монослои кардиомиоцитов, посеянные в эти стандартные чашки для культивирования, не являются репрезентативными для сложной 3D-структуры, присутствующей в сердце. Кроме того, незрелость hiPSC-CM остается препятствием, таким образом, не имитируя биологический и физиологический фенотип сердечно-сосудистой среды in vivo.
Были разработаны новые 3D-модели in vitro, в которых hiPSC-CM демонстрируют более близкое физиологическое поведение, такое как самоорганизация 11,12, ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) 13, ускоренное созревание 14,15,16 и синхронизированное сокращение17,18,19 . 3D-модели использовались для открытия лекарств, тестирования кардиотоксичности лекарств, моделирования заболеваний, регенеративной терапии и даже первых клинических испытаний 20,21,22,23,24. Одной из наиболее часто используемых моделей является инженерная сердечная ткань на основе фибрина (EHT), которая демонстрирует тканеподобное расположение и сократимость сердца13,17,25. Ранее мы показали, что EHT, генерируемые из расширенных hiPSC-CM, демонстрируют сравнимую сократимость с таковыми из нерасширенных hiPSC-CM, демонстрируя нескомпрометированную клеточную функциональность после расширения9. Тем не менее, несмотря на то, что генерация EHT из hiPSC-CM хорошо налажена, ожидается дальнейшее развитие событий в отношении создания платформы оценки HT. Здесь быстрая генерация большого количества самоагрегирующих сердечных сфероидов (КС) в 96-луночном формате позволяет улучшить 3D-условия для целей высокопроизводительного скрининга (HTS).
В целом, преимуществом CS как 3D-культуры клеток является их высокая воспроизводимость и масштабируемость. В частности, CS в сочетании с роботизированной обработкой образцов могут стандартизировать и автоматизировать культуру CS, медикаментозное лечение и анализ с высоким содержанием20. Здесь мы описываем оптимизированные протоколы для создания высокочистых и высококачественных CS, которые могут быть эффективно криоконсервированы и проверены на сердечную функцию путем выполнения переходных измерений Ca2+ с использованием оптической системы сбора и анализа кальция. Эта модель представляет собой простой, но мощный инструмент для выполнения высокопроизводительных экранов на сотнях и тысячах сфероидов17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), имеют первостепенное значение для моделирования и лечения сердечных заболеваний человека. Недавно мы опубликовали экономически эффективную стратегию массового расширения hiPSC-CM в двух измерениях (2D). Двумя основными ограничениями являются незрелость клеток и отсутствие трехмерного (3D) расположения и масштабируемости на платформах скрининга с высокой пропускной способностью (HTS). Чтобы преодолеть эти ограничения, расширенные кардиомиоциты образуют идеальный источник клеток для создания 3D-культуры сердечных клеток и методов тканевой инженерии. Последний обладает большим потенциалом в сердечно-сосудистой сфере, обеспечивая более продвинутую и физиологически значимую ВТШ. Здесь мы описываем HTS-совместимый рабочий процесс с простой масштабируемостью для генерации, обслуживания и оптического анализа сердечных сфероидов (CS) в формате 96 лунок. Эти небольшие CS необходимы для заполнения пробела, присутствующего в современных моделях заболеваний in vitro и/или генерации для 3D-платформ тканевой инженерии. CS представляют собой высокоструктурированную морфологию, размер и клеточный состав. Кроме того, hiPSC-CM, культивируемые как CS, демонстрируют повышенное созревание и некоторые функциональные особенности человеческого сердца, такие как спонтанное обращение с кальцием и сократительная активность. Автоматизируя весь рабочий процесс, от генерации CS до функционального анализа, мы повышаем воспроизводимость внутри и между партиями, о чем свидетельствуют высокопроизводительные (HT) визуализации и анализ обработки кальция. Описанный протокол позволяет моделировать кардиологические заболевания и оценивать лекарственные/терапевтические эффекты на уровне отдельных клеток в сложной 3D-клеточной среде в полностью автоматизированном рабочем процессе HTS. Кроме того, в исследовании описывается простая процедура долгосрочного сохранения и биобанкирования цельных сфероидов, тем самым предоставляя исследователям возможность создать функциональное хранилище тканей следующего поколения. HTS в сочетании с долгосрочным хранением внесет существенный вклад в трансляционные исследования в широком спектре областей, включая открытие и тестирование лекарств, регенеративную медицину и разработку персонализированных методов лечения.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Здесь представлен набор протоколов для генерации и криоконсервации сердечных сфероидов (КС) из индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, культивируемых в высокопроизводительном многомерном формате. Эта трехмерная модель функционирует как надежная платформа для моделирования заболеваний, высокопроизводительных скринингов и сохраняет свою функциональность после криоконсервации.

Генерация, высокопроизводительный скрининг и биобанкирование индуцированных человеком плюрипотентных сердечных сфероидов, полученных из стволовых клеток

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Этот протокол описывает рабочий процесс для генерации, обслуживания и оптического анализа сердечных сфероидов. Эти сердечные сфероиды необходимы для заполнения пробела в современных моделях заболеваний in vitro. Этот метод позволяет исследователям создавать высокопроизводительный скрининг следующего поколения и функциональное хранение сердечных сфероидов.Начните с добавления одного миллилитра на квадратный сантиметр стерильного раствора для отслойки сердца в каждую лунку культуральной пластины, содержащей сливающиеся индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Подтвердите отслоение клеток, наблюдая за белыми и круглыми клетками под 4-кратным увеличением яркопольного микроскопа.Используя пятимиллилитровую пипетку, механически диссоциируйте клетки, промыв их двумя миллилитрами теплой базальной среды, чтобы приготовить одноклеточную суспензию. Перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугу в течение трех минут при 300 г. Затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в одном миллилитре среды для повторного покрытия hiPSC-CM.Используйте наконечник пипетки объемом 1 000 микролитров, чтобы диссоциировать клеточную гранулу. После трех или четырех смешиваний, когда раствор станет однородным, загрузите его в кассету для подсчета ячеек и перенесите соответствующее количество ячеек в 100 микролитров реплагирующей среды в каждую лунку со сверхнизкой насадкой, круглодонную, 96-луночную пластину. Поместите пластину сердечных сфероидов на орбитальный шейкер в инкубаторе при 70 об/мин с температурой 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа, 21% кислорода и 90% влажности в течение 24 часов.Чтобы избежать разрыва сфероида, аспирируйте только 50 микролитров среды из каждой лунки и добавляйте 100 микролитров RPMI плюс среду B27 на лунку в течение первых 48 часов. Затем аспирируйте 100 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 100 микролитров среды для созревания в каждую лунку. Поддерживайте клетки в среде созревания и обновляйте среду каждые два-три дня.Поместите сфероидальную пластину на лед на 10 минут для предварительного охлаждения, а затем центрифугируйте пластину в течение трех минут при 70 г. Удаляйте среду до тех пор, пока в лунке не останется 50 микролитров. Затем добавьте 200 микролитров ледяной морозильной среды hiPSC на лунку.Запечатайте пластину пластинчато-герметизирующей пленкой. Чтобы приготовить кремниевую форму, смешайте компоненты набора кремниевого эластомера в соотношении 10 к 1 и добавьте раствор в нижнюю часть луночной пластины. Удаляйте пузырьки раствора с помощью вакуумного насоса в течение 15-20 минут.Поместите форму в духовку и выдержите ее при температуре 60 градусов Цельсия в течение восьми часов, чтобы получить полугибкий эластомер, который снимается с пластины. Аккуратно поместите герметичную пластину в силиконовую форму, обеспечив равномерный теплообмен между колодезной пластиной и морозильной камерой. Заморозьте пластину при температуре 80 градусов по Цельсию в течение как минимум четырех часов в подготовленной силиконовой форме, прежде чем переложить пластину в резервуар с жидким азотом или морозильную камеру с температурой 150 градусов Цельсия для длительного хранения.Чтобы обеспечить быстрое размораживание сердечных сфероидов, соберите по одной клеточной пластине с сердечными сфероидами за раз из жидкого азота и поместите ее в инкубатор на 15 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, содержащей 5% углекислого газа, 21% кислорода и 90% влажности. Снимите герметизирующую пленку с пластины и аспирируйте 150 микролитров из каждой лунки, прежде чем добавить 200 микролитров теплой базальной среды в каждую лунку. Центрифугируйте тарелку на 70 г в течение трех минут и повторите теплую базальную среднюю промывку.После этого удалите 150 микролитров среды и добавьте 200 микролитров размораживающей среды кардиомиоцитов в каждую лунку. Затем повторите промывку RPMI, как упоминалось во время генерации сердечного сфероида, с последующим поддержанием клеток в среде созревания. После одной недели культивирования размороженные сердечные сфероиды оптимальны для оптической визуализации кальция.Аспирируйте по 150 микролитров каждой лунки. Обработайте размороженные сердечные сфероиды 100 микролитрами кальциевого красителя Cal-520 AM в каждой лунке в темноте и инкубируйте пластину в течение 60 минут. Подготовьте систему сбора и анализа кальция, включив микроскоп и убедившись, что включена опция контроля окружающей среды.Отрегулируйте размеры диафрагмы камеры и кадрирования, чтобы свести к минимуму область фона. Чтобы измерить кальциевый сигнал, с помощью 488-нанометрового лазера установите контраст на черный фон с ярко-зеленым сигналом во время высвобождения кальция. Запишите видео с постоянным потоком от 2 до 10 пиков в течение 10 секунд.Запишите 10-секундное видео и просканируйте 96-луночную пластину, сначала двигаясь влево, а затем зигзагообразно вниз, чтобы покрыть всю пластину. После получения переходных процессов кальция проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа флуоресцентных следов. Сердечные сфероиды приобрели 3D-структуру к первому дню после посева, которую можно было культивировать до шести недель.Большинство трехнедельных сердечных сфероидов экспрессировали регулярную организацию саркомера с альфа-актинином и тропонином Т. Высокие уровни альфа-актинина в нулевом и трехнедельном сердечных сфероидах указывали на постоянный и очень чистый клеточный состав во время культивирования. Повышенная экспрессия сердечных генов, десмосом и митохондрий наблюдалась у сфероидов, чем у hiPSC-CM, культивируемых в 2D в течение 90 дней. Процент поражения сердечных сфероидов был одинаковым в первые три недели после генерации и значительно снизился на шестой неделе из-за ухудшения сердечных сфероидов.Частота биения была значительно снижена на третьей неделе по сравнению с и снизилась на шестой неделе в результате ухудшения. Переходные параметры кальция указывали на более высокое пиковое значение на второй неделе, в то время как время нарастания, время распада и продолжительность переходного процесса кальция при 90% распада были значительно увеличены на третьей неделе, показывая, что сфероиды, полученные из hiPSC-CM, были функционально оптимальны на второй и третьей неделях после генерации. Размер сфероида увеличивался с увеличением количества ячеек, используемых для посева.В больших размерах, старых сфероидах, биение было значительно выше. Аналогичную и значительно более высокую скорость биения показали 5k, 10k и 20k сфероиды по сравнению с 2,5k сфероидами. Криоконсервация не влияла на жизнеспособность клеток в сердечных сфероидах.Аналогичная экспрессия саркомерных белков в размороженных и свежих сфероидах, соответствующих возрасту, указывала на эффективность криоконсервации. Не было существенных изменений в скорости биения размороженных или свежих сердечных сфероидов. Существенных изменений не наблюдалось во времени нарастания, времени распада и CTD90 талых или свежих CS. Наряду с моделированием заболеваний и высокопроизводительным скринингом лекарств, эти сфероиды также могут быть использованы для биореакторов производства внеклеточных везикул и внеклеточной терапии, связанной с везикулами.Кроме того, биобанкинг этих сфероидов может быть использован в качестве нового источника кардиомиоцитов для регенеративных стратегий. Накопленные данные свидетельствуют о том, что биобанки моделей стволовых клеток, полученных от пациентов, для лечения муковисцидоза, рака и сердечных сфероидов имеют большой потенциал для раскрытия молекулярных механизмов скрининга лекарств и персонализированной медицины.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Поколение динамических экологических условий с использованием микрофлюидного устройства с высокой пропускной способностью

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Микрофлюидное изготовление микрокапсул Core-Shell, несущих сфероиды плюрипотентных стволовых клеток человека

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Изогенный чип почечного клубочка, разработанный из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Оценка терапии модуляции сократимости сердца в 2D кардиомиоцитах, полученных из стволовых клеток человека

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...