Name: generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Cyteseer yazılım paketi ve otomatik 3D kalsiyum analizinin optimizasyonu için VALA bilimlerine teşekkür ederiz. PLN vakfının (RM) hibe desteğini kabul etmek istiyoruz. P.A.D. ve F.S. CUREPLaN Leducq tarafından desteklenmektedir. J.P.G.S., Avrupa Araştırma Konseyi'nin (ERC) H2020-EVICARE (#725229) tarafından desteklenmektedir. J.W.B., UMC Utrecht Klinik Bursu, Hollanda Kalp Enstitüsü Bursu ve CVON-Dosis genç yetenek bursu tarafından desteklenmektedir; Hollanda Kalp Vakfı (CVON-Dosis 2014-40). N.C., Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (RegmedXB #024.003.013) ve Marie Skłodowska-Curie Eylemleri (Hibe anlaşması RESCUE #801540) tarafından "Malzeme Güdümlü Rejenerasyon" Yerçekimi Programı tarafından desteklenmektedir. V.S.-P. İttifak Fonu (UMCU, UU, TU/e) tarafından desteklenmektedir. A.V.M., AB tarafından finanse edilen BRAVE projesi tarafından desteklenmektedir (H2020, ID:874827)

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells.">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells.">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813 (2022).</li><li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).</li><li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method.">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).</li><li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications.">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li><li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup.">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li><li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture.">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).</li><li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture.">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).</li><li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues.">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+heart+regenerative+therapies:+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering.">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).</li><li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure.">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization.">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+New+phase+in+development.">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li><li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells:+Generation,+optimization,+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro.">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).</li><li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells:+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform.">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li><li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening.">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).</li><li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+action+potential+measurements:+2D+and+3D+cell+culture.">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).</li><li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Strategies,+challenges,+and+future+directions.">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition.">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li><li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation.">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yeh, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+spheroids+to+organoids:+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish.">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Kardiyak ilaç keşfi, okumaları doğru bir şekilde gerçekleştirmek için yetersiz verim ve fizyolojik sadakate sahip insan dışı hayvan ve hücresel modellere güvenilmesi nedeniyle engellenmektedir. HT enstrümantasyonu ve fizyolojik problarla birlikte hiPSC-CM biyolojisi, insan modellerini kalp hastalığı modellemesinin ve ilaç keşfinin en erken aşamalarına yeniden sokma potansiyeline sahiptir. Optimal bir kalp hastalığı modellemesi ve ilaç tarama platformu için yüksek kaliteli ve fonksiyonel CSs üreten bir 3D kalp dokusu üretim yöntemi geliştirdik. Ek olarak, endüstriyel EV üretimi için 3D biyoreaktör sistemlerinde küresel teknolojiyi birleştirmek, EV tabanlı tedavinin klinik çevirisine yönelik gerekli bir adımı sağlar. Burada açıklanan yöntem birkaç önemli faktöre dayanır ve mevcut protokollerin 9,10,28,29 bir çeşididir. Bu yöntemler şunları içerir: 1) 3D doku yapılarının oluşturulması, 2) taramadan önce optimal hücre sayısı ve zamanlaması, 3) cihazların duyarlılığını ve yüksek verim kapasitesini artırmak ve 4) herhangi bir fonksiyonel analizden önce sferoidleri dondurabilmek. Daha önce açıklanan protokollerin aksine, önerilen protokol günde 1.500 sferoid üretimini ve HTS için uygunluğu açıklamaktadır. Mevcut 96 kuyucuklu kalsiyum görüntüleme sistemlerini veya 24 kuyucuklu çoklanmış mühendislik kalp dokularını kullanarak 10 replikasyon için 6 x 0.5 log dozunun üzerinde yüz bileşiğin geleneksel analizi, yaklaşık 500 milyon ila 3 milyar hiPSC-CM31,32 gerektirir. Önerilen uygulama, kardiyak taramaları geleneksel sistemlere kıyasla daha az maliyetli ve zaman etkili hale getirmektedir, çünkü 96 kuyucuklu plakalar, tarif edilen yönteme kıyasla tohumlama yoğunluğunun sadece% 10'unu gerektirmektedir. Dahası, asılı-damla yöntemi gibi önceki protokollerle karşılaştırıldığında, ultra düşük bağlantı plakalarında kendiliğinden toplanarak sferoidlerin üretilmesi, tek mikro dokuların yüksek kaliteli otomatik görüntülenmesini sağlar33.
Bu küçük 3D model, in vivo kardiyovasküler ortamın biyolojik ve fizyolojik fenotipini taklit eder. Daha önce gösterildiği gibi, kalsiyum geçicileri, 2D tek katmanlı hücre kültürlerine kıyasla 3D kalp dokusu yapılarında çarpıcı bir şekilde artmaktadır34.
Daha sonra, tohumlama yoğunluğunun ve uygun kültürleme süresinin de başarılı bir CS taraması için kritik faktörler olduğunu bulduk. Sferoid başına 10K-20K hiPSC-CM'lerin yoğunlukları ve nesilden sonraki 2-3. haftalar arasındaki tarama optimal iken, çok küçük veya çok eski sferoidler bozulmuş kalsiyum kullanımı göstermektedir (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu nedenle, tohumlama yoğunluklarını mümkün olduğunca tutarlı tutmak önemlidir, çünkü boyut fonksiyonel parametreleri etkiler. Ayrıca, bu optik yöntem bir bütün doku olarak canlı 3D kültürler için iyi sonuçlar sağlasa da, zaman alıcı histoloji yöntemlerine güvenmeden (alt) hücresel düzeyde daha büyük sferoidler içinde veri elde etmek zordur. Son zamanlarda, işaretleyicilerin tek hücreli nicelleştirilmesi fırsatı ile tüm 3D sferoidlerin elde edilmesini sağlayan "optik olarak temizleme" kullanan çeşitli yaklaşımlar yayınlanmıştır. Burada, CS hasadından görüntü analizine 3 günlük bir protokol uyarladık, bu da konfokal mikroskopi29 kullanılarak 3D görüntüleme için optimize edilmiştir (Şekil 1C ve Şekil 4D).
Son olarak, 3D kalp dokusu uygulamaları ve ticari uygulamalardaki artışla birlikte, çeşitli donörlerden uzun süreli depolama ve hastaya özgü biyobankacılığa olan talep artmaktadır. Kriyoprezervasyon, zaman içinde birden fazla partiden HTS plakaları üretmek için etkili bir stratejidir. HiPSC-CM'lerin donması daha önce tanımlanmıştır ve diğer kültürlenmiş hücre tiplerine kıyasla farklı değildir 10,35,36. Son zamanlarda, 2D hücreli plakaları dondurmak için yaklaşımlar tanımlanmıştır37. Burada, PSC kriyoprezervasyon kitinin diğer üçüne kıyasla en uygun durum olduğunu (veriler gösterilmemiştir) bulduk ve bu ortamı sferoidlerin verimli bir şekilde dondurulması için kullandık. Kriyoprezervasyondan sonra, canlılık yüksek kalır (Şekil 4B, C), ancak CSs'nin elektrofizyolojik özellikleri etkilenir ve çözülmeden sonra bir kuluçka süresi gereklidir. Gerçekten de, çözülmeden 1 hafta sonra, CSs kendiliğinden atma aktivitesi ve kalsiyum kullanımı gösterdi. Bununla birlikte, taze ve geri kazanılmış hiPSC-CM'lerin her zaman aynı moleküler ve fizyolojik özellikleri göstermediği açıklanmıştır38. Bu sınırlama, ilaca bağlı kardiyak okumaları değerlendirmek için kriyokorunmuş hiPSC-CM'ler kullanıldığında dikkate alınmalıdır. Ayrıca, sferoid başına düşen hücre sayısını ve kalsiyum geçici görüntülemenin optimal zamanlamasını etkili bir şekilde modüle etmemize rağmen, hiPSC türevi kardiyomiyosit hücrelerini endotel hücreleri, fibroblastlar, hücre hücre kavşakları ve kitosan, kollajen IV, fibronektin, matrijel veya laminin gibi hücre dışı matrislerle karıştırarak kardiyak sferoidler geliştirilebilir. in vivo kardiyak ortamı taklit ederek39, 40. Genel olarak, hastalık modelleme ve HT ilaç taraması gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olan CS'leri verimli bir şekilde oluşturmak için adım adım bir protokol öneriyoruz.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) keşfi, insan gelişimini ve hastalığı hücresel düzeyde incelemek için benzeri görülmemiş fırsatlar sundu. Son on yılda, gelişimsel dersler kullanılarak, hiPSC'lerin kardiyomiyositlere (CM'ler) etkili bir şekilde farklılaşmasını sağlamak için çeşitli protokoller oluşturulmuştur1,2,3,4. hiPSC kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD'ler) modellenmesi, yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilmesi ve kardiyak rejeneratif stratejiler 5,6,7,8 için bir kaynak olarak hizmet edebilir. HiPSC'lerin yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmasına rağmen, belirsiz CM sayıları kardiyak alanda bir zorluk olmaya devam etmektedir, çünkü olgunlaşmış hiPSC-CM'ler genellikle proliferatif değildir ve birincil insan hücreleri yüksek miktarlarda mevcut değildir.
Son zamanlarda, düşük hücre yoğunluğu kültürü ile eşzamanlı Wnt sinyal aktivasyonunun, hiPSC-CMs 9,10'un büyük bir proliferatif yanıtı (250 kata kadar) ile sonuçlandığını açıkladık. Kültür şişesi formatında seri geçiş yoluyla hiPSC-CM'lerin büyük ölçüde genişletilmesine yönelik bu uygun maliyetli strateji, çok sayıda fonksiyonel hiPSC-CM'nin standardizasyonunu ve kalite kontrolünü kolaylaştırır. Ek olarak, çeşitli bağışçılardan gelen büyük miktarlarda hiPSC-CM'lere olan talebe ayak uydurmak için, hiPSC-CM'lerin biyobankacılığı10 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu standart kültür yemeklerinde tohumlanan kardiyomiyosit monokatmanları, kalpte bulunan karmaşık 3D yapıyı temsil etmemektedir. Dahası, hiPSC-CM'lerin olgunlaşmamışlığı bir engel olarak kalmıştır, bu nedenle in vivo kardiyovasküler ortamın biyolojik ve fizyolojik fenotipini taklit etmede yetersiz kalmıştır.
HiPSC-CM'lerin kendi kendine organizasyon 11,12, hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillenmesi 13, gelişmiş olgunlaşma 14,15,16 ve senkronize kasılma 17,18,19 gibi daha yakın fizyolojik davranışlar gösterdiği yeni 3D in vitro modeller geliştirilmiştir. . İlaç keşfi, ilaç kardiyotoksisite testi, hastalık modellemesi, rejeneratif tedaviler ve hatta ilk klinik çalışmalar20,21,22,23,24 için 3D modeller kullanılmıştır. En çok kullanılan modellerden biri, doku benzeri bir düzenleme ve kardiyak kontraktiliteyi 13,17,25 sergileyen fibrin bazlı mühendislik kalp dokusudur (EHT). Daha önce, genişletilmiş hiPSC-CM'lerden üretilen EHT'lerin, genişlememiş hiPSC-CM'lerden elde edilenlerle karşılaştırılabilir kontraktilite gösterdiğini ve genişleme9'dan sonra ödün vermeyen hücresel işlevsellik gösterdiğini gösterdik. Bununla birlikte, hiPSC-CM'lerden EHT'lerin üretimi iyi kurulmuş olsa da, bir HT değerlendirme platformunun kurulmasıyla ilgili daha fazla gelişme beklenmektedir. Burada, 96 kuyucuklu formatta çok sayıda kendiliğinden toplanan kardiyak sferoidin (CSs) hızlı bir şekilde üretilmesi, yüksek verimli tarama (HTS) amaçları için 3D koşullarda bir iyileşme sağlar.
Genel olarak, CSs'nin 3D hücre kültürü olarak avantajı, yüksek tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliğidir. Özellikle, robotik numune işleme ile birleştirilen CSs, CS kültürünü, ilaç tedavisini ve yüksek içerikli analizi standartlaştırabilir ve otomatikleştirebilir20. Burada, optik kalsiyum toplama ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak verimli bir şekilde kriyokorunabilen ve kardiyak fonksiyon için taranabilen yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli CS'ler üretmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz. Bu model, yüz ila binlerce sferoid17,18 üzerinde yüksek verimli ekranlar gerçekleştirmek için basit ama güçlü bir araç sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 wells suspenion plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab45932</td>
			<td>Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520, AM&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMi8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Las X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>76050771.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11011</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4003000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td>
			<td>CVI-273 (control 1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cell lines</td>
			<td>Germany&#160;</td>
			<td>141 (control 2) 144 (control 3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Ajax Firechem</td>
			<td>265.2.5L-PL</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control, FITC mouse IgM &#954; isotype</td>
			<td>BD</td>
			<td>556652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Thunder, DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0&#8211;7.6</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC281692</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES Membrane Vacuum Filter system</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI/RNase Staining Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F10797</td>
			<td>Dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>SYLGARD</td>
			<td>184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Fisher&#160;</td>
			<td>Scientific&#160;</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>1254</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, high-throughput screening, and biobanking of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac spheroids

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), insan kalp hastalığı modellemesi ve terapötikleri için büyük önem taşımaktadır. Kısa bir süre önce, hiPSC-CM'lerin iki boyutta (2D) büyük ölçüde genişletilmesi için uygun maliyetli bir strateji yayınladık. İki ana sınırlama, hücre olgunlaşmamışlığı ve yüksek verimli tarama (HTS) platformlarında üç boyutlu (3D) düzenleme ve ölçeklenebilirlik eksikliğidir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, genleşmiş kardiyomiyositler, 3D kardiyak hücre kültürü ve doku mühendisliği tekniklerinin oluşturulması için ideal bir hücre kaynağı oluşturur. İkincisi, kardiyovasküler alanda büyük bir potansiyele sahiptir ve daha gelişmiş ve fizyolojik olarak ilgili HTS sağlar. Burada, 96 kuyucuklu bir formatta kardiyak sferoidlerin (CSs) üretimi, bakımı ve optik analizi için kolay ölçeklenebilirliğe sahip HTS uyumlu bir iş akışını açıklıyoruz. Bu küçük CS'ler, mevcut in vitro hastalık modellerinde ve / veya 3D doku mühendisliği platformları için üretimde mevcut boşluğu doldurmak için gereklidir. CSs oldukça yapılandırılmış bir morfoloji, boyut ve hücresel kompozisyon sunar. Ayrıca, CSs olarak kültürlenen hiPSC-CM'ler, artan olgunlaşma ve spontan kalsiyum kullanımı ve kontraktil aktivite gibi insan kalbinin çeşitli fonksiyonel özelliklerini gösterir. CSs'nin oluşturulmasından fonksiyonel analize kadar tüm iş akışının otomatikleştirilmesiyle, yüksek verimli (HT) görüntüleme ve kalsiyum işleme analizinin gösterdiği gibi parti içi ve partiler arası tekrarlanabilirliği artırıyoruz. Tanımlanan protokol, kalp hastalıklarının modellenmesine ve tam otomatik bir HTS iş akışında karmaşık bir 3D hücre ortamında tek hücre düzeyinde ilaç / terapötik etkilerin değerlendirilmesine olanak tanır. Ek olarak, çalışma, tüm sferoidlerin uzun süreli korunması ve biyobankacılığı için basit bir prosedürü tanımlamakta ve böylece araştırmacılara yeni nesil fonksiyonel doku depolaması oluşturma fırsatı sunmaktadır. HTS, uzun süreli depolama ile birleştiğinde, ilaç keşfi ve testi, rejeneratif tıp ve kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda translasyonel araştırmalara önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

Şekil 1A'da gösterilen protokol, daha önce genişletilmiş hiPSC-CM'lerden CS'lerin oluşturulmasını açıklar. CS'ler, ultra düşük ataşmanlı yuvarlak tabanlı plakalarda tohumlama sonrası 1. güne kadar 3D bir yapı kazanır ve 6 haftaya kadar kültürlenebilir (Şekil 1B). İmmünofloresan boyama ile değerlendirildiği gibi, 3 haftalık CS'lerdeki hücrelerin çoğunluğu α-aktinin ve troponin T gibi sarkomerik proteinleri eksprese etti ve düzenli sarkomer organizasyonu sergiledi (Şekil 1C). α-aktininin pozitif hücrelerin nicelleştirilmesi için akım sitometri analizi yapıldı. İmmünofloresan sonuçlarına göre, akış sitometrisi verileri, hem 0. günde (% 76.9 α% 16.6) hem de 3 haftalık CSs'lerde (% 71.1 ±% 22.7) karşılaştırılabilir yüksek seviyelerde ±-aktinin göstermiştir (Şekil 1D), kültürleme sırasında sabit ve oldukça saf bir hücresel kompozisyonu göstermektedir. HiPSC-CM türevli sferoidlerde (gün 42) kavşaklar (GJA1, JPH2 ve PKP2), dezmozomlar (DES) ve mitokondri (ATP5A) için kardiyak genlerin ekspresyonunda 90 gün boyunca 2D'de kültürlenen hiPSC-CM'lere karşı artmış bir ekspresyon vardı (Şekil 1E). Bu genlerin ekspresyonu, hücre-hücre etkileşiminin ve olgunlaşmanın bir işaretidir30.
Daha sonra, CSs'nin fonksiyonel özellikleri, yani vuruş hızı ve Ca2+ kullanımı, farklı zaman noktalarında değerlendirilmiştir (Şekil 2). Yükselme zamanı, pik zaman, bozunma süresi ve kalsiyum geçici süresi (CTD90) gibi kalsiyum geçici parametreleri Şekil 2A,B'de belirtildiği gibi değerlendirildi. Yenen CS'lerin yüzdesi, nesilden sonraki ilk 3 haftada benzerdir, ancak 6. haftada (Wk6) CSs'de önemli ölçüde düşmüştür (Şekil 2C). Dayak hızı, Wk1'e kıyasla Wk3'te önemli ölçüde azaldı ve yenen CS'lerin yüzdesine benzer şekilde, Wk6'da çarpıcı bir şekilde düştü (Şekil 2D). Wk6'da, hem atma hızındaki hem de atan CSs sayısındaki düşüşü açıklayabilen CS bozulması gözlendi. kalsiyum geçici parametrelerinin ölçümü, Wk2'de (Şekil 2E) önemli ölçüde daha yüksek bir tepe değeri gösterirken, Wk3'te Wk1'e kıyasla yükselme süresi, çürüme süresi ve CTD90 önemli ölçüde artmıştır (Şekil 2F-H ). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar hiPSC-CM kaynaklı sferoidlerin nesil sonrası yaklaşık 2. ve 3. haftalarda işlevsel olarak optimal olduğunu göstermektedir.
Şekil 3, küresel boyutun dayak hızı ve kalsiyum kullanımı üzerindeki etkisini göstermektedir. CS'ler, 2.5 x 10 4, 5 x 104, 10 x 10 4 ve 20 x 10 4 hiPSC-CM'lerin 96 kuyucuklu bir plakanın kuyusunda koşul başına toplam 24 CSs/kuyucuk için tohumlanmasıyla oluşturulmuştur (Şekil 3A). Beklendiği gibi, kullanılan hücre sayısı arttıkça küresel boyut artmış, 178 ± 36 μm ile 351 μm ± 65 μm arasında değişmiştir (Şekil 3A, sağ panel). Ca2+ geçicileri 3 haftalık KYS'lerde dört farklı tohumlama yoğunluğunda ölçüldü (Şekil 3B). Beating CSs ölçümleri, daha küçük boyutlu CS'lerin (2.5K- ve 5K-CS'ler) sadece% 50'sinin dövüldüğünü, daha büyük boyutlu döven CS'lerin (10K- ve 20K-CSs) yüzdesinin ise anlamlı derecede daha yüksek olduğunu (yaklaşık% 85) göstermiştir (Şekil 3C). Benzer bir dayak hızı (yaklaşık 28 bpm), 2.5K-CS'lere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olan 5K, 10K- ve 20K-CSs tarafından gösterilmiştir (Şekil 3D). Kalsiyum görüntülerinin tepe değerleri test edilen tüm koşullarda benzerdi (Şekil 3E), ancak yükselme süresi (Şekil 3F), bozunma süresi (Şekil 3G) ve CTD90 (Şekil 3H), daha küçük olanlara (2.5K ve 5K-CSs) kıyasla daha büyük boyutlu CS'lerde (10K ve 20K-CS'ler) anlamlı derecede artmıştır. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar hiPSC-CM türevli sferoidlerin, 10K ve 20K hiPSC-CM'ler / kuyular arasında bir tohumlama yoğunluğu kullanıldığında kalsiyum işleme taraması için en uygun olduğunu göstermektedir.
Daha sonra, kriyoprezervasyonun CS'nin yaşayabilirliği ve işlevi üzerindeki etkisini değerlendirdik. Analizden önce, çözülmüş CS'ler kültürde 1 hafta boyunca muhafaza edildi (Şekil 4A). Hem akış sitometrisi (Şekil 4B) hem de Calcein-(Şekil 4C) hücre canlılığı testleri ile gösterildiği gibi, kriyoprezervasyon, CSs içindeki hücre canlılığını etkilemedi. Ek olarak, çözülmüş CS'ler, taze yaş uyumlu CS'lere kıyasla benzer sarkomerik protein ekspresyon seviyelerini göstermiştir (Şekil 4D). Bu veriler, CS'lerin sonraki kardiyak fonksiyon analizi ve yüksek verimli tarama için verimli bir şekilde kriyokorunabileceğini göstermektedir.
Son olarak, dayak aktivitesi ve Ca2+ kullanımı hem taze hem de kriyokorunmuş CSs'de ölçülmüştür (Şekil 5). Vuruş CSs'sinin yüzdesi, çözülmeden sonra, sırasıyla 2, 5 ve 7 günde farklı zaman noktalarında ölçüldü. Yeni CS'lerin çoğu zamanla dayak aktivitesi gösterirken, kriyokorunmuş CS'lerin dayak aktivitelerini geri kazanmak için 1 haftaya kadar kültürlenmeye ihtiyaçları olduğu açıktır (Şekil 5B). Çözülmüş CS'lerin dayak hızında taze olana karşı önemli bir değişiklik olmadı; ancak bazı dondurulmuş CS'lerde spontan dayak aktivitesi gözlenmedi (Şekil 5C). Dondurulmuş/çözülmüş CS'lerde pik değerler tazeye kıyasla anlamlı derecede azalmış olmasına rağmen (Şekil 5D), dondurulmuş/çözülmüş CS'lerin yükselme süresi, bozunma süresi ve CTD90'ında tazeye kıyasla anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 5E-G). Bu veriler, çözülmeden sonra, çırpma aktivitesini ve Ca2 + geçicisini ölçmeden önce CSs'nin inkübatörde en az 1 hafta iyileşmesine izin vermenin önemli olduğunu göstermektedir.
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar hiPSC-CM türevi sferoidlerin kriyoprezervasyonunun kardiyomiyosit canlılığını, sarkomerik yapıyı ve spontan atma aktivitesi ve kalsiyum kullanımı gibi fonksiyonel özelliklerini koruduğunu göstermektedir. Bu nedenle, hiPSC-CM türevli sferoidler, kardiyak elektrofizyolojiyi in vitro olarak doğru bir şekilde özetlemek için uygun bir modeli temsil eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> Şekil 1: Kardiyak sferoidlerin üretimi . (A) Wnt tabanlı yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmanın şematik gösterimi, daha sonra hiPSC-CM'lerin genişlemesi ve CS'lerin oluşturulması. biorender.com ile oluşturuldu. (B) CS kültürünün farklı zaman noktalarında parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu, 200 μm. Wk haftayı temsil eder. (C) 3 haftalık CSs'de kardiyak sarkomerik proteinler α-aktin ve troponin T için temsili immünofloresan görüntüleri. İmmünofloresan: Hoechst (mavi), α-aktinin (yeşil) ve troponin T (kırmızı). Ölçek çubuğu, 200 μm. Sağdaki yakınlaştırılmış birleştirilmiş resim, sarkomer organizasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu, 50 μm. (D) CSs oluşumundan önce (0. gün) ve 3 hafta sonra α-aktinin pozitif hücrelerin akış sitometrisi nicelleştirilmesi. (n = koşul başına 14-23. (E) RT-qPCR, hücre kavşakları, ara filamentler ve mitokondri ile ilgili farklı kardiyak genlerin ekspresyon seviyelerini belirlemek için 90 gün (2D) boyunca kültürlenmiş hiPSC-CM'ler ve 42 gün boyunca kültürlenmiş sferoid örnekler üzerinde gerçekleştirilir. (n = 1-3 parti). Veriler, eşlenmemiş bir t-testi ile hesaplanan ortalama ± SD. NS (anlamlı olmayan) olarak temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> Şekil 2: Üretimden sonraki farklı haftalarda CSs'de dayak hızı ve kalsiyum kullanımı. (A) Cyteseer Software'deki Vala bilimleri analiz algoritması tarafından hesaplanan kalsiyum geçici parametrelerinin örnekleri. (B) Temsili kalsiyum geçici izleri ve CSS'nin üretim sonrası farklı zaman noktalarında (haftalar) hızlandırılmış görüntüleri. Ölçek çubuğu, 200 μm. (C) Spontan dayak aktivitesinin zaman seyri niceliği, dövülen CSs'nin yüzdesi olarak ifade edilir. (D) Kültürleme süresi boyunca CSs'nin dayak hızı. (E-H) Pik değer, yükselme süresi, bozunma süresi ve CTD90 gösteren kalsiyum geçicilerinin miktarı. Biyolojik replikasyonlar = üç, teknik replikalar = sırasıyla 38, 50, 66 ve 7 olan ortalama ± SD'dir. *p < 0,05, ****p < 0,001; tek yönlü ANOVA'nın ardından Tukey'in post hoc çoklu karşılaştırma testi. Kısaltma; CTD = kalsiyum geçici süresi, Wk = hafta, CSs = insan kardiyak sferoidleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> Şekil 3: Farklı hücre tohumlama yoğunlukları kullanılarak üretilen CS'lerde dayak hızı ve kalsiyum işleme. (A) Farklı sayıda hiPSC-CM kullanılarak oluşturulan CS'lerin parlak alan görüntüleme (solda) ve boyut ölçümleri (sağda). Ölçek çubuğu, 200 μm. (B) 2.5K-20K-CSs'nin temsili kalsiyum geçici izleri ve hızlandırılmış görüntüleri. (C,D) 2.5K-20K-CSs'lik vuruş yüzdesi ve yenme oranı. (E-H) 2.5K-20K-CSs'de tepe değeri, yükselme süresi, bozunma süresi ve CTD90. Veriler ortalama ± SD. Biyolojik replikasyonlar = üç, teknik replikalar = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; tek yönlü ANOVA'nın ardından Tukey'in post hoc çoklu karşılaştırma testi. Kısaltmalar: CTD = kalsiyum geçici süresi, Wk = hafta, k = x 1.000 hücre, CSs = kardiyak sferoidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> Şekil 4. Kriyoprezervasyonun kardiyak sferoidlerin yaşayabilirliği ve yapısı üzerine etkisi. (A) CS üretiminin, müteakip biyobankacılığın ve çözülmenin şematik gösterimi. (B) Hem taze hem de kriyokorunmuş CS'lerde akış sitometrisi hücre canlılığı testi. Pozitif kontrol olarak, 5 dakika boyunca% 10 Triton-X çözeltisi içeren bir tedavi kullanıldı. (n = koşul başına 4). Veriler ortalama SD ± olarak gösterilir. ****p < 0,001; tek yönlü ANOVA'nın ardından Tukey'in post hoc çoklu karşılaştırma testi. (C) 7 günlük kültürlemeden sonra taze ve çözülmüş CS'lerde Calcein-hücre canlılığı testi (n = koşul başına 15-17, * ***p < 0.001, eşleştirilmiş t-testi ile; ölçek çubuğu, 200 μm). (D) Taze ve çözülmüş CS'lerde α-aktinin ve troponin T ekspresyonu için temsili parlak alan (solda) ve immünofloresan boyama. İmmünofloresan: Hoechst (mavi), α-aktinin (yeşil) ve troponin T (kırmızı). Sağdaki birleştirilmiş resimler, CSs. Ölçek çubuğundaki sarkomer çizgilerini görüntüler, 50 μm. Kısaltmalar: X = seçim çözülen gün, PI = propidium iyodür, Cal-= calcein-, EthD-I = Ethidium Homodimer I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> Şekil 5: Taze ve çözülmüş CSs'deki kalsiyum geçicileri. (A) CSs'nin kriyoprezervasyondan önce ve çözülmeden 1 hafta sonra temsili kalsiyum geçici izleri ve hızlandırılmış görüntüleri. (B) Taze ve dondurulmuş/çözülmüş kardiyak sferoidlerin dövülme yüzdesi. Çubuklar tek tek denemeleri temsil eder. (C) Taze ve dondurulmuş/çözülmüş kardiyak sferoidlerin dövülme hızı. (D-G) Kalsiyum geçici parametrelerinin miktarı: tepe değeri, yükselme süresi, bozunma süresi ve CTD90. Veriler ortalama ± SD'dir. *p < 0,05, ****p < 0,001; tek yönlü ANOVA'nın ardından Tukey'in post hoc çoklu karşılaştırma testi. Kısaltma; CTD = kalsiyum geçici süresi, CSs = kardiyak sferoidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Akış sitometrisi analizi için temsili geçit stratejileri. (A) Saf bir popülasyonda negatif kontrol ve izotip kontrolüne karşı α-aktininin pozitif hiPSC-CM'leri için temsili geçiş stratejisi. α-aktininin pozitif analiz edilen hücre sayısı 25 x 105'tir. Kısaltma; SSC = yan saçılma, PI+ = propidium iyodür pozitif. (B) Hem taze, çözülmüş, pozitif kontrol (Triton-X) hem de negatif kontrol (lekesiz) canlılık analizi için temsili geçit stratejisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids at JoVE.com

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Bu protokol, kardiyak sferoidlerin üretimi, bakımı ve optik analizi için bir iş akışını tanımlar. Bu kardiyak sferoidler, mevcut in vitro hastalık modellerindeki boşluğu doldurmak için gereklidir. Bu teknik, araştırmacıların yeni nesil, yüksek verimli tarama ve kardiyak sferoidlerin fonksiyonel depolamasını oluşturmalarını sağlar.İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler içeren bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna santimetre kare başına bir mililitre steril kardiyak dekolmanı çözeltisi ekleyerek başlayın. Plakayı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Parlak alan mikroskobunun 4x büyütmesi altında beyaz ve yuvarlak şekilli hücreleri gözlemleyerek hücrelerin ayrılmasını onaylayın.Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için hücreleri iki mililitre ılık bazal ortam ile yıkayarak mekanik olarak ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 300 g'da üç dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre hiPSC-CM kaplama ortamında yeniden askıya alın.Hücre peletini ayırmak için 1.000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Üç veya dört karışımdan sonra, çözelti homojen göründüğünden, hücreleri saymak için bir kasete yükleyin ve 100 mikrolitre kaplama ortamında uygun miktarda hücreyi ultra düşük bir bağlantının, yuvarlak tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Kardiyak sferoidler plakasını, 24 saat boyunca 37 santigrat derece sıcaklık,% 5 karbondioksit,% 21 oksijen ve% 90 nem ile 70 rpm'de inkübatördeki bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.Küresel rüptürü önlemek için, her bir kuyucuktan sadece 50 mikrolitre ortam aspire edin ve ilk 48 saat boyunca kuyu başına 100 mikrolitre RPMI artı B27 ortam ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuktan 100 mikrolitre ortamı aspire edin ve kuyu başına olgunlaşma ortamının 100 mikrolitresini ekleyin. Hücreleri olgunlaşma ortamında tutun ve ortamı her iki ila üç günde bir yenileyin.Küresel plakayı, plakayı 70 g'da üç dakika boyunca santrifüj etmeden önce ön soğutma için 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Kuyuda 50 mikrolitre kalana kadar ortamı çıkarın. Daha sonra kuyu başına 200 mikrolitre buz gibi soğuk hiPSC dondurma ortamı ekleyin.Plakayı bir plaka sızdırmazlık filmi ile kapatın. Silikon kalıbı hazırlamak için, silikon elastomer kitinin bileşenlerini 10'a 1 oranında karıştırın ve çözeltiyi kuyu plakasının alt kısmına ekleyin. Çözeltiyi 15 ila 20 dakika boyunca bir vakum pompası kullanarak kabarcıklarından arındırın.Kalıbı bir fırına yerleştirin ve plakadan soyulmuş yarı esnek bir elastomer elde etmek için sekiz saat boyunca 60 santigrat derecede kürleyin. Sızdırmaz plakayı dikkatlice silikon bir kalıba yerleştirin ve kuyu plakası ile dondurucu arasında eşit ısı alışverişi sağlayın. Plakayı uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına veya 150 santigrat derece dondurucuya aktarmadan önce hazırlanan silikon kalıpta en az dört saat boyunca plakayı 80 santigrat derecede dondurun.Kardiyak sferoidlerin hızlı bir şekilde çözülmesini sağlamak için, sıvı azottan bir seferde kardiyak sferoidlerle bir hücre plakası toplayın ve% 5 karbondioksit,% 21 oksijen ve% 90 nem içeren 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Sızdırmazlık filmini plakadan çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre ılık bazal ortam eklemeden önce her bir kuyucuğun 150 mikrolitresini aspire edin. Plakayı üç dakika boyunca 70g'de santrifüj yapın ve ılık bazal orta yıkamayı tekrarlayın.Tamamlandığında, ortamın 150 mikrolitresini çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre kardiyomiyosit çözme ortamı ekleyin. Daha sonra, kardiyak sferoid üretimi sırasında belirtildiği gibi RPMI yıkamasını tekrarlayın, ardından hücreleri olgunlaşma ortamında tutun. Kültürden bir hafta sonra, çözülmüş kardiyak sferoidler, optik görüntülemenin kalsiyum kullanımı için idealdir.Her bir kuyucuğun 150 mikrolitresini aspire edin. Çözülmüş kardiyak sferoidleri karanlık koşullarda kuyucuk başına 100 mikrolitre Cal-520 kalsiyum boya ortamı ile tedavi edin ve plakayı 60 dakika boyunca inkübe edin. Mikroskopa güç vererek ve çevresel kontrol seçeneğinin açık olduğundan emin olarak bir kalsiyum toplama ve analiz sistemi hazırlayın.Arka plan alanını en aza indirmek için kamera ve çerçeve diyafram açıklığı boyutlarını ayarlayın. Kalsiyum sinyalini ölçmek için, 488 nanometrelik bir lazer kullanarak, kalsiyum salınımı sırasında kontrastı parlak yeşil bir sinyalle siyah bir arka plana ayarlayın. 10 saniye içinde 2 ila 10 tepe noktasından oluşan tutarlı bir akışa sahip bir video kaydedin.10 saniyelik bir video kaydedin ve 96 kuyucuklu plaka boyunca tarayın, başlangıçta sola doğru hareket edin, ardından tüm plakayı kaplamak için zikzak şeklinde aşağı doğru hareket edin. Kalsiyum geçicileri edindikten sonra, floresan izleri analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Kardiyak sferoidler, tohumlama sonrası ilk güne kadar altı haftaya kadar kültürlenebilen bir 3D yapı kazandılar.Üç haftalık kardiyak sferoidlerin çoğunluğu, alfa aktinin ve troponin T. ile düzenli sarkomer organizasyonunu ifade etti Sıfır gününde yüksek alfa aktinin seviyeleri ve üç haftalık kardiyak sferoidler, kültürleme sırasında sabit ve oldukça saf bir hücresel kompozisyona işaret etti. Kardiyak genlerin, dezmozomların ve mitokondrilerin artmış bir ekspresyonu, sferoidlerde, 90 gün boyunca 2D'de kültürlenen hiPSC-CM'lerden daha fazla gözlendi. Kardiyak sferoidlerin dayak yüzdesi, nesilden sonraki ilk üç haftada benzerdi ve kardiyak sferoidlerin bozulması nedeniyle altıncı haftada önemli ölçüde düştü.Dayak oranı, üçüncü haftada karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaldı ve bozulmanın bir sonucu olarak altıncı haftada düştü. Kalsiyum geçici parametreleri, ikinci haftada daha yüksek bir pik değer gösterirken, yükselme süresi, çürüme süresi ve çürümenin% 90'ındaki kalsiyum geçici süresi, üçüncü haftada önemli ölçüde artmış ve hiPSC-CM kaynaklı sferoidlerin fonksiyonel olarak optimal olduğunu göstermiştir. Küresel boyut, tohumlama için kullanılan hücre sayısı ile artmıştır.Daha büyük boyutta, eski sferoidlerde, dayak önemli ölçüde daha yüksekti. Benzer ve önemli ölçüde daha yüksek bir dayak hızı, 2.5k sferoidlere kıyasla 5k, 10k ve 20k sferoidler tarafından gösterilmiştir. Kriyoprezervasyon, kardiyak sferoidlerdeki hücre canlılığını etkilemedi.Çözülmüş ve taze yaş uyumlu sferoidlerde sarkomerik proteinlerin benzer ekspresyonu, kriyoprezervasyon etkinliğini göstermiştir. Çözülmüş veya taze kardiyak sferoidlerin dayak hızında anlamlı bir değişiklik yoktu. Yükselme süresinde, bozunma süresinde ve çözülmüş veya taze CS'nin CTD90'ında önemli bir değişiklik gözlenmedi. Hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taramalarının yanı sıra, bu sferoidler hücre dışı vezikül üretiminin biyoreaktörleri ve hücre dışı vezikül ile ilgili tedaviler için de kullanılabilir.Ayrıca, bu sferoidlerin biyobankacılığı, rejeneratif stratejiler için yeni bir kardiyomiyosit kaynağı olarak kullanılabilir. Biriken kanıtlar, kistik fibroz, kanser ve kardiyak sferoidler için hasta kaynaklı kök hücre modellerinin biyobankalarının, ilaç taramaları ve kişiselleştirilmiş tıp için moleküler mekanizmaları çözme konusunda büyük potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...