Name: determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

この作業は、MCHへの次の助成金によってサポートされました:NSF-BSF 1815508およびNIH R01 GM124589。MRMは、トレーニング助成金NIH T32 GM122740によって部分的にサポートされました。

1. インビトロ 動態実験
<ol><li>PCRによるDNAテンプレートの調製<ol><li>PCR反応のセットアップ:PCR反応を準備するには、薄肉PCRチューブで次の試薬を混ぜ合わせます。 33 μL の二重蒸留水 (ddH2O) 10 μLの5xバッファー(ハイフィデリティDNAポリメラーゼ用) デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)2 mM各5 μL 0.5 μL 40 μM フォワードプライマー 0.5 μL の 40 μM リバー?...

<ol>
	<li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells.">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time.">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li><li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA.">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li><li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li><li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter.">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li><li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway.">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li><li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP.">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).</li><li>Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA.">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194 (2012).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide.">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li><li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients.">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li><li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs.">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li><li>Szatm&#225;ri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies.">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002 (2020).</li><li>Boulos, L., Pr&#233;vost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIVE/DEAD&#174;+BacLightTM:+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water.">LIVE/DEAD&#174; BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore.">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li><li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers.">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li><li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging.">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging.">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li><li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach.">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356 (2021).</li></ol>

インビトロ動態実験のために、同じ一般的なプロトコルを変更して、リガンド結合ドメインとフルオロフォア結合ドメインの両方を含むRNAベースの蛍光バイオセンサーのインビトロ動態を測定することができます8。 この場合、リガンド応答速度論を得るために、リガンドを注入する際の測定前にRNAを蛍光色素とともにインキュベートする必要があります。反?...

蛍光発生反応は、蛍光シグナルを生成する化学反応です。蛍光発生RNAアプタマーは通常、低分子色素を結合させて蛍光量子収率を高めることでこの機能を果たします(図1A)1。異なる蛍光発生RNAアプタマーシステムが開発されており、特定のRNAアプタマー配列および対応する色素リガンドからなる1。蛍光発生RNAアプタマーは、mRNAおよびノンコーディングRNAの生細胞イメージングを可能にする蛍光タグとしてRNA転写物に付加されています2,3,4。それらはまた、レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用と同様に、遺伝子発現の蛍光レポーターとしてプロモーター配列の後に配置されていますが、報告機能はRNAレベル5,6です。最後に、蛍光発生RNAアプタマーは、特定の低分子に応答して蛍光発生反応を引き起こすように設計されたRNAベースの蛍光バイオセンサーに組み込まれています。RNAベースの蛍光バイオセンサーは、様々な非蛍光代謝物およびシグナル伝達分子の生細胞イメージングのために開発されている7、8、9、10、11。
RNAの局在、遺伝子発現、および低分子シグナルの動的な変化を可視化するための蛍光発生RNAアプタマーの開発への関心が高まっています。これらの各アプリケーションでは、リアルタイムの測定値を取得することが望ましいですが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存します。ここでは、試料注入器を備えたプレートリーダーを用いて蛍光発生RNAアプタマーSmallach2 12およびBroccoli13のin vitro動態を決定する方法と、フローサイトメーターを使用して大腸菌で発現するSpinach2の細胞ターンオン動態を決定する方法について説明します。これら2つのRNAアプタマーが選ばれたのは、RNA局在2,3,4の研究に適用されており、レポーター5,6およびバイオセンサー7,8,9,10,11で使用されており、対応する色素リガンド(DFHBIまたはDFHBI-1T)が市販されているためです。文献で決定されたそれらのインビトロ特性の要約は、表14、13、14に与えられ、これはプロトコール開発(例えば、使用される波長および色素濃度)を知らせた。これらの結果は、RNAアプタマーの影響を受ける蛍光発生反応が迅速であり、目的の細胞生物学的用途の正確な測定を妨げるべきではないことを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>B1A-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18-600-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune 1x Focusing Fluid</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Shutdown Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Performance Tracking Beads</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4449754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Wash Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>&#160;J24974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Bleach</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6FJR8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well plate</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF86610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (anhydrous)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-tip micropipettor tips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate reader with heating control</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10014-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>EC3000XL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen AM95010</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM95010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analysis software from Academic Group License&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159Z11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1643-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MFCD00011110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with temperature control</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water filter with BioPak unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow micropipettor pipette tips</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>RN005R-LRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean-up kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers and templates</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for 0.5 mL tubes</td>
			<td>Techne</td>
			<td>5PRIME/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET31b-T7-Spinach2 Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #79783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>VGC-1508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis equipment</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>ASG-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>38-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short wave UV light source</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11758221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S375-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>09-741-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea-PAGE Gel system&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV fluorescent TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05789.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>2215415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract (Granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers

蛍光発生RNAアプタマーは、RNAのタグ付けと視覚化、遺伝子発現の報告、代謝物やシグナル伝達分子のレベルを検出する蛍光バイオセンサーの活性化のために生細胞に適用されています。これらの各システムの動的変化を研究するためには、リアルタイムの測定値を得ることが望ましいが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存する。ここでは、試料注入器とフローサイトメーターを備えたプレートリーダーを使用して、蛍光発生RNAアプタマーのin vitroおよび細胞のターンオン速度を決定する方法について説明します。ホウレンソウ2とブロッコリーのアプタマーの蛍光活性化のin vitro動態は、二相会合反応としてモデル化でき、それぞれ0.56 s-1と0.35 s-1の異なる高速相速度定数を持つことを示しています。さらに、グラム陰性菌への色素拡散によってさらに制限される大腸菌におけるホウレンソウ2の蛍光活性化の細胞動態は、微小なタイムスケールで正確なサンプリング周波数を可能にするのに十分迅速であることを示しています。蛍光活性化速度論を解析するこれらの方法は、開発されている他の蛍光発生RNAアプタマーに適用可能である。

インビトロ 動態 合成オリゴヌクレオチドとして購入したDNAテンプレートとプライマーの配列を 表2 に、試薬レシピを 補足ファイル1に示します。PCR増幅は、その後の in vitro 転写(IVT)反応に必要なT7プロモーターによるDNAテンプレートの量をスケールアップするために使用されます。さらに、PCR増幅は、プライマー伸長による?...

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Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

このプロトコルは、蛍光発生RNAアプタマーであるホウレンソウ2とブロッコリーの動態を決定するための2つの方法を提示します。最初の方法では、プレートリーダーを使用してin vitro で蛍光発生アプタマー動態を測定する方法を説明し、2番目の方法では、フローサイトメトリーによる細胞内の蛍光発生アプタマー動態の測定を詳述します。

蛍光発生RNAアプタマーの in vitro および細胞ターンオン動態の決定

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

in vitroおよび細胞の蛍光発生アプタマー動態を研究することで、ユーザーはアプタマー色素の相互作用が関心のあるプロセスをリアルタイムで研究するのに十分な速さであるかどうかを評価することができます。提示された技術は、細胞の内側と外側の両方で定量的な速度論的測定を可能にし、どちらもアプタマーの用途に応じて関連する可能性があります。提示された方法は、代替アプタマーや低分子用のRNAベースのバイオセンサーなど、あらゆる蛍光発生RNAシステムに適用できます。まず、サーモサイクラーからRNA再生プログラムを設定します。選択してプログラムを作成します 新しいプログラムを作成する「新しいフェーズを追加」と新しいステップを追加「保存を押す前に温度固有のステップを複数回追加します」プログラムに応じて追加の設定を調整します。ホウレンソウ2本とブロッコリーRNAを再生するには、0.5ミリリットルの薄肉PCRチューブ内の二重蒸留水中で各RNAの2つのマイクロモル茎を準備します。次に、等量の2-x再生バッファーを加えて、1マイクロモルRNA溶液を作ります。チューブをサーモサイクラーに入れます。保存した再生プログラムを開き、実行を押します「次に、プレートリーダーインジェクタープログラムを設定します。蛍光プレートリーダーで、温度を選択します」摂氏37度に設定します。キネティクスを開始する前に、温度がこの値に平衡化されていることを確認してください。プレートリーダーソフトウェアを開きます。設定を選択「次に取得ビュー」速度論的測定のプログラムを入力するには、各ウェルのループ「を選択します。次に、ベースライン設定を60ベースライン読み取りに設定し、スマートインジェクション設定を10マイクロリットルの注入に設定します。蛍光読み取り励起波長を448ナノメートル、発光波長を506ナノメートル、カートリッジをモノラルに設定します。合計読み取り時間を 10 分に設定し、読み取り間隔を 0.5 秒に設定します。PMTと光学系を読み取りごとに6回の点滅に設定します。次に、次のウェルへのループを入力します。プレートリーダーインジェクターを準備するには、プレートリーダーで「注入」を選択し、指示されたときに廃棄物収集プレートを供給します。次に、洗浄を選択し、プレートリーダーの指示に従って、1ミリリットルの二重蒸留水、75%エタノール、次に蒸留水で注入チューブを洗浄します。次に吸引を選択します「インジェクターが余分な液体を排出できるようにします。次に、「prime」を選択して、2つの260マイクロリットルの100マイクロモルDFH Bでインジェクターをプライミング I.To、80マイクロリットルの結合バッファーマスターミックスを96ウェルクリアボトムプレートの1ウェルに追加して1回のキネティクス実験を実行します。次に、10マイクロリットルの変性RNAを追加します。インジェクター内のプレートとD F H B I溶液を摂氏37度に15分間平衡化させます。次に、読み取り領域の下のソフトウェア設定で分析するウェルを選択します。次に、[ホーム]タブで、[実行]を選択して、前述のキネティクスプログラムを実行します。すべての実験が完了するまで、このプロセスを繰り返します。実行後、インジェクターを洗浄して、前に示したように、残りのD F H B I溶液を注入チューブから取り除きます。実験ファイルを設定するには、フローサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。実験エクスプローラータブ内でフローサイトメーターを右クリックして新しいファイルを作成します"ユーザー名.次に、ドロップダウンウィンドウで新しい実験を選択し、コンピューター画面の新しいウィンドウが表示されたら、実験タイプをチューブとして選択します」そして、[OK]を選択します新しい実験ファイルで、グループフォルダーを右クリックして、[新しいサンプルチューブの追加]を選択します「特定の時点ごとにサンプルチューブにラベルを付け、サンプルを右クリックして複製します」ドロップダウンメニューで[名前の変更]を選択します。次に、1つのXPB Sと3マイクロリットルの誘導細胞をAI培地に添加して希釈した細胞溶液を培養チューブに調製した。色素を添加する前に、細胞のバックグラウンド蛍光を測定して、時間の経過に伴う折り目がオンになるのを観察します。色素を添加したら、PBSの細胞を含む培養チューブをサンプルチューブリフターに入れ、リフターをサンプル注入針に持ち上げます。次に、収集パネルタブで適切なサンプルファイルを選択し、[記録]をクリックします「実行が完了したら、培養チューブでサンプルチューブリフターを手で下げます。すすぎステップを開始し、流体システムをフラッシュし、各生物学的複製サンプル間のキャリーオーバーを最小限に抑えます。次のサンプルに移動するには、レコードアイコンの下にあるサンプルチューブ名の近くにある右矢印アイコンをクリックして、次のサンプルファイルを選択します。色素を含む細胞の蛍光を測定するには、1.4マイクロリットルの濃縮色素ストックを細胞を含む1つのXPB Sに加え、最終濃度50マイクロモルのD F H B I 1 T.培養チューブの蓋を固定し、3〜5回反転させて溶液を均一に混合します。次に、蓋を外し、培養チューブをサンプルチューブリフターに入れます。ホルダーをサンプル注入針に上げた後、適切なサンプルファイルの下にあるレコード」アイコンをクリックします。次いで、startを押してタイマーを開始し、「ホウレンソウ2種とブロッコリーの蛍光発生アプタマーのインビトロ動態、DFHBi色素への結合に対する二相会合動態を表示した。両方のアプタマーについて、速度論データは、長い測定時間で一相よりも二相会合によってよりよく適合した。最良適合曲線は、高速関連と低速関連の速度定数と半減期値を決定しました。結合能力状態のホウレンソウ2種は、ブロッコリーよりも速いターンオンを示した。両方のアプタマーについての第2相動態は類似しており、共通の律速段階に対応し得る。アプタマー速度論曲線は、同程度の高速会合RNAで構成されています。ホウレンソウ2種のT RNAを発現する細胞の場合、平均蛍光強度またはMFIはゼロ時点で直ちに増加する。さらに、細胞蛍光は5分以内にその最大平衡化MFI値に達した。対照的に、対照細胞はバックグラウンド蛍光が低く、DMS O添加によるMFI値の変化は見られませんでした 提示された方法により、研究者は、蛍光発生アプタマーのRNAベースのセンサーをより迅速に作成する方法を決定できます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...