Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Vi vill uppmärksamma VALA-vetenskapen för Cyteseer-programvarupaketet och optimering av den automatiserade 3D-kalciumanalysen. Vi vill uppmärksamma bidragsstöd från PLN-stiftelsen (RM). P.A.D. och F.S. stöds av CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. stöds av H2020-EVICARE (#725229) från Europeiska forskningsrådet (ERC). J.W.B. stöds av UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship och CVON-Dosis young talent grant; Nederländska hjärtfonden (CVON-Dosis 2014-40). N.C. stöds av gravitationsprogrammet "Materials Driven Regeneration" av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (RegmedXB #024.003.013) och Marie Skłodowska-Curie-åtgärderna (bidragsavtal RESCUE #801540). V.S.-P. stöds av Alliansfonden (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. stöds av det EU-finansierade projektet BRAVE (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Hjärtläkemedelsupptäckt hindras av ett beroende av icke-mänskliga djur- och cellulära modeller med otillräcklig genomströmning och fysiologisk trohet för att korrekt utföra avläsningar. hiPSC-CM-biologi i kombination med HT-instrumentering och fysiologiska sonder har potential att återinföra mänskliga modeller i de tidigaste stadierna av modellering av hjärtsjukdomar och läkemedelsupptäckt. Vi utvecklade en 3D-metod för generering av hjärtvävnad som producerar högkvalitativa och funktionella CS för en optimal plattform för modellering av hjärtsjukdomar och läkemedelsscreening. Dessutom möjliggör kombinationen av sfäroidtekniken i 3D-bioreaktorsystem för industriell EV-produktion ett nödvändigt steg mot klinisk översättning av EV-baserad terapi. Metoden som beskrivs här bygger på flera avgörande faktorer och är en variant av befintliga protokoll 9,10,28,29. Dessa metoder inkluderar: 1) generering av 3D-vävnadskonstruktioner, 2) det optimala cellantalet och tidpunkten före screeningen, 3) förbättring av instrumentens känslighet och höga genomströmningskapacitet och 4) att kunna frysa sfäroiderna före någon funktionell analys. Till skillnad från tidigare beskrivna protokoll beskriver det föreslagna protokollet genereringen av upp till 1 500 sfäroider per dag och lämpligheten för HTS. Konventionell analys av hundra föreningar över 6 x 0,5 logdoser för 10 replikat med befintliga 96-brunns kalciumavbildningssystem eller 24-brunns multiplexerade konstruerade hjärtvävnader kräver cirka 500 miljoner till 3 miljarder hiPSC-CMs31,32. Den föreslagna applikationen gör hjärtscreeningar mindre kostsamma och tidseffektiva jämfört med konventionella system eftersom 96-brunnsplattorna endast krävde 10% av sådddensiteten jämfört med den beskrivna metoden. Dessutom, jämfört med tidigare protokoll, såsom hanging-drop-metoden, möjliggör generering av sfäroider genom självaggregering i ultralåga fästplattor högkvalitativ automatiserad avbildning av enskilda mikrovävnader33.
Denna lilla 3D-modell efterliknar den biologiska och fysiologiska fenotypen i den kardiovaskulära miljön in vivo . Som tidigare visats ökar kalciumtransienter dramatiskt i 3D-hjärtvävnadskonstruktioner jämfört med 2D-monolagercellkulturer34.
Därefter fann vi att sådddensiteten och rätt odlingstid också är kritiska faktorer för en framgångsrik CS-screening. Densiteterna för 10K-20K hiPSC-CMs per sfäroid och screening mellan vecka 2-3 efter generation var optimala, medan för små eller för gamla sfäroider visar störd kalciumhantering (figur 2 och figur 3). Därför är det viktigt att hålla sådddensiteterna så konsekventa som möjligt, eftersom storleken påverkar de funktionella parametrarna. Även om denna optiska metod ger goda resultat för levande 3D-kulturer som en hel vävnad, är det utmanande att erhålla data inom större sfäroider på (sub-) cellulär nivå utan att förlita sig på tidskrävande histologimetoder. Nyligen har flera metoder publicerats som använde "optiskt clearing", vilket möjliggör förvärv av hela 3D-sfäroider med möjlighet till encellskvantifiering av markörer. Här anpassade vi ett 3-dagars protokoll från CS-skörd till bildanalys, som är optimerad för 3D-avbildning med konfokalmikroskopi29 (figur 1C och figur 4D).
Slutligen, med ökningen av 3D-hjärtvävnadsapplikationer och kommersiella applikationer, ökar efterfrågan på långtidsförvaring och patientspecifik biobank från olika givare. Kryokonservering är en effektiv strategi för att generera HTS-plattor från flera satser över tid. Frysningen av hiPSC-CM har beskrivits tidigare och skiljer sig inte från andra odlade celltyper 10,35,36. Nyligen har metoder för frysning av plattor med 2D-celler beskrivits37. Här fann vi att PSC-kryokonserveringssatsen är det mest optimala tillståndet jämfört med tre andra (data visas inte) och använde detta medium för effektiv frysning av sfäroider. Efter kryokonservering förblir viabiliteten hög (figur 4B,C), men CSs elektrofysiologiska egenskaper påverkas och en inkubationsperiod efter upptining krävs. Faktum är att 1 vecka efter upptining visade CS spontan slagaktivitet och kalciumhantering. Det har dock beskrivits att färska och återvunna hiPSC-CM inte alltid uppvisar identiska molekylära och fysiologiska egenskaper38. Denna begränsning måste beaktas när kryokonserverade hiPSC-CM används för att bedöma läkemedelsinducerade hjärtavläsningar. Dessutom, även om vi effektivt modulerar antalet celler per sfäroid och den optimala tidpunkten för kalciumtransient avbildning, kan hjärtsfäroiderna förbättras genom att blanda hiPSC-härledda kardiomyocytceller med endotelceller, fibroblaster, cell-cellkorsningar och extracellulära matriser, såsom kitosan, kollagen IV, fibronektin, matrigel eller laminin, efterlikna in vivo hjärtmiljön39, 40. Sammantaget föreslår vi ett steg-för-steg-protokoll för att effektivt generera CS som är lämpliga för nedströmsapplikationer som sjukdomsmodellering och HT-läkemedelsscreening.

Upptäckten av mänskligt inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) erbjöd oöverträffade möjligheter att studera mänsklig utveckling och sjukdom på cellnivå. Under det senaste decenniet, med hjälp av utvecklingslektioner, har olika protokoll upprättats för att säkerställa effektiv differentiering av hiPSC till kardiomyocyter (CM) 1,2,3,4. hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) kan fungera som en resurs för modellering av genetiskt ärftliga hjärt-kärlsjukdomar (CVD), testning av hjärtsäkerhet för nya läkemedel och hjärtregenerativa strategier 5,6,7,8. Trots den riktade hjärtdifferentieringen av hiPSC förblir obestämda CM-nummer en utmaning inom hjärtfältet, eftersom mogna hiPSC-CM i allmänhet är icke-proliferativa och primära humana celler inte är tillgängliga i stora mängder.
Nyligen beskrev vi att samtidig Wnt-signalaktivering med låg celldensitetskultur resulterade i ett massivt proliferativt svar (upp till 250 gånger) av hiPSC-CMs 9,10. Denna kostnadseffektiva strategi för massiv expansion av hiPSC-CM via seriell passering i odlingskolvformat underlättar standardisering och kvalitetskontroll av ett stort antal funktionella hiPSC-CM. Dessutom, för att hålla jämna steg med efterfrågan på stora partier hiPSC-CMs från olika givare, har biobankningen av hiPSC-CMs beskrivits10. Kardiomyocytmonolager sådda i dessa standardodlingsrätter är emellertid inte representativa för den komplexa 3D-strukturen som finns i hjärtat. Dessutom har omogenheten hos hiPSC-CM förblivit ett hinder och därmed misslyckats med att efterlikna den biologiska och fysiologiska fenotypen i den kardiovaskulära miljön in vivo.
Nya 3D-in vitro-modeller har utvecklats där hiPSC-CMs visar närmare fysiologiskt beteende såsom självorganisation 11,12, extracellulär matris (ECM) remodeling 13, förbättrad mognad 14,15,16 och synkroniserad kontraktion17,18,19 . 3D-modeller har använts för läkemedelsupptäckt, läkemedelskardiotoxicitetstestning, sjukdomsmodellering, regenerativa terapier och till och med de första kliniska prövningarna 20,21,22,23,24. En av de mest använda modellerna är den fibrinbaserade konstruerade hjärtvävnaden (EHT), som uppvisar ett vävnadsliknande arrangemang och hjärtkontraktilitet13,17,25. Tidigare visade vi att EHT genererade från expanderade hiPSC-CMs uppvisade jämförbar kontraktilitet med dem från oexpanderade hiPSC-CMs, vilket visade kompromisslös cellulär funktionalitet efter expansion9. Även om genereringen av EHT från hiPSC-CM har varit väletablerad, förväntas dock ytterligare utveckling när det gäller inrättandet av en HT-utvärderingsplattform. Här möjliggör den snabba genereringen av ett stort antal självaggregerande hjärtsfäroider (CS) i 96-brunnsformat en förbättring av 3D-förhållandena för high-throughput screening (HTS) ändamål.
Sammantaget är fördelen med CS som 3D-cellodling deras höga reproducerbarhet och skalbarhet. I synnerhet kan CS i kombination med robotprovhantering standardisera och automatisera CS-kultur, läkemedelsbehandling och analys med högt innehåll20. Här beskriver vi optimerade protokoll för att generera CS med hög renhet och hög kvalitet, som effektivt kan kryokonserveras och screenas för hjärtfunktion genom att utföra Ca2+ transienta mätningar med hjälp av ett optiskt kalciumförvärv och analyssystem. Denna modell ger ett enkelt men kraftfullt verktyg för att utföra skärmar med hög genomströmning på hundratals till tusentals sfäroider17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

Humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) är av största vikt för modellering och behandling av mänskliga hjärtsjukdomar. Vi publicerade nyligen en kostnadseffektiv strategi för den massiva expansionen av hiPSC-CM i två dimensioner (2D). Två stora begränsningar är cellomogenhet och brist på tredimensionellt (3D) arrangemang och skalbarhet i high-throughput screening (HTS) plattformar. För att övervinna dessa begränsningar utgör de expanderade kardiomyocyterna en idealisk cellkälla för generering av 3D-hjärtcellsodling och vävnadsteknik. Den senare har stor potential inom det kardiovaskulära området, vilket ger mer avancerad och fysiologiskt relevant HTS. Här beskriver vi ett HTS-kompatibelt arbetsflöde med enkel skalbarhet för generering, underhåll och optisk analys av hjärtsfäroider (CS) i ett 96-brunnsformat. Dessa små CS är avgörande för att fylla luckan i nuvarande in vitro-sjukdomsmodeller och / eller generering för 3D-vävnadstekniska plattformar. CS: erna presenterar en mycket strukturerad morfologi, storlek och cellulär sammansättning. Dessutom visar hiPSC-CMs odlade som CS ökad mognad och flera funktionella egenskaper hos det mänskliga hjärtat, såsom spontan kalciumhantering och kontraktil aktivitet. Genom automatisering av hela arbetsflödet, från generering av CS till funktionell analys, ökar vi reproducerbarheten inom och mellan satser, vilket demonstreras av high-throughput (HT) avbildning och kalciumhanteringsanalys. Det beskrivna protokollet möjliggör modellering av hjärtsjukdomar och bedömning av läkemedels-/terapeutiska effekter på encellsnivå inom en komplex 3D-cellmiljö i ett helautomatiserat HTS-arbetsflöde. Dessutom beskriver studien ett enkelt förfarande för långtidskonservering och biobankning av helsfäroider, vilket ger forskare möjlighet att skapa nästa generations funktionella vävnadsförvaring. HTS kombinerat med långtidslagring kommer väsentligt att bidra till translationell forskning inom ett brett spektrum av områden, inklusive läkemedelsupptäckt och testning, regenerativ medicin och utveckling av personliga terapier.

Protokollet som visas i figur 1A beskriver genereringen av CS från tidigare expanderade hiPSC-CM. CS: erna förvärvar en 3D-struktur vid dag 1 efter sådd i ultralåga fästplattor med rundbotten och kan odlas i upp till 6 veckor (figur 1B). Som bedömt genom immunofluorescensfärgning uttryckte majoriteten av cellerna i 3 veckor gamla CS sarkomeriska proteiner såsom α-aktinin och troponin T och uppvisade regelbunden sarkomerorganisation (figur 1C). För kvantifiering av α-aktininpositiva celler utfördes flödescytometrianalys. I enlighet med immunofluorescensresultaten visade flödescytometridata jämförbara höga nivåer av α-aktinin i både dag 0 (76,9% ± 16,6%) och 3 veckor gamla CS (71,1% ± 22,7%) (figur 1D), vilket indikerar en konstant och mycket ren cellulär sammansättning under odling. Det fanns ett ökat uttryck av hjärtgenerna för korsningar (GJA1, JPH2 och PKP2), desmosomer (DES) och mitokondrier (ATP5A) i hiPSC-CM-härledda sfäroider (dag 42) jämfört med hiPSC-CMs odlade i 2D i 90 dagar (figur 1E). Uttrycket av dessa gener är ett kännetecken för cell-cellinteraktion och mognad30.
Därefter bedömdes de funktionella egenskaperna hos CS, nämligen slaghastighet och Ca2+ hantering, vid olika tidpunkter (figur 2). Transienta kalciumparametrar såsom stigtid, topptid, sönderfallstid och transient kalciumduration (CTD90) utvärderades enligt figur 2A,B. Andelen som slår CS är liknande under de första 3 veckorna efter generation men sjönk signifikant i vecka 6 (Wk6) CS (Figur 2C). Slagfrekvensen minskade signifikant vid Wk3 jämfört med Wk1 och, i likhet med andelen som slog CS, sjönk dramatiskt vid Wk6 (figur 2D). Vid Wk6 observerades CS-försämring, vilket kan förklara minskningen av både slaghastigheten och antalet slag CS. Mätning av kalciumtransienta parametrar indikerade ett signifikant högre toppvärde vid Wk2 (figur 2E), medan stigtiden, sönderfallstiden och CTD90 ökade signifikant vid Wk3 jämfört med Wk1 (figur 2F-H ). Sammantaget visar dessa resultat att hiPSC-CM-härledda sfäroider är funktionellt optimala runt vecka 2 och 3 efter generationen.
Figur 3 visar effekten av sfäroidstorlek på slaghastigheten och kalciumhanteringen. CS genererades genom sådd av 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 och 20 x 10 4 hiPSC-CMs i en brunn på en 96-brunnsplatta för totalt 24 CS / brunnar per tillstånd (figur 3A). Som förväntat ökade sfäroidstorleken när antalet använda celler ökade, från 178 ± 36 μm till 351 ± 65 μm (figur 3A, höger panel). Ca2+ transienter mättes i 3 veckor gamla CS vid de fyra olika sådddensiteterna (Figur 3B). Mätningar av att slå CS indikerade att endast cirka 50% av de mindre storleks-CS (2.5K- och 5K-CSs) slog, medan andelen större storleksslagande CSs (10K- och 20K-CSs) var signifikant högre (cirka 85%) (Figur 3C). En liknande slaghastighet (cirka 28 slag per minut) visades av 5K-, 10K- och 20K-CS, vilket var signifikant högre jämfört med 2.5K-CS (figur 3D). Toppvärdena för kalciumbilder var likartade under alla testade förhållanden (figur 3E), men stigtiden (figur 3F), sönderfallstiden (figur 3G) och CTD90 (figur 3H) ökade signifikant i större storlek-CS (10K- och 20K-CS) jämfört med de mindre (2.5K- och 5K-CSs). Sammantaget visar dessa resultat att hiPSC-CM-härledda sfäroider är optimala för screening av kalciumhantering när en sådddensitet mellan 10K- och 20K hiPSC-CMs/brunn används.
Därefter utvärderade vi kryokonserveringens inverkan på CS: s livskraft och funktion. Före analysen bibehölls upptinade CS i kulturen i 1 vecka (figur 4A). Som framgår av både flödescytometri (figur 4B) och Calcein-AM (figur 4C) cellviabilitetstester påverkade kryokonservering inte cellviabiliteten inom CS. Dessutom visade upptinade CS liknande uttrycksnivåer av sarkomeriska proteiner jämfört med de färska åldersmatchade CS (figur 4D). Dessa data indikerar att CS effektivt kan kryokonserveras för efterföljande hjärtfunktionsanalys och screening med hög genomströmning.
Slutligen mättes slagaktiviteten och Ca2+ hantering i både färska och kryokonserverade CS (figur 5). Procentandelen att slå CS mättes vid olika tidpunkter efter upptining vid 2, 5 respektive 7 dagar. Medan de flesta av de färska CS: erna visade slagaktivitet över tiden, behövde de kryokonserverade CS: erna helt klart upp till 1 veckas odling för att återställa sin slagaktivitet (figur 5B). Det fanns ingen signifikant förändring i slagfrekvensen för tinade CS kontra färska; Ingen spontan slagaktivitet observerades dock vid vissa frysta CS (figur 5C). Även om toppvärdena minskade signifikant i frysta/tinade CS jämfört med färska (figur 5D), observerades inga signifikanta förändringar i stigtid, sönderfallstid och CTD90 för frysta/tinade CS jämfört med färska (figur 5E-G). Dessa data indikerar att det efter upptining är viktigt att låta CS återhämta sig i inkubatorn i minst 1 vecka innan man mäter slagaktivitet och Ca2+ övergående.
Sammantaget visar dessa resultat att kryokonservering av hiPSC-CM-härledda sfäroider bevarar kardiomyocytlivskraften, den sarkomeriska strukturen och deras funktionella egenskaper såsom spontan slagaktivitet och kalciumhantering. Således representerar hiPSC-CM-härledda sfäroider en lämplig modell för att exakt rekapitulera hjärtelektrofysiologi in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Figur 1: Generering av hjärtsfäroider . (A) Schematisk representation av Wnt-baserad riktad hjärtdifferentiering, efterföljande expansion av hiPSC-CMs och generering av CSs. Skapad med biorender.com. (B) Ljusfältsbilder vid olika tidpunkter för CS-odling. Skalstång, 200 μm. Wk representerar veckan. (C) Representativa immunofluorescensbilder för hjärtsarkomeriska proteiner α-aktinin och troponin T i 3 veckor gamla CS. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grön) och troponin T (röd). Skalstång, 200 μm. Den inzoomade sammanslagna bilden till höger visar sarkomerorganisationen. Skalstapel, 50 μm. (D) Flödescytometrikvantifiering av α-aktininpositiva celler före (dag 0) och 3 veckor efter bildandet av CS. (n = 14-23 per tillstånd. (E) RT-qPCR utförs på hiPSC-CMs odlade i 90 dagar (2D) och sfäroidprover odlade i 42 dagar för att fastställa uttrycksnivåer för olika hjärtgener relaterade till cellkorsningar, mellanliggande filament och mitokondrier. (n = 1-3 satser). Data representeras som medelvärde ± SD. NS (icke-signifikant) beräknat med ett oparat t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Figur 2: Slagfrekvens och kalciumhantering i CS vid olika veckor efter generation. (A) Exempel på transienta kalciumparametrar beräknade med Vala sciences analysalgoritm i Cyteseer Software. (B) Representativa transienta kalciumspår och timelapse-bilder av CS vid olika tidpunkter (veckor) efter generationen. Skalstapel, 200 μm. (C) Tidsförloppskvantifiering av spontan slagaktivitet uttrycks som procentandelen av att slå CS. (D) Slagfrekvens av CS under odlingstiden. (E-H) Kvantifiering av kalciumtransienter som visar toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90. Data som visas är medelvärde ± SD. Biologiska replikat = tre, tekniska replikat = 38, 50, 66 respektive 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar; CTD = kalciumövergående duration, Wk = vecka, CSs = humana hjärtsfäroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Figur 3: Slaghastighet och kalciumhantering i CS genererade med olika cellsådddensiteter. (A) Ljusfältsavbildning (vänster) och storleksmätningar (höger) av CS genererade med olika antal hiPSC-CM. Skalstapel, 200 μm. (B) Representativa kalciumtransienta spår och timelapse-bilder av 2.5K-20K-CSs. (C,D) Slagprocent och slagfrekvens på 2.5K-20K-CS. (E-H) Toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90 i 2.5K-20K-CS. Data är medelvärde ± SD. Biologiska replikat = tre, tekniska replikat = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar: CTD = kalcium övergående duration, Wk = vecka, k = x 1000 celler, CSs = hjärtsfäroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Figur 4. Effekt av kryokonservering på hjärtsfäroidernas livskraft och struktur. (A) Schematisk representation av CS-generering, efterföljande biobankning och upptining. (B) Test av flödescytometricellviabilitet i både färska och kryokonserverade CS. Som en positiv kontroll användes en behandling med 10% Triton-X lösning i 5 minuter. (n = 4 per villkor). Data representeras som medelvärde ± SD. ** **p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. (C) Calcein-AM-cellviabilitetstest i färska kontra tinade CS efter 7 dagars odling (n = 15-17 per tillstånd, ** **p < 0,001, genom parat t-test; skalstång, 200 μm). (D) Representativt ljusfält (vänster) och immunofluorescensfärgning för α-aktinin och troponin T-uttryck i färska och tinade CS. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grön) och troponin T (röd). De sammanslagna bilderna till höger visar sarkomerstrimmor i CS: erna. Skalstång, 50 μm. Förkortningar: X = valfri upptiningsdag, PI = propidiumjodid, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Figur 5: Kalciumtransienter i färska kontra tinade CS. (A) Representativa kalciumtransienta spår och time-lapse-bilder av CS före kryokonservering och 1 vecka efter upptining. (B) Slagprocent av färska och frysta/tinade hjärtsfäroider. Staplar representerar enskilda experiment. (C) Slagfrekvens av färska och frysta/tinade hjärtsfäroider. (D-G) Kvantifiering av kalciumövergående parametrar: toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90. Data är medelvärde ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar; CTD = kalciumövergående duration, CSs = hjärtsfäroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur 1: Representativa grindstrategier för flödescytometrianalys. (A) Representativ grindstrategi för α-aktininpositivt hiPSC-CM i en ren population kontra negativ kontroll och isotypkontroll. Antalet α-aktininpositiva analyserade celler är 25 x 105. Förkortningar; SSC = sidospridning, PI+ = propidiumjodid positiv. B) Representativ grindstrategi för viabilitetsanalysen i både färsk, tinad, positiv kontroll (Triton-X) och negativ kontroll (ofärgad). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Här presenteras en uppsättning protokoll för generering och kryokonservering av hjärtsfäroider (CS) från humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter odlade i ett multidimensionellt format med hög genomströmning. Denna tredimensionella modell fungerar som en robust plattform för sjukdomsmodellering, screening med hög genomströmning och bibehåller dess funktionalitet efter kryokonservering.

Generering, screening med hög genomströmning och biobankning av humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda hjärtsfäroider

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde för generering, underhåll och optisk analys av hjärtsfäroider. Dessa hjärtsfäroider är viktiga för att fylla gapet i nuvarande in vitro-sjukdomsmodeller. Denna teknik gör det möjligt för forskare att skapa nästa generations screening med hög genomströmning och funktionell lagring av hjärtsfäroider.Börja med att tillsätta en milliliter per centimeter kvadrat steril hjärtavskiljningslösning till varje brunn på en odlingsplatta innehållande konfluenta humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Bekräfta avlägsnandet av celler genom att observera vita och rundformade celler under 4x förstoring av ett ljusfältmikroskop.Använd en fem-milliliter pipett, dissociera cellerna mekaniskt genom att spola dem med två milliliter varmt basalmedium för att förbereda en enda cellsuspension. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera i tre minuter vid 300 g. Aspirera sedan supernatanten och återsuspendera cellerna i en milliliter hiPSC-CM-ompläteringsmedia.Använd en pipettspets på 1 000 mikroliter för att dissociera cellpelleten. Efter tre eller fyra blandningar, eftersom lösningen verkar homogen, ladda den i en kassett för att räkna cellerna och överför lämplig mängd celler i 100 mikroliter ompläteringsmedium till varje brunn med en ultralåg fastsättning, rundbotten, 96-brunnsplatta. Placera hjärtsfäroidplattan på en orbitalskakare i inkubatorn vid 70 rpm med en 37 grader Celsius temperatur, 5% koldioxid, 21% syre och 90% fuktighet i 24 timmar.För att undvika sfäroidbrott, aspirera endast 50 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 100 mikroliter RPMI plus B27-medium per brunn under de första 48 timmarna. Aspirera sedan 100 mikroliter av mediet från varje brunn och tillsätt 100 mikroliter av mognadsmediet per brunn. Behåll cellerna i mognadsmediet och uppdatera mediet varannan till var tredje dag.Placera sfäroidplattan på is i 10 minuter för förkylning innan du centrifugerar plattan i tre minuter vid 70 g. Ta bort mediet tills 50 mikroliter finns kvar i brunnen. Tillsätt sedan 200 mikroliter iskallt hiPSC-frysmedium per brunn.Försegla plattan med en plåtförseglingsfilm. För att förbereda kiselformen, blanda komponenterna i kiselelastomersatsen i ett 10-till-1-förhållande och tillsätt lösningen inuti brunnplattans nedre del. Avbubbla lösningen med en vakuumpump i 15 till 20 minuter.Placera formen i en ugn och härda den vid 60 grader Celsius i åtta timmar för att få en halvflexibel elastomer som skalas av plattan. Placera den förseglade plattan försiktigt i en silikonform, vilket säkerställer jämn värmeväxling mellan brunnsplattan och frysen. Frys plattan vid 80 grader Celsius i minst fyra timmar i den förberedda silikonformen innan du överför plattan till en flytande kvävetank eller en 150 grader Celsius frys för långvarig lagring.För att säkerställa en snabb upptining av hjärtsfäroider, samla en cellplatta med hjärtsfäroider åt gången från flytande kväve och placera den i inkubatorn i 15 minuter vid 37 grader Celsius, med 5% koldioxid, 21% syre och 90% luftfuktighet. Ta bort tätningsfilmen från plattan och aspirera 150 mikroliter av varje brunn innan du tillsätter 200 mikroliter av ett varmt basalmedium till varje brunn. Centrifugera plattan vid 70 g i tre minuter och upprepa den varma basala medietvätten.När du är klar, ta bort 150 mikroliter av mediet och tillsätt 200 mikroliter kardiomyocyter upptiningsmedium i varje brunn. Upprepa sedan RPMI-tvätten som nämnts under hjärtsfäroidgenerering, följt av att bibehålla cellerna i mognadsmediet. Efter en vecka av kulturen är de tinade hjärtsfäroiderna optimala för kalciumhantering optisk avbildning.Aspirera 150 mikroliter av varje brunn. Behandla de tinade hjärtsfäroiderna med 100 mikroliter Cal-520 AM kalciumfärgmedium per brunn under mörka förhållanden och inkubera plattan i 60 minuter. Förbered ett kalciumförvärvs- och analyssystem genom att driva mikroskopet och se till att miljökontrollalternativet är på.Justera kamerans och inramningens bländarmått för att minimera bakgrundsområdet. För att mäta kalciumsignalen, med hjälp av en 488-nanometer laser, ställ in kontrasten till en svart bakgrund med en ljusgrön signal under kalciumfrisättning. Spela in en video med en konsekvent ström av 2 till 10 toppar inom 10 sekunder.Spela in en 10-sekunders video och skanna över 96-brunnsplattan, först flytta till vänster, sedan nedåt på ett sicksack-sätt för att täcka hela plattan. Efter att ha förvärvat kalciumtransienterna, analysera data med hjälp av fluorescensspåranalysprogramvara. Hjärtsfäroiderna förvärvade en 3D-struktur vid dag ett efter sådd, som kunde odlas i upp till sex veckor.Majoriteten av tre veckor gamla hjärtsfäroider uttryckte regelbunden sarkomerorganisation med alfaaktinin och troponin T.Höga nivåer av alfa-aktinin i dag noll och tre veckor gamla hjärtsfäroider indikerade en konstant och mycket ren cellulär komposition under odling. Ett ökat uttryck av hjärtgener, desmosomer och mitokondrier observerades i sfäroider än hiPSC-CMs odlade i 2D i 90 dagar. Slagprocenten av hjärtsfäroider var liknande under de första tre veckorna efter generationen och sjönk signifikant under vecka sex på grund av försämring av hjärtsfäroider.Slagfrekvensen minskade signifikant vid vecka tre jämfört med och sjönk vid vecka sex till följd av försämring. Transienta kalciumparametrar indikerade ett högre toppvärde vid vecka två, medan stigtiden, sönderfallstiden och den transienta kalciumdurationen vid 90 % av sönderfallet ökade signifikant vid vecka tre, vilket visar att hiPSC-CM-härledda sfäroider var funktionellt optimala vid vecka två och tre efter generationen. Sfäroidstorleken ökade med antalet celler som användes för sådd.I större storlek, gamla sfäroider, var slaget betydligt högre. En liknande och signifikant högre slaghastighet visades av 5k, 10k och 20k sfäroider jämfört med 2.5k sfäroider. Kryokonservering påverkade inte cellviabiliteten inom hjärtsfäroiderna.Liknande uttryck av sarkomeriska proteiner i de tinade och färska åldersmatchade sfäroiderna indikerade kryokonserveringseffektivitet. Det fanns ingen signifikant förändring i slaghastigheten för tinade eller färska hjärtsfäroider. Inga signifikanta förändringar observerades i stigtid, sönderfallstid och CTD90 för tinad eller färsk CS. Förutom sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening med hög genomströmning kan dessa sfäroider också användas för bioreaktorer av extracellulär vesikelproduktion och extracellulära vesikelrelaterade terapier.Biobanken av dessa sfäroider kan också användas som en ny kardiomyocytförsörjning för regenerativa strategier. Ackumulerande bevis tyder på att biobanker av patient-härledda stamcellsmodeller för cystisk fibros, cancer och hjärtsfäroider har stor potential för att avslöja molekylära mekanismer för läkemedelsscreeningar och för personlig medicin.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidad differentiering av mogna njurpodocyter från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller under kemiskt definierade förhållanden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Mikrofluidisk tillverkning av kärnskalmikrokapslar som bär humana pluripotenta stamcellsfäroider

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Utvärdering av hjärtkontraktilitetsmoduleringsterapi i 2D-humana stamcellshärledda kardiomyocyter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...