Name: determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים ל- MCH: NSF-BSF 1815508 ו- NIH R01 GM124589. MRM נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה NIH T32 GM122740.

1. ניסוי קינטיקה במבחנה
<ol><li>הכנת תבניות DNA על ידי PCR<ol><li>הגדר תגובות PCR: כדי להכין תגובות PCR, שלב את הריאגנטים הבאים בצינור PCR בעל דופן דקה: 33 μL של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) 10 μL של מאגר 5x עבור DNA פולימראז באיכות גבוהה 5 μL של 2 mM כל טריפוספט דאוקסיריבונוקלאוזיד (dNTP) 0.5 μL של ...

<ol>
	<li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells.">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time.">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li><li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA.">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li><li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li><li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter.">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li><li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway.">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li><li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP.">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).</li><li>Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA.">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194 (2012).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide.">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li><li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients.">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li><li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs.">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li><li>Szatm&#225;ri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies.">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002 (2020).</li><li>Boulos, L., Pr&#233;vost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIVE/DEAD&#174;+BacLightTM:+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water.">LIVE/DEAD&#174; BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore.">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li><li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers.">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li><li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging.">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging.">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li><li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach.">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356 (2021).</li></ol>

עבור ניסוי הקינטיקה במבחנה, ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כללי כדי למדוד את הקינטיקה במבחנה של ביוסנסור פלואורסצנטי מבוסס RNA המכיל גם תחום קושר ליגנד וגם תחום קושר פלואורופור 8. במקרה זה, יש לדגור את הרנ"א עם הפלואורופור לפני המדידות בעת הזרקת הליגנד על מנת לקבל קינטיק?...

תגובות פלואורוגניות הן תגובות כימיות היוצרות אות פלואורסצנטי. אפטאמרים פלואורוגניים של RNA בדרך כלל מבצעים את הפונקציה הזו על-ידי קשירת צבע מולקולה קטנה כדי לשפר את התפוקה הקוונטית הפלואורסצנטית שלה (איור 1A)1. פותחו מערכות אפטמר RNA פלואורוגניות שונות המורכבות מרצפי RNA אפטמר ספציפיים ומליגנדות הצבעהמתאימות 1. אפטאמרים של RNA פלואורוגניים צורפו לתעתיקי RNA כתגי פלואורסצנט המאפשרים הדמיה של תאים חיים של mRNA ו-RNAsשאינם מקודדים 2,3,4. הם גם הוצבו לאחר רצפי מקדמים כמדווחים פלואורסצנטיים של ביטוי גנים, בדומה לשימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמדווח, אלא שפונקציית הדיווח היא ברמת RNA 5,6. לבסוף, אפטאמרים של RNA פלואורוגניים שולבו בביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA, שנועדו לעורר את התגובה הפלואורוגנית בתגובה למולקולה קטנה ספציפית. ביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA פותחו להדמיית תאים חיים של מטבוליטים שונים שאינם פלואורסצנטיים ומולקולות איתות 7,8,9,10,11.
יש עניין גובר בפיתוח אפטמרים של RNA פלואורוגניים כדי לדמיין שינויים דינמיים בלוקליזציה של RNA, ביטוי גנים ואותות של מולקולות קטנות. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך הדיוק של המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית להיות מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה במבחנה עבור רנ"א פלואורוגני אפטאמרים תרד2 12 וברוקולי13 באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה ולקביעת הקינטיקה הדלקתית התאית עבורתרד2 המתבטאת ב-Escherichia coli באמצעות ציטומטר זרימה. שני אפטאמרים אלה של RNA נבחרו מכיוון שהם יושמו כדי לחקור לוקליזציה של RNA 2,3,4, הם שימשו בכתבים 5,6 וביוסנסורים 7,8,9,10,11, וליגנדות הצבע המתאימות (DFHBI או DFHBI-1T) זמינות מסחרית. סיכום של תכונותיהם במבחנה שנקבעו בספרות מובא בטבלה 1 4,13,14, אשר ביססה את התפתחות הפרוטוקול (למשל, אורכי הגל וריכוזי הצבעים שבהם נעשה שימוש). תוצאות אלה מראות כי התגובות הפלואורוגניות המושפעות מאפטאמרים של RNA הן מהירות ואינן אמורות לעכב מדידות מדויקות עבור היישומים הביולוגיים הרצויים של התא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>B1A-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18-600-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune 1x Focusing Fluid</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Shutdown Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Performance Tracking Beads</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4449754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Wash Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>&#160;J24974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Bleach</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6FJR8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well plate</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF86610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (anhydrous)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-tip micropipettor tips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate reader with heating control</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10014-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>EC3000XL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen AM95010</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM95010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analysis software from Academic Group License&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159Z11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1643-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MFCD00011110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with temperature control</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water filter with BioPak unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow micropipettor pipette tips</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>RN005R-LRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean-up kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers and templates</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for 0.5 mL tubes</td>
			<td>Techne</td>
			<td>5PRIME/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET31b-T7-Spinach2 Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #79783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>VGC-1508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis equipment</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>ASG-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>38-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short wave UV light source</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11758221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S375-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>09-741-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea-PAGE Gel system&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV fluorescent TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05789.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>2215415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract (Granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers

אפטאמרים פלואורוגניים של RNA יושמו בתאים חיים כדי לתייג ולהמחיש רנ"א, לדווח על ביטוי גנים ולהפעיל ביוסנסורים פלואורסצנטיים המזהים רמות של מטבוליטים ומולקולות איתות. על מנת לחקור את השינויים הדינמיים בכל אחת מהמערכות הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך דיוק המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית שתהיה מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה החוץ-גופית והתאית עבור אפטאמרים פלואורוגניים של RNA באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה וציטומטר זרימה, בהתאמה. אנו מראים כי ניתן למדל את הקינטיקה במבחנה עבור הפעלת הפלואורסצנציה של האפטמרים תרד2 וברוקולי כתגובות אסוציאציה דו-פאזיות ויש להם קבועי קצב פאזה מהירים שונים של 0.56 s−1 ו- 0.35 s−1, בהתאמה. בנוסף, אנו מראים כי הקינטיקה התאית להפעלת פלואורסצנטיות של תרד2 ב-Escherichia coli, המוגבלת עוד יותר על ידי דיפוזיית צבע לחיידקים גראם-שליליים, עדיין מהירה מספיק כדי לאפשר תדירות דגימה מדויקת על ציר הזמן הדק. שיטות אלה לניתוח קינטיקה של הפעלת פלואורסצנציה ישימות לאפטמרים פלואורוגניים אחרים של RNA שפותחו.

קינטיקה במבחנה הרצפים של תבניות הדנ"א והפריימרים, שנרכשו כאוליגונוקלאוטידים סינתטיים, מוצגים בטבלה 2, ומתכוני הריאגנטים מוצגים בקובץ משלים 1. הגברת PCR משמשת להגדלת כמות תבנית הדנ"א באמצעות מקדם T7, הנדרש לתגובת השעתוק במבחנה (IVT) הבאה. בנוסף, נ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

הפרוטוקול מציג שתי שיטות לקביעת הקינטיקה של הרנ"א הפלואורוגני אפטאמרים תרד2 וברוקולי. השיטה הראשונה מתארת כיצד למדוד קינטיקה פלואורוגנית של אפטמר במבחנה באמצעות קורא צלחת, ואילו השיטה השנייה מפרטת את מדידת הקינטיקה הפלואורוגנית של אפטמר בתאים על ידי ציטומטריה של זרימה.

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

מחקר במבחנה וקינטיקה פלואורוגנית תאית מאפשר למשתמש להעריך אם אינטראקציות צבע אפטמר מהירות מספיק כדי לחקור תהליך של עניין בזמן אמת. הטכניקות המוצגות מאפשרות מדידות קינטיות כמותיות בתוך התא ומחוצה לו, שכל אחת מהן יכולה להיות רלוונטית בהתאם ליישום של האפאמר. השיטות המוצגות יכולות להיות מיושמות על כל מערכת RNA פלואורוגנית, כולל אפטמרים חלופיים וביוסנסורים מבוססי RNA עבור מולקולות קטנות.כדי להתחיל, הגדר את תוכנית רנטורציה RNA מהתרמוציקלר. צור את התוכנית על ידי בחירה באפשרות צור תוכנית חדשה "הוסף שלב חדש" והוסף שלב חדש"מספר פעמים כדי להוסיף שלבים ספציפיים לטמפרטורה לפני לחיצה על שמור"התאם הגדרות נוספות בהתאם לתוכנית. כדי לחדש את התרד 2 ואת ה-RNA של ברוקולי, הכינו שני גבעולי מיקרומולר של כל רנ"א במים מזוקקים כפולים בצינור PCR דק של 0.5 מיליליטר.לאחר מכן הוסיפו נפחים שווים של מאגר רנטורציה של שני x כדי ליצור תמיסת RNA מיקרומולרית אחת. הכניסו את הצינורות לתוך התרמו-ציקלר. פתח את תוכנית הרנטורציה שנשמרה ולחץ על הפעלה"הבא, הגדר את תוכנית מזרק קורא הצלחות.בקורא הלוחות הפלואורסצנטיים, בחר טמפרטורה" והגדר אותה ל-37 מעלות צלזיוס. לפני תחילת הקינטיקה, ודא שהטמפרטורה התאזן לערך זה. פתח את תוכנת קורא הלוחות.בחר הגדרות"ולאחר מכן תצוגת רכישה"כדי להזין את התוכנית למדידות קינטיות, בחר לולאה"עבור כל באר. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הבסיס ל-60 קריאות בסיסיות והגדרות הזרקה חכמה להזרקה של 10 מיקרוליטר. הגדר את אורך גל העירור הפלואורסצנטי ל-448 ננומטר, את אורך גל הפליטה ל-506 ננומטר ואת המחסנית למונו.הגדר את זמן הקריאה הכולל ל- 10 דקות עם מרווח קריאה של 0.5 שניות. הגדר את PMT ואת האופטיקה לשישה הבזקים לכל קריאה. לאחר מכן לולאת קלט לבאר הבאה.כדי להכין את מזרק קורא הצלחות בחר להזריק "על קורא הלוחות" ולספק צלחת איסוף פסולת כאשר מכוון. לאחר מכן בחר לשטוף" ונקה את צינור ההזרקה לפי ההוראות בקורא הצלחת עם נפח מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים, 75% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים. לאחר מכן בחר שאף"המאפשר למזרק להוציא נוזלים עודפים.לאחר מכן בחר פריים" כדי להקדים את המזרק עם שני 260 מיקרוליטרים של 100 מיקרומולר D F H B I.To לבצע ניסוי קינטיקה אחד להוסיף 80 מיקרוליטר של תערובת מאסטר חיץ מחייב לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA renatured. אפשרו לצלחת ולתמיסת D F H B I במזרק, להגיע לשיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר מכן, בחר את הבאר לניתוח בהגדרות התוכנה תחת אזור הקריאה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה בית, בחר הפעל"כדי להפעיל את תוכנית הקינטיקה שתוארה קודם לכן. חזור על תהליך זה עד להשלמת כל הניסויים.לאחר הריצה, יש לשטוף את המזרק כדי להסיר את התמיסה הנותרת D F H B I מצינור ההזרקה כפי שהודגם קודם לכן. כדי להגדיר את הקבצים הניסיוניים הפעל את ציטומטר הזרימה ואת המחשב. צור קובץ חדש בכרטיסייה סייר הניסויים על ידי לחיצה ימנית על שם המשתמש של ציטומטר הזרימה.לאחר מכן בחר ניסוי חדש"בחלון הנפתח וכאשר חלון חדש במסך המחשב צץ, בחר סוג ניסוי כצינורות"ולאחר מכן בחר בסדר"בקובץ הניסוי החדש לחץ לחיצה ימנית על תיקיית הקבוצה ובחר הוסף צינור דגימה חדש"תייג את צינורות הדגימה עבור כל נקודת זמן ספציפית ושכפל על ידי לחיצה ימנית על הדגימה"ובחירה שינוי שם" בתפריט הנפתח. לאחר מכן, הכן תמיסת תאים מדוללת על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של X P B S אחד ושלושה מיקרוליטרים של תאים מושרים במדיית AI בצינור תרבית. לפני הוספת צבע, מדוד את פלואורסצנטיות הרקע של התאים כדי לראות את הקפל מופעל לאורך זמן.לאחר הוספת הצבע מניחים את צינור התרבית המכיל תאים ב- P B S לתוך מרים צינור הדגימה ומעלים את המרים למחט הזרקת הדגימה. לאחר מכן בחר את קובץ הדגימה המתאים בכרטיסיית לוח האיסוף ולחץ על הקלט "לאחר השלמת הריצה הורד את מרים צינור הדגימה עם צינור התרבית ביד. כדי ליזום שלב שטיפה, כדי לשטוף את המערכת הנוזלית, ולמזער את הנשיאה בין כל דגימת שכפול ביולוגית.כדי לעבור לדוגמה הבאה, בחר את הקובץ לדוגמה הבא על-ידי לחיצה על סמל החץ ימינה ליד שם צינור הדגימה מתחת לסמל הרשומה. כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של תאים עם צבע להוסיף 1.4 מיקרוליטר של מלאי צבע מרוכז לתוך אחד X P B S עם תאים, כדי לתת ריכוז סופי של 50 micromolar D F H B I אחד T.לאבטח את מכסה צינור התרבית ולהפוך שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב את התמיסה באופן שווה. לאחר מכן, הסר את המכסה והנח את צינור התרבית לתוך מרים צינור הדגימה.לאחר הרמת המחזיק למחט הזרקת הדגימה, לחץ על סמל הרשומה מתחת לקובץ הדגימה המתאים. לאחר מכן, התחל טיימר על ידי לחיצה על start"In vitro kinetics של תרד אפטמרס פלואורוגני 2 וברוקולי, הציג קינטיקה אסוציאציה דו פאזית לקשירת צבע D F H B I. עבור שני האפטמרים, נתוני הקינטיקה הותאמו טוב יותר על ידי אסוציאציה דו-פאזית מאשר חד-פאזית בזמני מדידה ארוכים.עקומת ההתאמה הטובה ביותר קבעה את קבועי הקצב ואת ערכי מחצית החיים עבור האסוציאציות המהירות והאיטיות. תרד שני במצב כשירות הכריכה, הראה הפעלה מהירה יותר מאשר ברוקולי. הקינטיקה של השלב השני עבור שני האפטמרים דומה ועשויה להתאים לשלב משותף המגביל את הקצב.העקומות הקינטיות של האפטמרים מורכבות ממידה דומה של רנ"א המקשר במהירות. עבור תאים המבטאים תרד שני T RNA, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת או M F I עולה מיד בנקודת זמן אפסית. יתר על כן, הפלואורסצנטיות התאית הגיעה לערך M F I המקסימלי שלה תוך חמש דקות.לעומת זאת, תאי בקרה הראו פלואורסצנטיות נמוכה ברקע וללא שינוי בערכי M F I עם תוספת D M S O השיטות המוצגות מאפשרות לחוקרים לקבוע כיצד הם יכולים ליצור חיישנים מבוססי RNA באפטמרים פלואורוגניים מהר יותר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...