Name: determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan MCH: NSF-BSF 1815508 en NIH R01 GM124589. MRM werd gedeeltelijk ondersteund door opleidingsbeurs NIH T32 GM122740.

1. In vitro kinetisch experiment
<ol><li>Voorbereiding van DNA-sjablonen door PCR<ol><li>PCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis: 33 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O) 10 μL 5x buffer voor high-fidelity DNA polymerase 5 μL van 2 mM per desoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP) 0,5 μL van 40 μM voorwaartse primer 0,5 μL omgekeerde primer van 40 μM 0,5 μL (10-100 ng) DNA-sjabloon...

<ol>
	<li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells.">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time.">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li><li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA.">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li><li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li><li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter.">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li><li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway.">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li><li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP.">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).</li><li>Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA.">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194 (2012).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide.">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li><li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients.">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li><li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs.">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li><li>Szatm&#225;ri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies.">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002 (2020).</li><li>Boulos, L., Pr&#233;vost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIVE/DEAD&#174;+BacLightTM:+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water.">LIVE/DEAD&#174; BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore.">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li><li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers.">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li><li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging.">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging.">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li><li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach.">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356 (2021).</li></ol>

Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat8. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men prob...

Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)1. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden1. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA's en niet-coderende RNA'smogelijk maken 2,3,4. Ze zijn ook geplaatst na promotorsequenties als fluorescerende melders van genexpressie, vergelijkbaar met het gebruik van groen fluorescerend eiwit (GFP) als verslaggever, behalve dat de rapportagefunctie zich op het RNA-niveau 5,6 bevindt. Ten slotte zijn fluorogene RNA-aptameren opgenomen in op RNA gebaseerde fluorescerende biosensoren, die zijn ontworpen om de fluorogene reactie te activeren als reactie op een specifiek klein molecuul. RNA-gebaseerde fluorescerende biosensoren zijn ontwikkeld voor live cell imaging van verschillende niet-fluorescerende metabolieten en signaalmoleculen 7,8,9,10,11.
Er is een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van fluorogene RNA-aptameren om dynamische veranderingen in RNA-lokalisatie, genexpressie en kleine molecuulsignalen te visualiseren. Voor elk van deze toepassingen is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren Spinazie212 en Broccoli13 te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met een monsterinjector en om de cellulaire turn-on kinetiek voor Spinazie2 uitgedrukt in Escherichia coli te bepalen met behulp van een flowcytometer. Deze twee RNA-aptameren werden gekozen omdat ze zijn toegepast om RNA-lokalisatie te bestuderen 2,3,4, ze zijn gebruikt in reporters 5,6 en biosensoren 7,8,9,10,11, en de overeenkomstige kleurstofliganden (DFHBI of DFHBI-1T) zijn in de handel verkrijgbaar. Een samenvatting van hun in vitro eigenschappen bepaald in de literatuur is opgenomen in tabel 1 4,13,14, die ten grondslag lag aan de ontwikkeling van het protocol (bv. de gebruikte golflengten en kleurstofconcentraties). Deze resultaten tonen aan dat de fluorogene reacties die worden beïnvloed door RNA-aptameren snel zijn en nauwkeurige metingen voor de gewenste celbiologische toepassingen niet mogen belemmeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>B1A-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18-600-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune 1x Focusing Fluid</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Shutdown Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Performance Tracking Beads</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4449754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Wash Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>&#160;J24974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Bleach</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6FJR8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well plate</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF86610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (anhydrous)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-tip micropipettor tips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate reader with heating control</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10014-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>EC3000XL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen AM95010</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM95010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analysis software from Academic Group License&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159Z11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1643-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MFCD00011110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with temperature control</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water filter with BioPak unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow micropipettor pipette tips</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>RN005R-LRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean-up kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers and templates</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for 0.5 mL tubes</td>
			<td>Techne</td>
			<td>5PRIME/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET31b-T7-Spinach2 Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #79783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>VGC-1508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis equipment</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>ASG-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>38-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short wave UV light source</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11758221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S375-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>09-741-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea-PAGE Gel system&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV fluorescent TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05789.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>2215415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract (Granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers

Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA's te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s−1 en 0,35 s−1. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.

In vitro kinetiek De sequenties van de DNA-sjablonen en primers, die worden gekocht als synthetische oligonucleotiden, zijn weergegeven in tabel 2 en de reagensrecepten worden weergegeven in aanvullend bestand 1. PCR-amplificatie wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA-sjabloon op te schalen met de T7-promotor, die nodig is voor de daaropvolgende in vitro transcriptie (IVT) -reactie. Bovendien kan PCR-amplificatie voor twee doeleinden i...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.

Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

Het bestuderen van in vitro en cellulaire fluorogene aptamerkinetiek stelt de gebruiker in staat om te evalueren of aptamerkleurstofinteracties snel genoeg zijn om een proces van interesse in realtime te bestuderen. De gepresenteerde technieken maken kwantitatieve kinetische metingen zowel binnen als buiten de cel mogelijk, die beide relevant kunnen zijn, afhankelijk van de toepassing van het aptamer. De gepresenteerde methoden kunnen worden toegepast op elk fluorogeen RNA-systeem, inclusief alternatieve aptameren en op RNA gebaseerde biosensoren voor kleine moleculen.Om te beginnen, stel het RNA-renaturatieprogramma van de thermocycler in. Maak het programma door nieuwe programma's maken"nieuwe fase toevoegen" te selecteren en voeg meerdere keren een nieuwe stap toe om temperatuurspecifieke stappen toe te voegen voordat u op opslaan drukt"Aanvullende instellingen aanpassen aan het programma. Om spinazie twee en broccoli RNA's te renatureren, bereidt u twee micromolaire stengels van elk RNA in dubbel gedestilleerd water in een 0,5 milliliter dunwandige PCR-buis.Voeg vervolgens gelijke volumes van twee x renaturatiebuffer toe om één micromolaire RNA-oplossing te maken. Plaats de buizen in de thermocycler. Open het opgeslagen renaturatieprogramma en druk op run"Next, set the plate-reader injector program.Selecteer op de fluorescentieplaatlezer de temperatuur en stel deze in op 37 graden Celsius. Voordat u met de kinetiek begint, moet u ervoor zorgen dat de temperatuur in evenwicht is met deze waarde. Open de software voor de platenlezer.Selecteer instellingen"en vervolgens acquisitieweergave" om het programma in te voeren voor kinetische metingen, selecteer lus" voor elke put. Stel vervolgens de basislijninstelling in op 60 basislijnwaarden en slimme injecteerinstellingen voor injectie van 10 microliter. Stel de fluorescentiewaarde excitatiegolflengte in op 448 nanometer, de emissiegolflengte op 506 nanometer en de cartridge op mono.Stel de totale leestijd in op 10 minuten met een leesinterval van 0,5 seconden. Stel PMT en optiek in op zes flitsen per aflezing. Dan invoerlus naar volgende put.Om de injector van de platenlezer voor te bereiden, selecteert u injecteren op de plaatlezer en levert u een afvalinzamelplaat wanneer deze wordt voorgeschreven. Selecteer vervolgens wassen en reinig de injectiebuis volgens de instructies op de plaatlezer met één millilitervolumes dubbel gedestilleerd water, 75% ethanol en vervolgens gedestilleerd water. Selecteer vervolgens aspirate"waardoor de injector overtollige vloeistof kan uitwerpen.Selecteer vervolgens prime"om de injector te primen met twee 260 microliter van 100 micromolar D F H B I.To voer één kinetisch experiment uit voeg 80 microliter bindingsbuffermastermix toe aan één put van een 96 goed heldere bodemplaat. Voeg vervolgens 10 microliter gereatureerd RNA toe. Laat de plaat en D F H B I-oplossing in de injector gedurende 15 minuten in evenwicht komen tot 37 graden Celsius.Selecteer vervolgens de put die moet worden geanalyseerd in de software-instellingen onder het leesgebied. Selecteer vervolgens onder het tabblad Home de optie uitvoeren om het eerder beschreven kinetische programma uit te voeren. Herhaal dit proces totdat alle experimenten zijn voltooid.Was na de run de injector om de resterende D F H B I-oplossing uit de injectiebuis te verwijderen, zoals eerder aangetoond. Om de experimentele bestanden in te stellen, schakelt u de flowcytometer en computer in. Maak een nieuw bestand op het tabblad experimentverkenner door met de rechtermuisknop op de gebruikersnaam van de flowcytometer te klikken.Selecteer vervolgens nieuw experiment"in het vervolgkeuzevenster en wanneer een nieuw venster op het computerscherm verschijnt, selecteert u experimenttype als buizen" en selecteert u vervolgens ok"Klik in het nieuwe experimentbestand met de rechtermuisknop op de groepsmap en selecteer nieuwe monsterbuis toevoegen"Label de monsterbuizen voor elk specifiek tijdstip en repliceer door met de rechtermuisknop op voorbeeld te klikken" en hernoeming te selecteren" in het vervolgkeuzemenu. Bereid vervolgens een verdunde celoplossing door 1,5 milliliter van één X P B S en drie microliter geïnduceerde cellen in AI-media in een kweekbuis toe te voegen. Voordat u kleurstof toevoegt, meet u de achtergrondfluorescentie van de cellen om te zien hoe de vouw na verloop van tijd wordt ingeschakeld.Zodra de kleurstof is toegevoegd, plaatst u de kweekbuis met cellen in P B S in de lifter van de monsterbuis en tilt u de lifter op naar de injectienaald van het monster. Selecteer vervolgens het juiste voorbeeldbestand op het tabblad van het verzamelpaneel en klik op opnemen"Zodra de run is voltooid, verlaagt u de monsterbuisheffer met de kweekbuis met de hand. Om een spoelstap te starten, om het vloeistofsysteem te spoelen en de overdracht tussen elk biologisch replicatiemonster te minimaliseren.Als u naar het volgende voorbeeld wilt gaan, selecteert u het volgende voorbeeldbestand door op het pijlpictogram naar rechts te klikken bij de naam van de voorbeeldbuis onder het recordpictogram. Om de fluorescentie van cellen met kleurstof te meten, voegt u 1,4 microliter geconcentreerde kleurstofvoorraad toe aan één X P B S met cellen, om een eindconcentratie van 50 micromoleriek D F H B I één T te geven.Bevestig het deksel van de kweekbuis en keer drie tot vijf keer om de oplossing gelijkmatig te mengen. Verwijder vervolgens het deksel en plaats de kweekbuis in de monsterbuisheffer.Nadat u de houder naar de injectienaald van het monster hebt gebracht, klikt u op het recordpictogram onder het juiste monsterbestand. Begin vervolgens een timer door op start te drukken"In vitro kinetiek van fluorogene aptameren spinazie twee en broccoli, weergegeven tweefasige associatiekinetiek voor binding aan de D F H B I-kleurstof. Voor beide aptameren waren de kinetische gegevens beter geschikt door tweefasige associatie dan één fase bij lange meettijden.De best fit curve bepaalde de snelheidsconstanten en halfwaardetijden voor de snelle en langzame associaties. Spinazie twee in de bindingscompetentietoestand, vertoonde een snellere aanzet dan broccoli. De tweede fase kinetiek voor beide aptameren is vergelijkbaar en kan overeenkomen met een gemeenschappelijke snelheidsbeperkende stap.De kinetische krommen van aptameren zijn samengesteld uit een vergelijkbare mate van snel associërende RNA's. Voor cellen die spinazie twee T-RNA tot expressie brengen, neemt de gemiddelde fluorescentie-intensiteit of M F I onmiddellijk toe op het nultijdspunt. Bovendien bereikte cellulaire fluorescentie binnen vijf minuten zijn maximale gebalanceerde M F I-waarde.Controlecellen vertoonden daarentegen een lage achtergrondfluorescentie en geen verandering in M F I-waarden met D M S O-toevoeging De gepresenteerde methoden stellen onderzoekers in staat om te bepalen hoe ze op RNA gebaseerde sensoren in fluorogene aptameren sneller kunnen maken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...